專利名稱：神經受體的重組體刺激因子的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種新穎的，非天然存在而是以重組DNA法產生的多肽，它與該神經受體相配合，并對其進行刺激，而且調節細胞的增殖和分化。本發明還涉及該多肽的類似物和衍生物，以及涉及對該多肽、類似物及衍生物編碼的DNA序列。
細胞的生長及分化部份地是由多肽分子傳送的細胞外信號調節的(Aaronson，S.A.，Science 2541146-1152，1991)。這些因子和特定的細胞表面受體間的相互作用起動了一個在調節基因表達和DNA復制的原子核轉變中達到頂點的生物化學級聯(Ullrich，A，and Schlessinger J，Cell 61203-212，1990)。這種細胞調節機制對于在發育過程中確定細胞的演變趨向是有意義的，而且這種機制的破壞則會導致致癌轉變。后者可由生長調節因子的構型產生或由其同源受體改變了型類而誘發(Yarden，Y，and Ullrich，A.，Ann.Rev，Biochem，57443-448，1988)。這類致癌受體屬于橫垮膜糖蛋白族，該類糖蛋白是在其胞質區中具有共同的催化功能，即，酪氨酸-特種蛋白激酶活性(Hanks，S，K.，Cur，Op，Struct，Biol，1364-383，1991)。該神經原始致癌基因(也稱作erbB-2和HER-2)將與表皮生長因子的受體高度相關的酪氨酸激酶編碼(king，C.R.et al.，EMBO J.71647-1651，1988;Coussens，L，et al.，Science 2301132-1139，1985;Bargmann，C.I.et.al.，Cell45649-657，1986;Yamamoto，T.et al.，Nature 319230-234，1986)。該神經受體和EGF-受體在其細胞外區域兩者都具有富半胱氨酸結構，該結構是經過一段氨基酸單一橫垮膜路程連到一個大的，有酶功能的胞質區。該神經受體的致癌潛在危險可通過多種基因機制而釋放出來，這包括在該橫垮膜區域中的點突變(Bargmann et al.，上文)及在胞質區及細胞外區中的非催化序列的平截(DiFiore，P.P.et al.，Science 237178-182，1987;Bargmann，C.I.，and Weinberg，R.A.，EMBO J.72043-2053，1988)。
與人體癌癥致病原因有關的致癌激活的第三種機制包括正常基因明顯的過表達。該神經受體的增強和過表達頻繁地在得自某些組織的人體腺癌中測出(Kraus，M.H.et al.，EMBO J.6605-610，1987)Slamon，D.J.et al.，Sience 235177-182，1987;Varley，J.M.et al.，Oncogene 1423-430，1987;van de Vijver，M.et al.，Mol.Cell Biol，72019-2023，1987)。此外，基因增長和過表達間的結合及臨床結果已以乳癌和卵巢癌進行了報導(Slamon et al.，supra;Varley et al.，supra，Venter，D.J.et al.，Lancet ii67-72，1987，Zhou，D.et al.，Cancer Res.476123-6125，1987;Berger M.S.et al.，Cancer Res 481238-1243，1988;Tsuda，H.et al.，Cancer Res 493104-3108，1989;Slamon D.J.et al.，Science 244707-712，1989)。按照這些惡性腫瘤中包含該神經受體的可能性，在實驗模型中的這種受體的過表達導致了轉變表型的出現(DiFiore et al.，supra;Hudziak，R.M.et al.，Proc.Natl Acad.Sci.USA 847159-7163，1987)。造成過表達神經蛋白的轉變潛勢的機理尚不知道，但它可能與缺乏配位體的內在酪氨酸激酶的組成活性有關(Lonardo，F.et al.，New Biol.2992-1003，1990)。
該神經受體及EGF-受體的同時過表達協同地使侵蝕性成纖維細胞轉變(Kokai，Y.et al.，Cell 58287-292，1989)，這已在人的癌癥中被觀察到(Harris，A.L.et al.，Molecular Diagnostics of Human Cancer，Volume 7，edited by Furth，M.，and Grreaves，M.，Cold Spring Harbor Press，New York，1989;Gullick，M.，J.，Int.J.Cancer Suppl，5，pp.55-61，1990)。這兩種受體間的協同作用可能是由EGF-受體對該神經受體的轉調節作用所媒介的，這包括增加后者的酪氨酸磷酸化(Stern，D.J.，and kamps，M.P.，EMBO J.7995-1001，1988;King C.R.et al.，EMBO J.71647-1651，1988;Kokai，Y.et al.，Proc.Natl.Acad Sci.USA 855389-5393，1988)。從機理上說，這類相互作用都是以EGF-受體和該神經受體的雜二聚為媒介的(Goldman，R.et al.，Biochemistry 2911024-11028，1990;Wada T.，et al.，Cell 611339-1347，1990)。這些觀察提高了該神經受體可由屬于EGF-受體亞族的其它受體酪氨酸激酶(比如erbB-3蛋白)調節的可能性(Kraus，M.H.et al.，Proc.Natl.Acad，Sci.USA 869193-9197，1989;Plowman，G.D.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.874905-4909，1990)。
與已知的具有共有一個EGF-類型(motif)的多個配位體分子的EGF-受體(Carpenter，G.，and Cohen，S.，J.Biol.Chem.2657709-7712，1990)相反，一種直接與該神經受體相互作用的配位體此前尚未被描述。在ras-轉變的成纖維細胞培養基中存有候選神經配位體已見報導(Yarden，Y.，and Weiberg，R.A.，Proc，Natl，Acad，Sci.USA 863179-3188，1989)。該因子基于其提高該神經受體對酪氨酸殘基磷酸化能力而從這種來源中被部分提純(Yarden，Y.，and Peles，E.，Biochemistry 303543-3550，1991)。這種活性相應于在色譜分析中相當于30-35千道爾頓蛋白的熱穩定的和含二硫化物的糖蛋白。通過采用不同配位體分析，一種30千道爾頓的糖蛋白已從MDA-MB-231人乳房癌細胞中被分離出來(Lupu，R.et al.，Science 2491552-1555，1990)，而且另一種因子則從轉變的人T細胞培養基中被部分提純(Dobashi，K.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 888582-8586，1991)。
最近，刺激并明顯地與該神經受體結合的因子已從ras-轉變的大鼠成纖維細胞的條件培養基中提純為同種。當檢測人乳房癌細胞時，這種大約為44千道爾頓蛋白的因子能誘發分化而成為成熟的泌乳細胞(Peles，E.et al.，Cell 69205-216，1992)。
本發明提供了一種新的，非天然存在神經受體刺激因子以及被分離的將全部或部分該因子編碼的DNA序列。本發明的因子是一種多肽，該多肽具有復制的天然存在的神經受體刺激因子的氨基酸序列(即，Peles，E.et al.，于Cell 69205-216，1992中所述的多肽)，這足以使該多肽具有該天然存在因子的一種或多種生物活性(即，人體神經刺激受體活性、人乳房腫瘤細胞分化活性、與天然存在神經受體刺激因子對人體受體結合方面的競爭能力等)。
從天然來源中提純的該神經受體刺激因子(也就是本文所稱的“NRSF”)具有刺激人神經原發致癌基因的多肽產物的酪氨酸磷酸化的能力及誘發人乳房腫瘤細胞分化成產乳的、生長被抑制的細胞的能力(Peles E.et al.，Cell supra)。NRSF的生物活性證實了其作為人體細胞生長和分化因子的作用及其在各種治療處置中的潛在用途。本發明的非天然存在的神經受體刺激因子單獨或與其它治療方法結合對治療同一種人體無序與天然存在的神經受體刺激因子一樣有效。
本發明所提供的分離的DNA序列在確保本發明的非天然存在的神經受體刺激因子(“即重組體NRSF”)于原核和/或其核寄主細胞中的表達方面是有效的。本發明專門提供將未經處理的氨基酸序列編碼的DNA序列，以及將NRSF經處理(成熟的)形態編碼的DNA序列。這類DNA序列包括(a)圖4和5中所列的DNA序列(分別為序列標號3和4)以及它們的補充股;
(b)與(a)中所定義的DNA序列或其片段雜交的DNA序列;及(c)與(a)和(b)中所定義的DNA序列雜交DNA序列，但遺傳碼退化的除外。
特別包括在部分(b)和(c)中的是將NRSF的變體形式編碼的cDNA和基因組DNA序列(包括得其它哺乳動物物種的NRSF)，以及將NRSF、NRSF片段及NRSF類似物編碼的制造的DNA序列。該DNA序列可將有利于轉錄和翻譯寄主細胞中的信使RNA的密碼子包括進去。按Alton等人的方法(PCT公開申請WO 83/04053)很容易構建制造的序列。
還提供了含這類DNA序列的載體以及用這類載體轉變或轉染的寄主細胞。另外，本發明包括以重組DNA技術制造NRSF的方法以及用重組體NRSF治療無序的方法。也提供了含重組體NRSF的藥用組合物以用重組體NRSF生長的抗體。


圖1描繪了一幅自以ras-轉變的大鼠成纖維細胞調整的培養基中提純的天然存在的神經受體刺激因子的酪氨酸水解液的高壓液相色譜，它是按上文所述的Peles等人(Cell，見上文))的方法完成的。洗脫面被顯示出來，而得自與各峰相對應的餾份的氨基酸序列用常規單個字母符號標出。括號中的氨基酸代表一個天門冬酰胺連接的糖基化位點，而虛線代表一個較長的，其中氨基酸未被標出的序列。其中插入的圖所示是二硫蘇糖醇還原后的27.3分鐘峰的再色譜分離。
圖2所示是哺乳動物COS-7細胞表達載體ppJT-2/NRSF的結構。大鼠NRSF cDNA插入物是圖5的克隆44cDNA序列(序列標號4)。
圖3證實了重組體NRSF對人神經受體酪氨酸磷酸化的刺激作用。人體MDA-MB-453乳腺癌細胞用一種濃縮條件培養基培育成熟，所述培養基得自用給定的部分提純cDNA克隆(左圖)或用充分提純的cDNA克隆(右圖)轉染的COS-7猴細胞。正對照物包含10ng/ml(左道)和100ng/ml的提純的天然存在的大鼠NRSF。負對照物包含由未轉染COS-7細胞(道的符號為“COS”)，或由以含不相關cDNA的pJT-2質粒轉染的細胞(道標為“克隆27”和“克隆29”)及未作任何添加(“無”)所調整的濃縮培養基。溶菌產物由受刺激的MDA-MB-453細胞制取，并經受SDS-PAGE。被示出的還有帶按千道爾頓(KDa)給定的分子量標記蛋白位置抗磷酸化Western印跡的自動射線照相。在含0.1%BSA總體積為0.125ml PBS中，對于克隆4，19和44分別使用下述體積的COS-7上清液0.01ml-(左側)和0.1ml(右側)。該提純的克隆分析是在含0.2ml細胞上清液的0.25ml總體積或按標定體積中進行的。
圖4(序列標號3)示出了大鼠NRSF cDNA的核苷酸序列及推定的氨基酸序列。四種cDNA克隆的組合核苷酸序列也被描述。克隆44 DNA序列的開端特地用箭頭標出。在左側和右側分別給出了核苷酸數和氨基酸數。N-連接的糖蛋白的潛在位點用星號標出，在推定的細胞外的區中發現的半胱氨酸殘基被圈出。上標線表示直接從提純的天然存在NRSF中確定肽序列。下標線表示潛在的橫跨膜區，而下虛線表示多聚腺苷酸化位點。含免疫壞蛋白(Ig)同系性單元和表皮生長因子(EGF)樣型(motif)的蛋白序列的部份被標在右手側。
圖5(序列標號4)單獨地示出NRSF cDNA克隆44的核苷酸序列及推定的氨基酸序列。核苷酸數標在右手列。
圖6描繪了大鼠神經受體刺激因子前體的水療法圖。采用了Kyte Doolittle(J.Mol.Biol，157105-132(1982))，窗口尺寸為9個氨基酸殘基。正值表示增加疏水性。氨基酸數標在該圖下方。
圖7表示EGF類區域及含有EGF族有代表性成負的大鼠NRSF(序列號5號)的側羰基未端序列的氨基酸序列的線列。劃線和編號始于EGF型的最多氨基未端半胱氨酸殘基處。氨基酸殘基用單字母密碼標出。虛線表示為介入最大型線而留的縫隙。殘基被括起來以表示它們與NRSF的相應的氨基酸相同。下橫線表示假設的橫跨膜區的氨基未端部分，該區在某些EGF型的羰基未端側的側方。星號表示該羰基的端點。將下列蛋白與NRSF比較大鼠轉變生長因子α(TGFα(序列標號6號);Marquardt，H.et al.，Science 2231079-1082，1984));人的對邊條曲菌素(AR(序列標號7);Shoyab，M.et al.，Science 2431074-1076，1989));綿羊纖維瘤病毒生長因子(SFGF(序列標號8);Chang，W.et al.，Mol.Cell.Biol.7535-540 1987);粘液瘤病毒生長因子(MGF(序列標號9);Upton，C.et al.，J.Virol，61.1271-1275，1987);小鼠EGF((序列標號10)，Gray，A.et al.，Nature 303722-725，1983;Scott J.et al.，Science 221236-246，1983);人的肝素結合的EGF(HB-EGF(序列標號11);Higa-Shiyama，S.et al.，Science 251936-939，1991);大鼠神經鞘瘤衍生的生長因子(SDGF(序列標號12);kimura，H.et al.，Nature 348257-260，1990)以及牛痘病毒生長因子(VGF(序列標號13);Blomquist，M.D.et al.，Proc.Natl Acad，Sci.USA817363-7367，1984)。
圖8示出了大鼠NRSF的免疫球蛋白(lg)類區的列線(序列標號14)，該列線帶有鼠的神經細胞粘附分子第4Ig相關序列(序列標號15)(NCAM;Barthels，D.et al.，EMBO.697-914，1987)，一種免疫球蛋白總科的C2一組的有代表性的蛋白。在該C2一組中高度保守的殘基被標在線的下面，而跨越該總科的保守位置是跨線的(根據Williams，A.，and Barclay，A.，Rev.Immunol.6381-405，1988)。可能與β-鏈的形成相關的氨基酸段用濃重的下橫線標出，并且從B標到F，這與免疫球蛋白區相類似。方框表示在NRSF和NCAM中的相同的殘基。虛線(縫隙)是為最大線列而引入的。
圖9是該神經受體刺激因子前體的假設二級結構和膜取向的示意圖。與該免疫球蛋白(Ig)區及表皮生長因子(EGF)型相對應的位置用粗線表示，而其半胱氨酸殘基用圓圈表示。該Ig區的二硫化物鍵用氨基酸序列分析直接證實(實施例1D)，而該EGF區的次級結構是以與該EGF族同源為基礎的。還被示出的是三個在該橫跨膜區中發現的半胱氨酸殘基。箭頭標出在該氨基酸未端(按大鼠NRSF蛋白的N-未端排序)的該前體蛋白的處理位點及靠近該原生質膜處的推定的蛋白水解位點。枝線表示被證實的N-糖基化位點的位置，而短豎線代表O-糖基化的推定位點。
圖10描繪了用放射性同位素示蹤的，自ras-轉變的大鼠成纖維細胞條件培養基中提純的天然存在的神經受體刺激因子(“125Ⅰ-NRSF”所作的受體組成分析。該被示蹤NRSF與人體MDA-MB-453乳房癌細胞在沒有(無)或存有得自表達重組體神經受體刺激因子(“C-NRSF”)或重組體TGFα(“C-TGFα”)的COS-7細胞的條件培養基進行培育。此細胞結合放射性以平均值±S.D.(n＝3)示出。
圖11描繪了另一種受體競爭分析。125Ⅰ-示蹤的天然存在的NRSF與人體MDF-MB-453細胞在沒有(“無”)或存有未示蹤的“冷”天然存在的NRSF(“NRSF”，200ng/ml)，或以由圖2的NRSF表達質粒(“C-NRSF”)，或由TGFα-編碼載體(“C-TGFα”)轉染的COS-7細胞調整培養基進行培育。接著與BS3交聯，該細胞被溶解，并通過采用單克隆抗體使該神經受體蛋白免疫沉淀。聚丙烯酰胺凝膠分離的免疫配合物的自動照相(曝光三天)也被展示。大部分假定的受體二聚物被放射性同位素示蹤。
圖12示出得自Northen印跡的自動照相，所述的印跡是由經培養的細胞中分離出的mRNA印跡(A圖和C圖)，或是新分離的成年大鼠組織的印跡(B圖)，采用的探針是克隆44 NRSF cDNA。在底片曝光3小時(A圖)或24小時(B圖和C圖)后得到該自動照相。分子量以千堿基對來表示。采用得自GIBCOBRL Life Technologies，Inc.(Gaithersburg，MD)的標志分子混合物作分子量估算。
本發明的DNA序列很有價值地用于以各種重組技術大規模合成NRSF。換句話說，本發明所提供的DNA序列在產生新的和有用病毒的及環質粒DNA載體;新的和有效的轉變的和轉染的原核和真核寄主細胞(包括在培養基中生長的細菌和酵母細胞及哺乳動物細胞);以及新的和有用的培育這類能表達NRSF的寄主細胞生長的方法及其相關產物方面是有效的。
本發明的DNA序列還適于用作分離人體cDNA和將NRSF編碼的染色體DNA以及將相關蛋白編碼的其它基因(這包括其它哺乳動物種的cDNA和染色體DNA序列)的探針材料。DNA序列在各種可選擇的蛋白合成方法方面(如在昆蟲寄主細胞中)，或在人或其它哺乳動物的遺傳治療方面也可能是有用的。期望本發明的DNA序列在開發可作為大量生產NRSF及NRSF產品的真核“寄主”的轉基因哺乳動物種方面是有用的。一般參見Palmiter et al.，Science 222，809-814(1983)。本發明的NRSF DNA序列可能有診斷用途，如檢測基因變化，mRNA結構及表達程度。
本發明重組體NRSF以其是外源DNA序列的原核或真核寄主表達產物(如，培養基中的細菌、酵母，高等植物、昆蟲或哺乳動物細胞)為特征，所述的DNA序列是通過遺傳或cDNA克隆，或通過基因合成，特別是采用載于自發復制DNA質粒或病毒載體上的外源DNA序列以常規技術進行上述處理而獲得的。表達在典型的酵母(如釀酒酵母或原核(如，大腸桿菌(E.coli))寄主細胞中的產物是與任何哺乳動物蛋白無關的。表達在脊椎動物(如非人類哺乳動物(如COS或CHO)和鳥)細胞中的產物是與任何人體蛋白無關的。按所用寄主，本發明的重組體NRSF可用哺乳動物或其它真核碳水化合物進行糖基化，或進行非糖基化。本發明的重組體NRSF還可包括一種起始蛋氨酸氨基酸殘基(在1位)。
本發明還包括諸如NRSF的多肽類似物之類的產物。這類類似物包含NRSF片段。按已知方法，人們可很容易地設計和制造將相關多肽編碼的基因，所述的多肽具有不同于本文在鑒別或定位一種或多種殘基(如，取代、末端及中間加成和缺失)方面所作規定的原始結構，任選地，cDNA序列和遺傳核苷酸序列的修飾可很容易用已知的位點引導的誘變技術完成，并可用來產生NRSF的類似物及衍生物。這類產物具有天然存在的NRSF的一種或多種生物特性，但在其它方面則不相同。作為例子，本發明的產物包括那些通過如，缺失而按比例縮小的;或者那些對水解更為穩定的(因而具有比天然存在的NRSF更明顯和延長的效果)的;或者那些已被改變而除去一個或多個O-糖基化和/或N-糖基化潛在位點的;或者那些具有一個或多個缺失的或被其它殘基(如丙氨酸或絲氨酸殘基)所取代的半胱氨酸，并且是潛在地易于以活性態與微生物系統分離的;或者那些具有一個或我個被苯丙氨酸取代的酪氨酸殘基并或多或少易于與目標蛋白或與目標細胞上的受體結合的那些產物。還包括僅復制該連續氨基酸序列的一部分或NRSF中的次級構象的多肽片段，這類片段只具備NRSF的一種性能而不具有其它性能。值得注意的是，對于本發明一種或多種產物而言，不必具有治療用途或其它方面的用途，如NRSF拮抗。競爭性的拮抗作用如在NRSF過度產生的情況下將是很有用的。
本發明還包括用部份補充到人體NRSF的cDNA或遺傳DNA序列的蛋白編碼鏈中的DNA編碼的多肽類別。
本發明還包括用于治療與神經受體表達有關的生物學無序的藥用組合物，這類組合物包括與治療有效量的本發明多肽產物一起存在的用于重組體NRSF治療的適宜的稀釋劑、防腐劑、增溶劑、乳化劑、佐劑和/或載體。本文所用的“治療有效量”指的是這樣的量該量對指定的癥狀及給藥群體具有治療效果。這類組合物包括各種緩沖液含量(如Tris-HCl、乙酸鹽、磷酸鹽)、pH和離子濃度的稀釋劑、添加劑如降解劑和增溶劑(如Tween 80、多乙氧基醚80)、抗氧化劑(如抗壞血酸、偏二硫酸鈉)、防腐劑(如乙基汞硫代水楊酸鈉、芐醇)及填充物(如乳糖、甘露糖醇);共價附著于該多肽以延長體內半存留期及增強效力的聚合物(例如水溶性聚合物，如聚乙二醇及聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物，見Davis等人的美國專利(US，4，179，337);及摻入聚合化合物(如多乳酸、多葡糖酸等)的造粒過程中的或摻入脂質體中的原料。這類組合物將影響重組體NRSF的物理狀態、穩定性、體內釋放速率及體內消除速率。
本發明的非天然存在的神經受體刺激因子可望在治療與將神經受體表達在其表面的細胞相關的無序及癥狀方面，單獨地或與其它療法相結合使用都是有效的。特別地，本發明的重組體NRSF作為某些人的癌細胞的生長抑制因子和分化因子，并可用于治療各種與神經受體表達有關的各種類型腫瘤，這類腫瘤包括乳癌、卵巢癌、前列腺癌和胃癌。
該因子還可與其它物質如放射性同位素示蹤分子、毒素、細胞分裂素及其它對治療腫瘤有用的化合物結合，以便增加這些化合物在高水平表達神經受體的人體腫瘤上固定。
其它的生物和治療應用也是可能的。比如應用在將該神經受體表達在其表面上的正常人的胃腸道、呼吸道、尿道和生殖道以及皮膚的上皮細胞(Press et al.，Oncogene 5953-962，1990)與該受體結合的，或相互作用并改變細胞生長或代謝作用的物質在需要細胞重新布居，(即在導致細胞破壞的物理傷害之后)，或在期望提高或刺激該細胞的代謝活性或因細胞生長或分化(如從皮膚的毛囊中再生毛發的生長)所產生的特性的場合下將是有用的。
本發明的多肽根據待治的特定無序、具體病人的癥狀、該因子的輸送位點給藥方法及醫師所知的其它有關事項進行配制和確定劑量。因此，出于本文的目的，重組體NRSF，或類似物，或衍生物的有效量是這樣一個量該量有效地改變細胞繁殖和分化，或有效地防止、減少使用該多肽的癥狀的惡化，緩解或治愈該癥狀。本多肽的活性可通過采用對治療正施用本發明多肽的同樣癥狀有用的一種或多種添加的生物活性劑而得以增強和補充，所述生物活性劑比如是治療癌癥的IL-2、血小板衍生的生長因子、表皮生長因子、成纖維細胞生長因子以及用于傷口愈合的類似物等。
在下列實施例中，本發明得以說明，但這些實施例不限制本發明。用于這些實施例中的生物材料是按以下途徑獲得的。對該神經受體的羰基末端的單克隆抗體(Ab-3)得自Oncogene Science(Uniondale，NY)，對磷酪氨酸，PY＝20，的單克隆抗體得自Amersham(Arlington Heights IL)。對人體酪蛋白的小鼠單克隆抗體(β和K型)是R.C.Coombs(Charing Cross Medical School，London)的贈品。AU-565人乳癌細胞得自Cell Culture Laboratory，Naval Supply Center(Oakland，CA)。大鼠1-EJ細胞系(ATCC CRL 10984)是通過將人體EJ ras致癌基因轉染成大鼠1成纖維細胞而產生的(如由Peles E.等人述于Cell 69205-216，1992及由Land，H.等人述于Nature 304596-602，1983)，得自American Type Culture Collection(Rockville，MD)的細胞系包括MDA-MB-231(ATCC HTB 26)、MDA-MB-453(ATCC HTB131)、Hs294T(ATCC HTB 140)、SK-BR-3(ATCC HTB 30)、HT-1080(ATCC CCL121)、BALB/C 3T3(ATCC CRL 6587)及COS-7(ATCC CRL 1651)。細胞按American Type Culture Collection所推薦的方法培養，或在用10%胎牛血清(Hyclone，Logan Utah)供給的Dulbecco改性Eagle培養基(GIBCO，Grolld Island，NY)中培養。
實施例1天然存在的大鼠NRSF氨基酸序列分析A.胰蛋白酶的消化作用約44千道爾頓得自ras-轉變的大鼠成纖維細胞(大鼠1-EJ細胞)條件培養基的天然存在的NRSF糖蛋白的提純和氨基酸末端定序已被敘述過(Peles E.et al.，Cell 69205-216，1992))。為獲取用于設計單獨的低核苷酸探針的多個氨基酸序列，按如下所述，將300微摩爾純化大鼠蛋白用酪氨酸進行部分蛋白水解。10毫克蛋白在200μl的0.1M碳酸氫銨.緩沖液(pH7.8)中重新構建。用L-1-甲苯磺酰基酰氨基-2-苯乙基氯甲基酮處理的酪氨酸(Serva)在37℃將此消化作用進行18小時，所用的酶與基質之比為1∶10。
B.用HPLC分離胰蛋白酶消化液將所得肽混合物用反相HPLC分離，再用Vydac C4微柱(2.1mm直徑×15cm，300
)及帶有二極管矩陣探測器和工作站的HP1090液相色譜系統在215nm處進行監測(圖1)。該柱用0.1%的三氟乙酸(流動相A)補償，而洗脫以線性梯度從0-55%的流動相B(90%的乙腈溶于0.1%三氟乙酸中的溶液)在70分鐘內完成。流量為0.2ml/分，而該柱的溫度控制在25℃。很早就從該柱上得到三個洗脫的吸收峰(保持時間小于5分鐘)，這說明這些餾分與短長度肽相對應。為確定氨基酸序列，回收三個其它的主要餾份13分鐘后洗脫的第一餾份(T13.3)，21分鐘后洗脫的第二餾份(T21.8)、及27分鐘后洗脫的第三餾份(T27.3)。
C.洗脫的肽餾份的定序與這三個主要洗脫餾份相對應的肽的氨基酸序列是以自動Edman降解來確定的。該肽的氨基酸序列分析用帶有聯機乙內酰苯硫脲(PTH)氨基酸分析儀的Model 477蛋白定序器(Applied Biosystems，Inc.，Foster City CA)和Model 900數據分析系統(Hunkapiller M.W.et al.，Methods of Protein Microcharacterization，Humana Press Clifton NJ，pages 223-247，1986)來進行。該肽被放在用polybrene和NaCl予循環的經三氟乙酸處理的玻璃纖維碟上。該PTH-氨基酸分析以采用復式噴射泵和反相(C-18)窄腔柱(Applied Biosystems 2.1mm×250mm)的微液色譜系統(Model 120)完成。第一餾份(T13.3)產生兩個可辨別的主序列信號(信號比為5∶1)而長度為3和4個氨基酸(該序列示于圖1)。第二餾份(T21.8)給出一個信號序列，它始于先前確定的基本N-末端氨基酸序列(Peles et al.，見上文，此第8個殘基是精氨酸)的9號殘基。肽T21.8的序列就這樣地證實了得自整個蛋白的N-末端序列分析的信息，并將一個天冬氨酸配置于17位，該位在先前是以未配位的殘基作報導的。第三餾份(T27.3)給出了達到Edman定序的12環的三個清晰的定序信號，及一個從環13到24的清楚的序列，這表明此第三肽是相當長的。
D.共洗脫肽的再色譜分析及定序為精確確定餾份T27.3中的共洗脫肽的氨基酸序列，按下文方法處理此餾份的等分試樣。將該肽餾份的70%的等分試樣在真空中干燥。然后在100μl的0.2M碳酸氫銨緩沖液中重新構建。將二硫蘇糖醇(最終濃度為2mM)加入此溶液，該液隨后在37℃培育30分鐘。此經還原的肽混合物隨后以采用Vydac柱(2.1mm直徑×15cm)的反相HPLC分離，洗脫條件及流量與前述相同。
兩個主肽峰被發現，然后以上述的自動Edman降解來定序，即T34.4，一個11-殘基精氨酸肽和T40.4，一個12-氨基酸長的賴氨酸肽(圖1，插入圖)。肽T34.4的殘基1和來自T40.4的環11保持未配位，這表明它們可能是與餾份T27.3中的肽的二硫化物鍵相關的半胱氨酸殘基。這種可能性為采用API-Ⅲ質譜儀(SCIEX，Toronto Canada)的電噴質譜分析所證實。分析肽T34.4和T40.4，結果得到分別為1261.5和1274.0的平均質數。因此結論是，這兩種肽通過二硫化物鍵一起固定在天然存在的蛋白中。基于這些數據，可再檢驗峰T27.3的混合序列信號。當肽T34.4和T40.4的序列被從餾份T27.3的混合信號中扣除時，較長的第三肽的序列對于第一個12環也變得明顯了。這個被扣除的肽的24-氨基酸的長序列被示于圖1。在這種肽序列中的第9個氨基酸以天冬酰胺，但以很低的產率配置(約為該序列信號的10%)，這表明一個N-連接的糖基化位點。
由于糖基團是構成天然存在的NRSF的分子重量以及估計約四分之一的分子質量的原因之一(Pales E.et al.，Cell 69205-216，1992)，在部分蛋白水解后只能回收到很少量的肽是未料想到的。一種可能性是該天然存在的蛋白含有在蛋白水解過程中保持完整，但是發生變性的蛋白酶-抗性核區，因而不能通過HPLC色譜法而溶解。
實施例2將大鼠NRSF編碼的cDNA克隆A.cDNA庫的建立用標準方法(Maniatis，T.et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold spring Harbor Laboratory cold spring Harber，NY，1982)將RNA從Rat1-EJ細胞中分離，并用“mRNA Separator(分離器)”儀(Clontech Laboratories，Inc.，Palo Alto，CA)選擇多聚腺苷酸mRNA。用“Superscript”(上角標)儀(GIBCO BRL Life Technologies，Inc.，Gaithersburg，MD)合成cDNA。將柱上分級的雙鏈cDNA綁扎在SalⅠ-和NotⅠ-消化的pJT-2質粒載體上，以得到如圖2中所示的含cDNA插入物的質粒。該pJT-2質粒載體由V19.8載體(ATCC 68124)衍生得到。特別是，V19.8的HindⅢ和SacⅡ克隆位點通過用合成低核苷酸聯接物轉變成SalⅠ和NotⅠ位點以產生pJT-2載體。通過電穿孔法將含cDNA插入物的質粒轉化成DH10B E.coli細胞(Dower，W.J.et al.，Nucleic Acids Res.166127-6145，1988)。
B.cDNA探針的制備和克隆的分離用兩個低核苷酸探針來篩選約5×105初級轉化體，該探針是以NRSF的N-未端區域的聯合氨基酸序列為基礎的(如實施例1C中所述)，特別是殘基5-24(RGSRGKPGPAEGDPSPALPP)(序列標號1)和T40.4胰蛋白酶肽的殘基7-12(GEYMCK)(序列標號2)。它們相應的序列(以反義表示)如下(“N”表示全部四個核苷酸)(1)5′-ATA GGG AAG GGC GGG GGA AGG GTC NCCACTC NGC AGG GCC GGG CTT GCC TCT GGATGCC TCT-3′(序列標號16)(2)5′-TTT ACA CAT ATA TTC NCC-3′C G G C(序列標號17)這些合成的低核苷酸用具有T4聚核苷酸酶的α-32p-ATP作端標記，并用于篩選各組復制的硝化纖維素濾器。該雜交溶液含有6×SSC，50mM磷酸鈉(pH 6.8)、0.1%焦磷酸鈉、2×Denhardt溶液，50μg/ml鮭精子DNA和20%甲酰胺(對探針1)或不含甲酰胺(對探針2)。雜交在42℃(對探針1)或37℃(對探針2)進行14小時。或者在50℃用0.5×SSC/0.2%SDS/2mM EDTA(對于探針1)或者在37℃用2×SSC/0.2%SDS/2mM EDTA(對于探針2)洗滌這些過濾器。過濾器的放射自顯影給出與兩個探針雜交了的10個克隆。通過如前面所述的再培養和探針雜交來純化這些克隆。
實施例3以轉染的COS-7細胞表達重組體大鼠NRSF為了驗證按實施例2B中所述的初級篩選步驟所確定的cDNA克隆相應于NRSF-特種轉錄體，將這些克隆暫時表達在COS-7猴細胞中。為此目的，在SV40啟動子和SV40未端側的3′及聚腺苷酸化信號的控制之下將該cDNA克隆插入pJT-2真核表達載體中。所得質粒，這包括含克隆44cDNA的pJT-2/NRSF質粒(圖2)，如下所述地用于以電穿孔來轉染COS-7細胞。將于0.8ml Dulbecco改性Eagle培養基(DEME)中的6×106個細胞和10%胎牛血清轉染到0.4cm小杯中，并同于10μl TE溶液(TE溶液為10mM三-HCl，PH8.0，1mM EDTA)中的20μg質粒DNA混合。電穿孔是在室溫，1600伏和25μF，并用具有200歐姆的脈沖控制系統的BioRad Gene Pulser設備進行。然后將細胞稀釋于20ml DMEM/10%胎牛血清中并轉染到T75燒瓶(Falcon)中。在37℃培育14小時后，用DMEM/1%胎牛血清替換該介質，并再繼續培養48小時。
然后，如下所述，測定所得經調整培養基的刺激MDA-MB-453人乳房腫瘤細胞中的該神經受體的酪氨酸磷酸化的能力。將該經調整的培養基用0.2目無菌濾器(Costar，Cambridge，MA)過濾并用Centriprep 10設備(Amicon，Beverly，MA)將其濃縮16倍。將該濃縮的培養基在含0.1%胎牛血清的磷酸緩沖鹽水(PBS)中稀釋，然后加到含3×105MDA-MB-453細胞的48井皿的各個井中。接著于37℃培育5分鐘后，將培養基吸出，再用磷酸酪氨酸(PY20)的單克隆抗體對該細胞進行western印跡。用于細胞溶解和western印跡的方案公開在Pele，E.等人的Cell69205-216(1992)中。
該分析結果繪于圖3中。盡管未經轉染的COS-7細胞的培養基稍微誘發增加了酪氨酸的磷酸化，但由克隆44(即pJT-2/NRSF質粒)轉染細胞所得的該培養基顯著地更具活性。因此，克隆44cDNA通過再培養和通過過濾器雜交篩選而被完全純化。圖3(右圖)將完全純化克隆44的活性與任選的對照克隆27和29的活性進行了比較。很顯然，在轉染入COS-7細胞后，該完全純化的克隆44cDNA產生的活性比對照質粒或部份純化克隆(包括部份純化的克隆44)高。基于克隆44雜交為兩種單獨的低核苷酸探針(實施例2B)及其導致合成生物活性NRSF的能力選擇克隆44作進一步的DNA定序分析。
實施例4大鼠NRSF cDNA的定序根據制造商的說明，用373A自動DNA定序儀及“Taq DyeDeoxyTMTerminator”循環定序儀(從Applied Biosytems，Inc.，購得，Foster City，CA)對克隆44 CDNA進行初級定序。按照制造商的說明，用35S-dATP(Amersham)和“SequenaseTM儀(從United Statas Biochemicals(Cleveland，Ohio)購得)，來進行某些定序。用合成低核苷酸作為引物將克隆44的cDNA兩鏈定序。克隆44的cDNA插入物的核苷酸序列分析得出一個含有擴展至該cDNA5′未端的436氨基酸長的開放解讀密碼(open reading frame)的1894bp序列。該解讀密碼3′未端的下游是594堿基長的未解釋段落。后者包括多聚腺苷酸的尾端，在其前面是多聚腺苷酸化信號(AAATAAA)。由于在最長的開放解讀密碼的氨基未端未發現終止密碼子和可識別的信號肽，則以相同方式來分析三個其他獨立陽性cDNA克隆核苷酸序列。所有3個加入到5′的克隆終止了包括內-碼(in-frame)終止密碼子的292bp序列，這表明克隆44為缺少0.3千堿基的5′截形cDNA。
該cDNA克隆的組合核苷酸序列示于圖4，而且克隆44 cDNA序列示于圖5。該組合序列跨2186個堿基對，這包括多聚腺苷酸尾端，并且，如果該氨基末端蛋氨酸被認為是起始因子密碼子，則其含有422個殘基的開放解讀密碼。水療法分析(圖6)表明在該蛋白質的氨基末端沒有凸出的疏水序列，該蛋白質對于蛋白質分泌可起到信號肽的作用(Von Hijne，G.，J.，Mol.Biol.18499-105，1985)。然而，這種分析表明存在23個氨基酸的較高疏水段(圖4中下面劃線的)，這被看作為潛在的橫跨膜區。該區域對切NRSF的假定前體，且確定157個氨基酸的假定胞質區。該推斷的細胞外區含有所有的直接由純化蛋白質確定的肽序列(圖4中指出的)。它們都完全比得上由除蘇氨酸殘基137外的cDNA所導出的序列，該殘基是被賦予肽T27.3中的異亮氨酸的作用的(圖1)。五個不同cDNA克隆在相應位置上將一個蘇氨酸殘基編碼，表明這些變化不是由蛋白質的異構所造成。相反，蛋白質序列數據的重檢測表明該異亮氨酸信號被從先前的Edman循環轉換，并表明該蘇氨酸由于O-糖基化而逃脫了探測。很明顯，所有這些經定序的肽均位于假定外區的氨基酸末端的半區內。另半區內含有六個半胱氨酸殘基，它們包含表皮生長因子(EGF)類似區(圖7)，由于它的結構非常緊密，知其是抗蛋白水解的(參照Massague，J.，J.Biol.Chem.26521393-21396，1990)。該外區的另兩個半胱氨酸殘基(看來是象在NRSF中由二硫鍵聯接的(實施例1D中所述))定義一種免疫蛋球白(Ig)同源單元(圖8)。另外，該經斷定的蛋白質序列包括4個N-鍵聯糖基化的潛在位點，它們全部按氨基末端的意義歸屬于橫跨膜區(在圖4中用星號“＊”標注)。NRSF前體的經斷定的全部結構示于圖9。
根據繪于圖9中的橫跨膜區，NRSF前體應該聚積在高度表達NRSF mRNA的細胞表面上。對于EGF生長因子族中其他成員，已經發現膜結合的前體蛋白。例如，Brachmann，R.等人在Cell 56691-700(1989)中已證明在表達轉化生長因子αmRNA的細胞表面上存在轉化生長因子α。特定結合NRSF的分子選擇性地將治療學分子導向過表達NRSF細胞。例如，增加抗重組NRSF能力并與治療學分子配合的單克隆抗體可選擇性地使治療分子固定在高度表達膜結合的NRSF的細胞表面上。這類細胞包括具有激活ras基因的腫瘤細胞。抗體配對物可用化學療法化合物、細胞分裂素、毒質、淋巴激活素或放射核素來構成。
實施例5由轉染的COS-7細胞表達的重組體NRSF的功能分析先前已經報導過由ras-轉化的大鼠成纖維細胞分泌的同源純化的、天然存在的NRSF抑制經培養的人乳房癌細胞的生長并誘導它們產生標志細胞分化的乳組分(Peles E.et al.，Cell 69205-216，1992)。為了直接使這些活性與該克隆的DNA發生關系，測定由克隆44衍生的重組體NRSF對經培養的乳房癌細胞的作用。更具體地是，Au-565或MDA-MB-453細胞培養物用16倍濃縮的經調整的培養基處理，該培養基是由用克隆44pJT-2/NRSF表達載體(圖2)或者用含有不相關cDNA插入物(克隆27)的對比pJT-2質粒所轉染的COS-7細胞而得到。以1∶50的最終稀釋度來使用這兩種培養基，并用該細胞在37℃培育3天。然后用血細胞計數器來測定細胞數量，通過計算機處理圖象分析來測量核面積。按Bacus，S.等人(Mol.Carinogensis 3350-362(1990))所述的方法進行脂類和酪蛋白的染色。該實驗重復三次并得到定性上類似的結果，結果列于表1中。
表1具有脂滴的 細胞數 核面積 具有酪蛋白的細胞(%) (104/cm2) (μ2) 細胞(%)AU-565細胞對比 10 4×104106 小于1重組體 74 1.3×104215.8 大于90NRSFMDA-MB-453細胞對比 9 3.6×10479.8 大于1重組體 56 1.8×104115.7 78NRSF該結果表明，用對比-調整過的培養基處理的Au-565和MDA-MB-453培養物大部份呈現為未成熟形態，而用含重組體NRSF的調整培養基處理的細胞則大部份呈現出有特征的成熟形態，這包括大的核和在細胞質中出現脂滴。對人體酪蛋白(P和X型)的免疫組織化學染色特性表明大部份這種細胞也合成酪蛋白，而用對照物處理的培養物則不同。結論是，盡管克隆44缺乏NRSF cDNA的5′未端部份，這種cDNA克隆導致功能活性NRSF的合成，它是由轉染的COS-7細胞而產生的。
這一結論進一步被在配位體替代分析中重組體NRSF與天然存在NRSF競爭能力支持。根據制造商的說明，使用Iodogen(Pierce，Rockford，IL)以1mCi Na125I將純化的天然存在的大鼠NRSF作放射性同位素示蹤。通過在Excellalose GF-5脫鹽柱(Pierce)上的凝膠過濾將未反應的碘從該蛋白質中分離。該放射性同位素示蹤的天然存在NRSF(125I-NRSF)的具體活性是3×106cpm/ng。該經放射性同位素示蹤的NRSF(10微微摩爾)在4℃用生長于24井皿(costar)中單層MDA-MB-453細胞培育60分鐘。該培育過程也可在存有由轉染的COS-7細胞而得到的經調整的培養基時進行。通過用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌三次將未結合的125I-NRSF去除、并可將該細胞溶于含0.1%SDS的0.1N NaOH溶液中。用γ-計數器來測定放射活性。
如圖10中所示含有由COS-7細胞中的pJT-2/NRSF表達載體(圖2)所表達的重組體NRSF的調整培養基將總125I-NRSF結合減少約50%。對于負對照組而言，則使用由以含大鼠TGEα cDNA的pJT-2表達載體轉染的細胞而得到的COS-7調整培養基(Blasband，A.et al.，Mol.Cell Biol.102111-2121，1990)。與該重組NRSF調整培養基相反，該TGFα調整培養基并不抑制125I-NRSF結合。與純化的、天然的、未示蹤的NRSF(Peles，E.et al.，cell 69205-216，1992)相比較，該重組體NRSF調整培養基的部份抑制效果被認為是由于其在結合測試中相當較低的濃度而造成的。另外，這也可能是由于高的非規定配位體結合之故。
為解決這一問題，也為證明與神經受體之間的直接相互作用，采用了共價交聯分析。如上所述，通過在存有轉染的COS-7細胞的調整的培養基時將MDA-MB-453細胞與125I-NRSF結合而完成該分析。在于4℃結合1小時之后，以1mM最終濃度加入化學交聯劑雙(硫代琥珀酰亞胺基)辛二酸(BS3，Pierce)，隨后用PBS進行簡單洗滌。在22℃培育45分鐘之后，用淬火緩沖劑(在PBS中的10mM苷氨酸PH7.4)培育該單層物質10分鐘。然后用冰冷的PBS洗滌該細胞兩次，將之溶解于溶解緩沖液中，再根據Peles，E.等人在EMBO J.102077-2086(1991)中公開的方案，用單克隆抗體Ab-3對該神經蛋白質進行免疫沉淀。該經徹底洗滌的免疫復合物通過凝膠電泳(6%酰胺)而溶解并進行放射自顯影。該分析結果(圖11)表示該重組體NRSF不象重組體TGFα那樣，它能替代大多數的受體-結合的125I-NRSF。該結果證明克隆44cDNA將功能NRSF分子編碼。
實施例6NRSF表達的Northern印跡分析為了確定NRSF mRNA的尺寸和組織分布，使用克隆44的cDNA插入物作為雜交探針進行Northern印跡雜交試驗。通過對成年雌大鼠作手術而得到組織，用標準方法提取其RNA以及選擇多聚腺苷酸+RNA(Manniatis，T.et al.，Molecular cloningA Laboratory Manual，cold spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，1982)。通過隨機活化化方法(Feinberg，A.P.，and Vogelstein，B.，Anal.Biochem 1326-13，1983)，用α-32P-dCTP將該1.9Kb長的克隆44的cDNA插入物進行標記。雜交條件如下6×SSC，50mM磷酸鈉(PH6.8)，0.1%焦磷酸鈉，2×Denhardt溶液，50μg/ml鮭精子DNA和50%甲酰胺。于42℃進行此雜交14小時，隨后在60℃用0.2×SSC、0.1%SDS和2mMEDTA洗滌30分鐘。將過濾物于-70℃以指示的時間通過一個增強濾光鏡曝露于Kodak XAR X-Kay膠片。
圖12(A)表明，在用多聚腺苷酸選擇的Rat1-EJ成纖維細胞的RNA的Northern印跡中，顯出三條帶。它們的分子尺寸相應于6.8′2.6和1.7Kb。進一步的放射自顯影后可看到兩種附加的mRNA(未示)。NRSF在正常Rat或3T3成纖維細胞中表達的相對水平明顯地低于在ras-轉化細胞中的表達水平，這與早先的觀察由致癌基因ras基因所引起的轉化與神經受體刺激活性相關是一致的(Yarden，Y.，and Weinberg，R.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA863179-3188，1989)。
在觀察成年大鼠組織時(圖12(B))，在脊髓中觀察到了最高的NRSF mRNA表達。在腦組織中也檢測到了最高的NRSF mRNAS。除了上述mRNA外，這些組織表達了一種其尺寸為3.4kb的變異體mRNA。被NRSF刺激的神經受體出現在人胎兒脊髓和腦中(Quirke，P.，et al.，Br.J.Cancer 6064-69，1989)，這說明NRSF和神經受體兩者的表達調節了神經組織的生長和分化。在大鼠成神經細胞瘤中的神經受體基因的致癌基因活性(Bargmann，C，et al.，Nature 319226-230，1986)，在神經組織生長調節過程中進一步牽涉到該神經受體和NRSF。
借助其神經受體刺激活性，NRSF表達也可調節其他細胞類型的生長和分化。在正常分化的人體胃腸、呼吸、泌尿和生殖道以及皮膚的上皮細胞表面發現了該神經受體，而且該受體也表達在相應的人胎兒組織中(Press，M.et al.，Oncogene 5953-962，1990)。圖12(B)證明了在成年大鼠組織中NRSFmRNA表達水平的特定組織調節作用。陽性組織包括肺、卵巢和胃。在皮膚、腎和心臟中呈現量相對低的中等尺寸的轉錄產物。在肝、脾和肌肉中不含有可探測到的NRSFmRNA。圖12(B)還表明與不同NRSFmRNA種類成相關比例的特定組織的改變。每一種變異體mRNA都將具有不同生物性質的變異體NRSF蛋白編碼。天然的NRSF可以通過特定組織中的NRSFmRNA結構和表達水平的變化而調節細胞的增殖和分化。本發明非天然的NRSF的施用，特別是對缺乏正常水平的天然NRSF蛋白的被損傷的或患病組織，可提供神經受體刺激作用，也可調節所治療組織的細胞生長和分化。特別是，心臟、胃、腦、脊髓、卵巢、肺、腎和皮膚組織表達天然存在的NRSF并可期望響應用本發明重組體NRSF的治療。
異常的NRSF或神經受體的表達可導致對瘤產生影響的autocrine相互作用，(Browder，T.et al.，Cancer Cells，19-17，1989;Yarden Y.，and Ullrich，A.，Ann.Rev.Biochem.57443-448，1988)。在由孵巢、肺和胃組織衍生的人腫瘤中出現神經受體基因的過表達或加強(Slamon，D.et al.，Science 244707-712，1989;Tal.M.et al.，Cancer Res.481517-1520，1988;Cline，M.et al.，Cancer 602669 et seq.，1987)。這些組織表達神經受體刺激因子(圖12(B))，這可影響腫瘤的生長。圖12(C)表明人體腫瘤細胞可過表達NRSFmRNA。對人體腫瘤細胞系的初始觀察發現HT-1080纖維肉瘤細胞、Hs294T黑素瘤細胞和MDA-MB-231乳腺癌細胞表達了其含量有所增加的NRSFmRNA(圖12(C))。對神經受體或者對其同源神經受體刺激因子表達的干擾可以明顯改變正常細胞的生長和分化，同時具有病理學后果，例如腫瘤發育。本發明的重組體NRSF可以在天然NRSF不足、或當神經受體被過表達時的情況下用于恢復神經受體和NRSF之間的被平衡的相互作用。
NRSF異常腫瘤細胞表達可能是由活化的致癌基因造成。NRSFmRNA表達在用ras致癌基因轉化的細胞中顯著地增加(圖12(A))。活化的ras基因在多種癌細胞系和在幾種器官(包括結腸、肺、膽囊、尿囊)的人腫瘤和胰腺癌以及黑色素瘤、肉瘤和白血病中被發現(Pimmental，E.，Oncogenes，2nd Edition，Volume Ⅱ，CRC Press，Boca Raton FL，1989)。在惡化前的組織(例如人結腸直腸腺瘤)中也發現了活化的ras突變，并認為這對于腫瘤發生產生影響(Fearon，E.，and Vogelstein，B.，Cell 61759-767，1990)。用本發明的NRSFDNA和NRSFmRNA探測方法，可以在惡化和惡化前的人體組織中發現增加了的NRSF表達。其他方法也可在人體組織中鑒定增加了的NRSF表達。為分析蛋白質和mRNA表達技術領域的普通技術人員所知的這些方法包括免疫組織化學分析法、放射免疫測定法、酶連接免疫吸收測定法、及聚合酶鏈反應測定法。惡化前的和惡性細胞中過表達NRSF的鑒定對于疹治人體癌癥特別有用。
序列表(1)序列標號1的信息(ⅰ)序列特征(A)長度20氨基酸殘基(B)類型氨基酸(ⅹⅰ)序列描述序列標號1Arg Gly Ser Arg Gly Lys Pro Gly ProAla Glu Gly Asp Pro Ser Pro Ala LeuPro Pro(2)序列標號2的信息
(ⅰ)序列特征(A)長度6氨基酸殘基(B)類型氨基酸(ⅹⅰ)序列描述序列標號2Gly Glu Tyr Met Cys Lys(3)序列標號3信息(ⅰ)序列特征(A)長度2186堿基對(B)類型核酸(C)線型雙鏈(D)拓補學未知(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO3
(4)序列標號4的信息(ⅰ)序列特征(A)長度1894堿基對(B)類型核酸(C)線型雙鏈(D)拓補學未知(ⅹⅰ)序列描述序列標號4
(5)序列標號5的信息(ⅰ)序列特征(A)長度64氨基酸殘基(B)類型氨基酸(ⅹⅰ)序列描述序列標號5Cys Ala Glu Lys Glu Lys Thr Phe Cys Val Asn Gly Gly Glu Cys Phe Thr Val Lys Asp Leu Ser Asn Pro Ser Arg Tyr Leu Cys Lys Cys Gln Pro Gly Phe Thr Gly Ala Arg Cys Thr Glu Asn Val Pro Met Lys Val Gln Thr Gln Glu Lys Ala Glu Leu Tyr Gln Lys Arg Val Leu Thr
(6)序列標號6的信息(ⅰ)序列特征(A)長度60氨基酸殘基(B)類型氨基酸(ⅹⅰ)序列描述序列標號6Cys Pro Asp Ser His Thr Gln Tyr Cys Phe His Gly Thr Cys Arg Phe Leu Val Gln Glu Glu Lys Pro Ala Cys Val Cys His Ser Gly Tyr Val Gly Val Arg Cys Glu His Ala Asp Leu Leu Ala Val Val Ala Ala Ser Gln Lys Lys Gln Ala Ile Thr Ala Ala Val Val Val(7)序列標號4的信息(ⅰ)序列特征(A)長度60氨基酸殘基(B)類型氨基酸(ⅹⅰ)序列描述序列標號7Cys Asn Ala Glu Phe Gln Asn Phe Cys Ile His Gly Glu Cys Lys Tyr Ile Glu His Leu Glu Ala Val Thr Cys Asn Cys Gln Gln Glu Tyr Phe Gly Glu Arg Cys Gly Glu Lys Ser Met Lys Thr His Ser Met Ile Asp Ser Ser Leu Ser Lys Ile Ala Leu Leu Ala Ile Ala(8)序列標號8的信息(ⅰ)序列特征
(A)長度61氨基酸殘基(B)類型氨基酸(ⅹⅰ)序列描述序列標號8Cys Pro Ser Ser Tyr Asp Gly Tyr Cys Leu Asn Gly Gly Val Cys Met His Ile Glu Ser Leu Asp Ser Tyr Thr Cys Asn Cys Val Ile Gly Tyr Ser Gly Asp Arg Cys Gln Thr Arg Asp Leu Arg Trp Trp Glu Leu Arg His Ala Gly Tyr Gly Gln Lys His Asp Ile Met Val Val(9)序列標號9的信息(ⅰ)序列特征(A)長度60氨基酸殘基(B)類型氨基酸(ⅹⅰ)序列描述序列標號9Cys Leu Arg Lys Tyr Lys Asp Phe Cys Ile His Gly Glu Cys Lys Tyr Val Lys Glu Leu Arg Ala Pro Ser Cys Ile Cys His Pro Gly Tyr His Gly Glu Arg Cys His Gly Leu Ser Leu Pro Val Glu Asn Arg Val Tyr Thr Tyr Asp His Thr Thr Ile Leu Ala Val Val Ala(10)序列標號10的信息(ⅰ)序列特征(A)長度60氨基酸殘基(B)類型氨基酸
(ⅹⅰ)序列描述序列標號10Cys Ala Ala Lys Phe Gln Asn Phe Cys Ile His Gly Glu Cys Arg Tyr Ile Glu Asn Leu Glu Val Val Thr Cys His Cys His Gln Asp Tyr Phe Gly Glu Arg Cys Gly Glu Lys Thr Met Lys Thr Gln Lys Lys Asp Asp Ser Asp Leu Ser Lys Ile Ala Leu Ala Ala Ile Ile(11)序列標號11的信息(ⅰ)序列特征(A)長度61氨基酸殘基(B)類型氨基酸(ⅹⅰ)序列描述序列標號11Cys Gly Pro Glu Gly Asp Gly Tyr Cys Leu His Gly Asp Cys Ile His Ala Arg Asp Ile Asp Gly Met Tyr Cys Arg Cys Ser His Gly Tyr Thr Gly Ile Arg Cys Gln His Val Val Leu Val Asp Tyr Gln Arg Ser Glu Asn Pro Asn Thr Thr Thr Ser Tyr Ile Pro Ser Pro(12)序列標號12的信息(ⅰ)序列特征(A)長度48氨基酸殘基(B)類型氨基酸(ⅹⅰ)序列描述序列標號12
Cys Asn His Asp Tyr Glu Asn Tyr Cys Leu Asn Asn Gly Thr Cys Phe Thr Ile Ala Leu Asp Asn Val Ser Ile Thr Pro Phe Cys Val Cys Arg Ile Asn Tyr Glu Gly Ser Arg Cys Gln Phe Ile Asn Leu Val Thr Tyr(13)序列標號13的信息(ⅰ)序列特征(A)長度49氨基酸殘基(B)類型氨基酸(ⅹⅰ)序列描述序列標號13Cys Asn Asp Asp Tyr Lys Asn Tyr Cys Leu Asn Asn Gly Thr Cys Phe Thr Val Ala Leu Asn Asn Val Ser Leu Asn Pro Phe Cys Ala Cys His Ile Asn Tyr Val Gly Ser Arg Cys Gln Phe Ile Asn Leu Ile Thr Ile Lys(14)序列標號14的信息(ⅰ)序列特征(A)長度65氨基酸殘基(B)類型氨基酸(ⅹⅰ)序列描述序列標號14Leu Val Leu Arg Cys Glu Thr Ser Ser Glu Tyr Ser Ser Leu Arg Phe Arg Trp Phe Lys Asn Gly Asn Glu Leu Asn Arg Lys Asn Asn Lys Pro Glu Asn Ile Lys Ile Gln Lys Lys Pro Gly Lys Ser Glu Leu Arg Ile Asn Lys Ala Ser Leu Ala Asp Ser Gly Glu Tyr Met Cys Lys Val Ile Ser
(15)序列標號15的信息(ⅰ)序列特征(A)長度65氨基酸殘基(B)類型氨基酸(ⅹⅰ)序列描述序列標號15Val Thr Leu Thr Cys Glu Ala Ser Gly Asp Pro Ile Pro Ser Ile Thr Trp Arg Thr Ser Thr Arg Asn Ile Ser Ser Glu Glu Gln Asp Leu Asp Gly His Met Val Val Arg Ser His Ala Arg Val Ser Ser Leu Thr Leu Lys Ser Ile Gln Tyr Arg Asp Ala Gly Glu Tyr Met Cys Thr Ala Ser Asn(16)序列標號16的信息(ⅰ)序列特征(A)長度60堿基對(B)類型核酸(C)線型單鏈(D)拓補學線性(ⅹⅰ)序列描述序列標號16ATA GGG AAG GGC GGG GGA AGG RTC NCC YTC NGC AGG GCC GGG CTT GCC TCT GGA GCC TCT(17)序列標號17的信息(ⅰ)序列特征
(A)長度18堿基對(B)類型核酸(C)線型單鏈(D)拓補學線性(ⅹⅰ)序列描述序列標號17YTT RCA CAT RTA YTC NCC
權利要求
1.一種非天然存在的多肽，該多肽含有充分復制的，足以使該多肽具有一種或多種天然存在的神經受體刺激因子的生物活性的天然的神經受體刺激因子的氨基酸序列。
2.根據權利要求1的多肽，它是外源DNA序列的原核或真核表達的產物。
3.根據權利要求2的多肽，它是非人類哺乳動物細胞表達的產物。
4.根據權利要求3的多肽，其中的非人類哺乳動物細胞是CHO細胞。
5.根據權利要求2的多肽，它是E.Coli細胞表達的產物。
6.根據權利要求2的多肽，它是酵母細胞表達的產物。
7.根據權利要求2的多肽，其中的外源DNA序列是cDNA序列。
8.根據權利要求7的多肽，其中的cDNA序列是圖5的DNA序列(序列標號4)。
9.根據權利要求2的多肽，其中的外源DNA序列是圖5的cDNA序列(序列標號4)同源的基因DNA序列。
10.根據權利要求2的多肽，其中的外源DNA序列是經加工的DNA序列。
11.根據權利要求2的多肽，其中該外源DNA序列被載于自發復制的DNA質粒或病毒載體上。
12.根據權利要求1的多肽，該多肽含有列于圖5中的大鼠神經受體刺激因子的氨基酸序列(序列標號4)，或其任一種遺傳操縱的變體。
13.根據權利要求2的多肽，該多肽含有列于圖7中的大鼠神經受體刺激因子的EGF-類區域的氨基酸序列(序列標號5)。
14.根據權利要求1的多肽，它含有列于圖8中的大鼠神經受體刺激因子的免疫球蛋白類區域的氨基酸序列(序列標號14)
15.根據權利要求1的多肽，它具有一種或多種天然存在的神經受體刺激因子的體內生物活性。
16.根據權利要求1的多肽，它具有一種或多種天然存在的神經受體刺激因子的體外生物活性。
17.一種用于一種在確保多肽產物的原核或真核寄主細胞中的表達的經分離DNA序列，該多肽產物具有一種充分復制的，足以使該多肽具有一種或多種天然存在的神經受體刺激因子的生物活性的天然存在的神經受體因子的氨基酸序列，所述DNA序列選自(a)列于圖4和5中的DNA序列(序列標號3和序列標號4)或其輔鏈;(b)雜交到(a)中所定義的DNA序列或其片段上的DNA序列;以及(c)雜交到(a)和(b)中所定義的DNA序列上的，但不包括退化的遺傳密碼的DNA序列。
18.一種原核或真核寄主細胞，該細胞以可使該寄主細胞表達該多肽產物的方式被權利要求17的DNA序列所轉化或轉染。
19.一種在原核或真核寄主細胞中表達權利要求17的DNA序列的多肽產物。
20.一種使多肽的原核或真核寄主表達編碼的經分離的DNA序列，該多肽具有一種充分復制的足以使該多肽具有一種或多種天然存在的神經受體刺激因子的生物活性的天然存在的神經受體刺激因子的一種氨基酸序列。
21.根據權利要求20的CDNA序列。
22.根據權利要求20的遺傳DNA序列。
23.根據權利要求20的經加工的DNA序列。
24.根據權利要求20的列于圖4和圖5中DNA序列(序列標號分別為3和4)。
25.根據權利要求20的DNA序列，它包括一種或多種易于在E.Codi細胞中表達的密碼子。
26.根據權利要求20的DNA序列，它包括一種或多種易于在酵母細胞中表達的密碼子。
27.根據權利要求20的DNA序列，它包括一種或多種易于在哺乳動物細胞中表達的密碼子。
28.一種包括根據權利要求20的DNA序列的生物功能質粒或病毒DNA載體。
29.一種用根據權利要求20的DNA載體穩定轉化或轉染的原核或真核寄主細胞。
30.一種在根據權利要求20的DNA序列的原核或真核寄主細胞中表達的多肽產物。
31.一種DNA序列，該序列使天然存在的神經受體刺激因子的多肽片段或多肽類似物編碼。
32.如權利要求31的DNA序列，該序列使甲硫氨酰基神經受體刺激因子編碼。
33.一種多肽，該多肽具有部份或全部的列于圖5中的氨基酸序列(序列標號4)并具有一種或多種天然存在的神經受體刺激因子的體內或離體外的生物活性。
34.一種多肽，該多肽具有部份或全部的天然存在的神經受體刺激因子的次級結構并具有部份或全部的列于圖5中的氨基酸序列(序列標號4)，以及具有一種或多種天然存在的神經受體刺激因子的生物活性。
35.一種DNA序列，該序列對選自下列物組的人體神經受體刺激因子的類似物進行編碼a)[Met-1]神經受體刺激因子;和b)其中的一個或多個半胱氨酸被丙氨酸或絲代替的神經受體刺激因子。
36.一種表達在根據權利要求35的DNA序列的原核或真核寄主細胞中的多肽產物。
37.一種具有一種或多種天然存在的神經受體刺激因子的生物活性的非天然存在的多肽，所說的多肽具有一種列于圖5中的氨基酸序列(序列標號4)，或其任一種衍生物、缺失類似物、取代類似物、加成類似物，其特征是該多肽為外源DNA序列的原核或真核表達的產物。
38.一種制備神經受體刺激因子的方法，該方法包括在適宜的營養條件下，使用根據權利要求17的DNA轉化或轉染的原核或真核寄主細胞生長，和分離所需的在所述載體中的DNA序列表達的多肽產物。
39.一種調節細胞增殖和分化的方法，該方法包括用有效量的重組體神經受體刺激因子來接觸該細胞。
40.權利要求39的方法，該方法是在哺乳動物中進行的。
41.權利要求40的方法，其中的哺乳動物是人。
42.一種增強修復和再生表達該神經受體的人體組織的方法，該方法包括施用有效量的重組體神經受體刺激因子。
43.權利要求42的方法，其中該組織選自胃腸的、呼吸的、泌尿的和生殖道的組織。
44.權利要求42的方法，其中該組織包括人體皮膚。
45.權利要求42的方法，其中該組織為神經組織。
46.一種治療在表達神經受體的人體組織中神經受體刺激因子缺乏癥的方法，該方法包括給患有這種缺乏癥的病人施用有效量的重組體神經受體刺激因子。
47.一種治療在腫瘤細胞表面上表達神經受體的哺乳動物腫瘤的方法，該方法包括給患有這種腫瘤的哺乳動物施用一定量的重組體神經受體刺激因子以有效地降低腫瘤的生長。
48.權利要求47的方法，其中的哺乳動物是人。
49.權利要求48的方法，該法用于治療選自由前列腺、卵巢、乳房、胃、肺、腎和皮膚癌所組成的組中的癌癥。
50.一種藥物組合物，該組合物含有有效量的重組體神經受體刺激因子和可藥用的稀釋劑、輔劑或載體。
51.一種通過用權利要求12的多肽進行的免疫作用而專門產生的抗體。
52.根據權利要求51的抗體，它是單克隆抗體。
53.一種生物活性組合物，該組合物含有共價聯接在水溶性聚合物上的權利要求1的多肽。
54.根據權利要求53的組合物，在其中該聚合物選自由聚乙二醇及聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物所組成物的物組。
55.一種探測人體細胞或組織中神經受體刺激因子mRNA欠表達或過表達的方法，該方法包括(a)從該細胞或組織中分離出RNA;;(b)用核酸探針與RNA接觸，所述核酸探針在適于該探針與核酸雜交的條件下是能與存在于神經受體刺激因子mRNA中的核酸序列雜交的;以及(c)確定該RNA和探針之間的雜交水平，作為鑒定該神經受體刺激因子mRNA的欠表達或過表達的指示。
全文摘要
公開了重組體神經受體刺激因子、該因子的類似物、對其編碼的DNA序列、以及制備方法。也公開了治療涉及神經受體表達紊亂的藥物組合物和方法。
文檔編號C07K16/00GK1080959SQ93106970
公開日1994年1月19日 申請日期1993年4月29日 優先權日1992年4月29日
發明者D·Z·文, E·佩利斯, Y·亞登 申請人:安姆根有限公司, 耶達研究及發展有限公司