一種人干擾素IFN-α2a與LL-37的融合蛋白的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物工程技術領域
【背景技術】
[0002] 蛋白融合技術，是通過DNA重組技術獲得兩個基因重組后的表達產物。現廣泛用 于新的蛋白藥物或新功能蛋白分子產品的開發。
[0003] 蛋白融合的目的包括：一是使一種分子具有兩種蛋白的功能。例如，將人B7-2分 子與英光蛋白融合表達，使新形成的融合蛋白同時具有B7-2分子的功能和英光蛋白的功 能。二是增加二種蛋白中某一蛋白的穩定性W提高其效率，例如將人干擾素蛋白與人血清 蛋白融合表達，就可W提高干擾在人體內的半衰期。Η是蛋白產物定向的需要。例如將信 號膚序列與目標蛋白融合表達，就可W實現產物的胞外表達。
[0004] 目前干擾素均通過基因工程技術生產。α干擾素在生產和使用過程中存在的主要 問題一是基因工程菌產量低，生產成本高；二是α干擾素分子量小，容易被腎小球濾過，臨 床應用時半期短，約每2天就需要重新用藥一次。對于產量低的問題，目前主要通過優化表 達系統和發酵工藝方面著力。對于半衰期短的問題，目前常采取的方法包括PEG修飾W增 加分子量，掩蓋分子表面的抗原決定簇和蛋白酶作用位點；同人白蛋白或免疫球蛋白Fc片 斷融合增加分子量，減少腎小球濾過；在合適的位置引入糖基化掩蔽蛋白酶位點和增大分 子量等。很多病毒均具有誘發腫瘤的能力，因此同時具有抗病毒與抗腫瘤能力的α干擾在 此類疾病的治療方面作用重要。同時，多數腫瘤患者由于其自身的免疫系統不同程度的受 到破壞，因此，還需特別預防細菌感染。基于臨床需要同時抗菌、抗細菌和抗腫瘤的特點，將 人IFN-α2a與化-37經過按畢赤酵母的密碼子偏好性進行優化，構建高產工程菌，在此基 礎上生產出長效的Η聯干擾素。

【發明內容】

[0005] 1.人α-37與IFN-α2aDNA序列的密碼子優化
[0006] 在保證人化-37與IFN-α2a氨基酸序列完整性的前提下，按照P.pastoris對密 碼子的偏好性特點，對他們的DNA序列進行優化。
[0007] 2重組質粒構建
[0008] 分別用EcoRI和NotI雙酶切PPIC9K和pMD-18FaU-IFN質粒，經凝膠電泳后切 膠分別回收約9300bp利70化P的片斷，用膠回收試劑盒回收片斷，并用T41igase連接，構 建分泌型重組質粒pPIC9K-FaU-IFN，用化C1法轉化大腸桿菌D冊α，利用LB-Amp平板篩 選重組子。挑選陽性轉化子送上海生工進行測序，確定質粒的結構。
[0009] 3重組質粒轉化畢赤酵母
[0010] 用SacI單酶切pPIC9K-Fall-IFN成線性重組質粒，通過電擊轉化法將其轉入 P.pastorisGS115 中構建重組菌P.pastorisGS115LI。電擊條件為 1500kV，200Q，25uF。 轉化液涂布于MD平板3(TC靜止培養3天，挑選陽性克隆，搖瓶后，用真菌基因組提取試劑 盒提取基因組進行PCR鑒定。引物為；SensePl;TTCGCCTTGTTGGGTGACTTCTTC，AntisP2 ;TCACTCCTTAGATCTCAAAGACTC，退火溫度為58°C，WGS115基因組及未加模板的體系為對照 組。
[0011] 4重組菌表型鑒定及多拷貝篩選
[0012] 通過甲醇利用情況進行重組菌表型鑒定。將PCR鑒定的陽性轉化子編號，并將每 菌株用滅菌牙簽同時接種MD和MM平板，3(TC靜止培養5天，觀察各菌株在兩種平板上的生 長情況。
[0013] 通過遺傳霉素（G418)濃度梯度篩選多拷貝重組株。首先制備遺傳霉素質量濃度 為0. 25、0. 5、1. 0、2. 0、3.Omg/mL的YPD平板，然后將前面篩選的表型正常的重組菌株用滅 菌牙簽點在5個遺傳霉素梯度平板上，3(TC靜止培養4天，觀察結果，能在高濃度下生長良 好的菌株為多拷貝菌株。
[0014] 5融合蛋白發酵與純化
[0015] 將篩選的重組菌株，接種于25血BMGY培養液中，30°C250巧m/min培養約16h，至 菌液ODe。。W5,4°C4000巧m/min離必5min，收集菌體，用25血BMMY培養液重懸細胞，誘 導培養，每2地按體積比為0.5%加入純甲醇，連續誘導14地^上，41：12000巧111/111111離必 5min，收集上清于-2(TC凍存待用。
[0016] 上清液中的融合蛋白先用35%飽和度（NH4)2S04鹽析，12000巧m/min離必收集鹽 析沉淀，再將沉淀溶于0.8mol/L(NH4)2S04(P冊.3)，上樣化enパ-S巧haroseFF疏水柱，用 0. 5mol/L(NH4)2S〇4洗脫后透析除鹽，樣品濃縮后再上樣DEAES巧hadexA-25陰離子交換柱， 義用0. 3mol/L化C1洗脫，收集含目的蛋白洗脫峰，濃縮后義用Se地acyal-HR200分子篩脫 鹽，冷凍干燥得最終產品。
[0017] 6IFN-α2a與Lレ37融合蛋白的檢測
[001引 6. 1融合蛋白純度檢測
[0019] 用SDS-PAGE法檢測融合蛋白純度，檢測參照文獻進行。WTakara蛋白分子質量 標準（低）為Marker。W未經誘導的發酵液為空白對照。
[0020] 6. 2融合蛋白濃度檢測
[0021] W牛血清白蛋白為標準，按Low巧法測定融合蛋白濃度。
[0022] 6. 3融合蛋白產物活性分析
[0023] 培養液中IFN-α2a的活性分析參照《中國藥典2010版》中《干擾素效價測定（細 胞病變抑制法）》。活性標準品購自廣州市藥品檢測所。W總IFN-a2a活性計算純化過程 中的回收率。
[0024] 培養液中化-37的活性測定參照文獻17。用大腸桿菌ATCC25922W及ML35p作 為檢測菌種，用雙層瓊脂糖打孔法測定。底層培養基上打直徑3mm的圓孔，每孔加10μL發 酵液，37°C賠化化后，在底層上覆蓋一層營養瓊脂，37°C繼續培養20h，測量無菌生長的透 明環直徑。抗菌活性W下式計算：
[00巧]抗菌活性單位扣）=(抗菌環直徑-3)X10
【附圖說明】
[0026]圖1重組質粒pPIC9K-Fall-IFN構建過程
[0027]圖 2 重組P.pastorisGS115LI與原始菌P.pastorisGS115 基因PCR結果
[0028] 1 道為 200bpmarker, 2、3、4、5 道為P.pastorisGS115LI, 6、7、8 為P.pastoris GS115。
[0029] 圖3經過誘導和未誘導的GSl巧LIl發酵液的SDS-PAGE。
【具體實施方式】
[0030] 下面結合附圖和實施例子對本發明作進一步說明，但本發明并不限于此。
[0031] 1IFN-α2a與α-37的密碼子優化
[0032] 自Genebank中查詢，獲得Homosapiensinterferonal地a2a序列，Sequence ID;gbIJN848522. 1，全長為567序列，按畢赤酵母密碼子偏好性優化后，所得結果見SEQID No. 2。
[0033]自Genebank中查詢的人抗菌膚化-37基因，按畢赤酵母密碼子偏好性優化后，所 得結果見沈QIDNO. 3。
[0034] 2人化-37與IFN-α2a融合重組質粒的構建
[0035] 經過優化的人化-37DNA序列（3'端不帶終止密碼子），通過4個甘氨酸和1個絲 氨酸與IFN-α2a柔性聯結。重組質粒pPIC9K-FaU-IFN的構建過程見圖1。
[0036]將構建的質粒pPIC9K-FaU-IFN轉入化感受態E.coliD冊α，所挑選的陽性轉化 子經搖瓶提取質粒，用EcoRI和Notl雙酶切鑒定得到大小約為9300和690的兩條片斷，與 預期的結構一致。同時將質送樣測序，得到的DNA序列與設計的結果一致。
[0037] 3重組質料pPIC9K-FaU-IFN整合入畢赤酵母GSP115
[0038] 重組菌P.pastorisGS115LI與原始菌P.pastorisGS115基因PCR結果電泳圖見 圖2。
[0039] 重組酵母基因組可擴增得到大小約為69化P的條帶，而空白的原始菌株GS115卻 在相應位置未出現相應的條帶，送表明重組質粒pPIC9K-FaU-IFN成功整合進入了酵母的 基因組中，所獲得的重組菌P.pastorisGS115LI與預期結果一致。
[0040] 4篩選Mut+及多拷貝編碼基因重組菌
[0041]P.pastorisGS115為組氨酸缺陷型化is)，因此不能在不含組氨酸的MD平板上生 長。整合了含組氨酸編碼基因化is4)質粒pPIC9K-FaU-IFN的菌株P.pastorisGS115LI， 由于獲得了組氨酸的合成能力，因此可W在不含組氨酸的MD平板上正常生長，W此證明重 組菌株P.pastorisGS115LI可W正確的表達質粒pPIC9K-FaU-IFN的轉錄單元。實驗結 果表明，前述實驗所篩選出來的陽性克隆pPIC9K-FaU-IFN均可W在MD平板上正常生長， 表明他們都具有正確的表型（Mut)。
[0042] 通常情況下，重組菌株中質粒pPIC9K-FaU-IFN的拷貝數越高，其表達目的產物 的能力就越強，同時對遺傳霉素G418的抗性就越強。因此，通過遺傳霉素濃度梯度篩選出 在高濃度下生長的菌株，即表明其具有較高的拷貝數。本實驗得到了在遺傳霉素為3mg/mL 濃度下能正常生長的重組菌二株，分別命名為GS11化II和GS115LI2,W供后續實驗。
[0043] 5表達產物IFN-α2a與化-37融合蛋白的分子檢測
[0044] 表達產物IFN-a2a與化-37融合蛋白的分子檢測結果見圖3。
[0045] 從圖中可W看出，在蛋白Marker的20. 1至29kDa之間，如圖中箭頭所示，誘導的 具有明顯的條帶，未誘導的在相應位置沒有條帶。α-37與IFN-a2a融合蛋白的分子量 約為26kDa，與圖中預期的一致。因此，可W判斷GS1巧LI1成功表達出了所需的化-37與 IFN-a2a融合蛋白
[0046] 6重組菌株GS115LI產物活性分析
[0047] 融合蛋白的抗病毒活性與抗菌活性測定結果見表1。
[0048] 表1α-37與IFN-α2a融合蛋白抗病毒與抗菌活性檢測
[0049]
[0050] 從表1中可W看出，重組菌GS1巧LI1與GS11化12經誘導后的發酵液中均能檢出 較高的抗病毒和抗菌活性，送說明了融合蛋白保證了二者各自的活性功能。
[0051] 7融合蛋白純化結果
[0052] 融合蛋白的純化結果見表2。
[0053] 表2α-37與IFN-α2a融合蛋白純化過程中的純度與回收率
[0054]
[0055] 從表中可W看出，在化-37與IFN-a2a融合蛋白純化過程中過程中，總的回收率 為46. 2%，其中疏水層析的損失最大，達到20. 2%，其次為鹽析損失19. 0,陰離子交換層析 損失14. 6%。最終廣品的純度達到97%,滿足了醫用廣品的質量柄準。利用Lowry法檢 測分子篩脫鹽后的溶液融合蛋白總量（相當于牛血清白蛋白）為378. 4mg，換算成產品的 IFN-α2a活性為2. 6X108IU/mg，發酵液中產物的產量為819.Img/L。
【主權項】
1. 一種人干擾素IFN-a2a與LL-37的融合蛋白，其是： a) 具有與SEQIDNo. 1的1-232位氨酸序列所示的肽鏈，或 b) 在SEQIDNo. 1基礎上通過缺失、突變、重組獲得的具有人干擾素IFN-a2a與LL-37 活性的多肽。2. 權利要求1的IFN-α2a與LL-37的融合蛋白，由人IFN-α2a通過接頭 GlyGlyGlyGlySer與LL-37 相連。3. 權利要求1的IFN-α2a來源于人，并按畢赤酵母的密碼子偏好性改造而成。4. 權利要求1的LL-37來源于人，并按畢赤酵母的密碼子偏好性改造而成。5. 權利要求1的IFN-α2a與LL-37的融合蛋白同時具有IFN-α2a的抗病毒活性與 LL-37的抗菌活性。6. 權利要求1的IFN-α2a與LL-37的融合蛋白可通過基因工程重組的畢赤酵母表達， 并通過鹽析、疏水層析和陰離子交換得到。
【專利摘要】本發明公開了人干擾素IFN-α2a與人抗菌肽LL-37的基因改造、融合表達與純化。所獲得的IFN-α2a與LL-37融合蛋白同時具有IFN-α2a的抗病毒活性和LL-37的抗菌活性。
【IPC分類】C12N15/81, C07K19/00, C12R1/84
【公開號】CN105330747
【申請號】CN201410399682
【發明人】萬徐萍
【申請人】廣東紫金正天藥業有限公司
【公開日】2016年2月17日
【申請日】2014年8月14日