重組抗hgf/dll4雙特異性抗體、其制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物技術領域，更具體地，本發明公開了一種重組雙特異性抗體、其制 備方法和其在抗實體瘤上的作用。
【背景技術】
[0002] 惡性腫瘤是人類疾病致死的一大原因，近年來由于環境惡化，生活壓力大等原因， 惡性腫瘤在我國的發病率更是年年攀升。惡性腫瘤的治療手段目前仍主要為放療、化療和 手術治療，治療效果并不理想。隨著單克隆抗體技術的興起，利用抗體進行生物靶向治療由 于其毒副作用小，有望特異性完全清除癌細胞等其他技術無可比擬的優點，展示了很大的 發展空間。但是由于腫瘤異質性大，尤其不同種類的腫瘤其腫瘤表面抗原也大不相同，開發 廣譜的抗腫瘤抗體極具挑戰。
[0003] 實體瘤的惡化與轉移依賴于新生血管的形成。控制血管新生在阻斷腫瘤細胞轉移 的同時切斷對已發生癌組織的血液供給，從而剝奪腫瘤生長依賴的氧氣和營養，進而殺滅 腫瘤細胞。目前市場上通過這一機制作用的抗體阿瓦斯汀（Bevacizumab, Avastin)取得了 巨大成功，已連續多年成為"超級重磅炸彈"藥品，2012年位列全球藥物銷售第八名。阿瓦 斯汀通過抑制血管內皮細胞生長因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF)而阻 止新生血管的形成。因此，開發針對新靶點的抗腫瘤血管新生的抗體藥物將能產生巨大的 社會效益和經濟效益。
[0004] 原癌基因受體酪氨酸激酶C-MET被發現在很多癌組織中過量表達，其與配體肝細 胞生長因子（Hepatocyte Growth Factor, HGF)的結合可激活一系列的信號通路，從而促進 腫瘤細胞的生長、增殖、入侵和凋亡抑制。研究表明，HGF-cMet信號通路通過誘導VEGF的上 調并抑制血管生成抑制因子-凝血酶敏感蛋白I (thrombospondinl，TSP-1)的表達，極 大地促進了腫瘤的血管新生[Zhang YW 等，PNAS2003, 100:12718-12723]。另外，HGF-cMet 信號可上調Notch蛋白配體-Delta樣配體4 (Delta-like ligancM，DLL4)的表達，從 而激活 Notch-DLL4 信號通路[Gao YF 等，Chin Med J.2011，124:127-131]，而 DLL4/Notch 在脈管系統發育的不同階段均有表達，其對血管的發生發展有重要的調控作用。研究表明， 在血管生成過程中，VEGF可通過誘導DLL4的表達來抑制血管上皮細胞的過度增生，阻斷 Notch-DLL4信號通路，可促進內皮萌芽、增加血管密度、產生大量無功能血管。在MV-522 異種腫瘤移植模型中，對VEGF和DLL4的同時阻斷可大大抑制腫瘤生長[Ridgway J等， Nature. 2006, 444:1083-1087]。
[0005] 腫瘤干細胞（Cancer Stem Cell，CSC)是一種具有自我復制和分化成多種功能細 胞能力的腫瘤細胞，在多種腫瘤類型中均證實了 CSC的存在，CSC介導了腫瘤的起始形成， 治療抗性和轉移后新型腫瘤的產生。有研究表明HGF-c-MET和Notch-DLL4信號均在腫瘤 干細胞的干性維持中發揮重要作用[Levina V等，PLos 0ne.2008,3:e3077;Gurney A等， Vascular Cell. 2011，3:18]，HGF通過誘導并激活Notch-DLL4信號通路而參與其中。特 異阻斷HGF-c-MET和Notch-DLL4信號通路將可以在抑制腫瘤血管新生的同時，亦能直接 殺傷腫瘤干細胞或誘導腫瘤干細胞的凋亡和分化，從而徹底瓦解腫瘤組織。目前，AVEO公 司針對HGF已開發了一種抗HGF抗體（Ficlatuzumab)用于治療非小細胞肺癌，另外，針對 Notch-DLL4信號通路也已有人開發了一種抗DLL4抗體（Enoticumab),但上述抗體均是單 克隆抗，單一抗體只能抑制HGF-c-MET或Notch-DLL4單一信號通路。若將抗HGF抗體和抗 DLL4抗體聯合應用，在理論上可同時阻斷HGF-c-MET和Notch-DLL4信號通路，進一步提高 抗腫瘤治療效果。但是，單抗聯合應用存在調節障礙和造價太高的缺陷，限制了其臨床應 用。
[0006] 因此，構建一個既能阻斷HGF，又能阻斷DLL4的雙特性抗體，進而更有效的抑制腫 瘤生長，一直是本領域的技術人員急待解決的問題。

【發明內容】

[0007] 為了解決上述問題，本發明的發明人進行了大量試驗，得到了一個可以同時阻斷 HGF和DLL4兩個靶點的雙特異性抗體，即本發明所述的"重組抗HGF/DLL4雙特異性抗體"， 從而完成了本發明。
[0008] 具體地，本發明公開了：
[0009] 1. -種抗HGF/DLL4雙特異性抗體，其特征在于，所述抗體既能與HGF結合，又能與 DLL4結合。
[0010] 2.上述1所述抗HGF/DLL4雙特異性抗體，其特征在于，所述抗體氨基酸序列包含 抗HGF單克隆抗體的可變區和抗DLL4單克隆抗體可變區序列。優選地，所述抗HGF/DLL4雙 特異性抗體重鏈可變區氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，輕鏈可變區氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。
[0011] 3.上述1或2所述抗HGF/DLL4雙特異性，其特征在于，所述雙特異性抗體重鏈氨 基酸序列如SEQ ID NO: 2所示，輕鏈氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
[0012] 4. 一種分離的核酸分子，其編碼上述1-3任一所述的抗HGF/DLL4雙特異性抗體； 優選地，所述核酸分子編碼所述抗HGF/DLL4雙特異性抗體輕鏈的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示,編碼重鏈的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0013] 5. -種表達載體，含有上述4所述的核酸分子和所述核酸分子的序列操作性相連 的表達調控序列；優選地，所述載體可以為pDRl、pcDNA3. I ( + )、pDHFF或pCHOl. 0載體，最 優選為pCHOl. 0載體。
[0014] 6. -種宿主細胞，其含有上述5所述的載體。優選地，所述宿主細胞為哺乳動物細 胞，更優選地，所述宿主細胞為COS、CH0、NSO細胞；最優選地，所述宿主細胞為CHO細胞。
[0015] 7. -種制備上述1-3任一所述的抗HGF/DLL4雙特異性抗體的方法，所述方法包括 步驟：
[0016] a)在表達條件下，培養上述6所述的宿主細胞，從而表達抗HGF/DLL4雙特異性抗 體；
[0017] b)分離或純化所述的抗HGF/DLL4雙特異性抗體。
[0018] 優選地，所述制備方法包括步驟：
[0019] a)構建抗HGF/DLL4雙特異性抗體的輕鏈融合基因、重鏈融合基因；
[0020] b)將上述a)融合基因克隆到真核表達載體pCHOl. 0,構建真核表達載體pCHOl. 0 (anti-HGF/DLL4)；
[0021] c)將上述b)構建的表達載體pCHOl. 0 (anti-HGF/DLL4)轉染CHO細胞，篩選，進 行亞克隆，將篩選得到的高表達克隆用于擴大培養，
[0022] d)分離或純化c)所述抗HGF/DLL4雙特異性抗體。
[0023] 8. -種組合物，含有上述1-3任一所述的抗HGF/DLL4雙特異性抗體和藥學上可接 受的載體。
[0024] 9.上述1-3任一所述的抗HGF/DLL4雙特異性抗體或上述8所述的組合物在制備 抗腫瘤藥物中的用途。
[0025] 10.上述9所述的用途，還包括和其它的抗腫瘤藥物聯合使用。
[0026] 本發明中，任何合適的載體都可以使用，可以為pDRl，pcDNA3. 1 ( + )，pDHFF及 pCH01.0(如附圖2)之一，表達載體中包括連接有合適的轉錄和翻譯調節序列的融合DNA序 列。
[0027] 哺乳動物或昆蟲宿主細胞培養系統可用于本發明，例如COS, CHO, NSO, sf9及