專利名稱：新的活性化合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及一類新的活性化合物，它們的制備方法以及它們在治療上的用途。更具體地，本發明提供了用于產生T細胞免疫性的致免疫共軛物，該T細胞免疫性針對與腫瘤有關的碳水化合物結構或表達在感染病原體和/或感染宿主細胞上的碳水化合物結構。
以細胞為媒介的免疫性脊椎動物免疫系統對侵入肌體的微生物和惡性細胞始終是有效的。眾所周知，適應性免疫系統第二次遇到抗原要比第一次遇到抗原顯示出強得多的響應。這一事實可通過接種得到開發應用，其原理是誘發被稱為免疫記憶的長期免疫狀態。免疫記憶需要活化專屬于感染病原體的T細胞。T細胞通過識別-借助于T-細胞接收器(TCR)-來自于病原體的肽片段檢測出細胞內的感染。然而，大多數T細胞都是“MHC限制的”，即它們僅能識別結合在高度多形態膜蛋白上的，被主要組織相容性復合物(MHC)的Ⅰ類和Ⅱ類基因編碼的以及呈現在附屬細胞(指定為抗原呈現細胞或APC)表面上的肽的復合物，抗原在附屬細胞中處理。
根據粘接受體分子的種類，可將T細胞分類為CD4+或CD8+。CD4粘附接受體識別MHCⅡ類分子，CD8連接Ⅰ類分子;而且，對MHC的限制又進一步取決于MHC分子對TCR某些部位的直接鍵合(Jorgensen等，1992)。
CD4+T細胞(輔助性T細胞)激活巨噬細胞和產生抗體的B細胞，而CD8+T細胞(毒性T細胞，CTL)殺死被病毒和胞內細菌感染的細胞。抗原可通過兩種途徑中的一種產生，這取決于抗原的起源。在第一種途徑中，細胞外的異物被特殊的含抗原細胞(通常是巨噬細胞或B-細胞)吞噬，該含抗原細胞分解異物，使生成的抗原與Ⅱ類MHC分子相連。該復合體被運送至細胞表面并給予輔助性T細胞。第二種途徑通常涉及對在病毒感染的或惡性細胞內制備的蛋白質的處理。在細胞內處理這些蛋白質，也就是使這些蛋白質部分分解，從而形成肽碎片。然后，這些肽碎片與Ⅰ類MHC分子結合，被送至細胞表面給予毒性T細胞。
通過分離的途徑產生抗原具有生物學意義。從環境得到的這些抗原最終會誘發B細胞產生抗體，這些抗體能夠保護有機體免受外源性抗原的后續侵襲。另一方面，在畸型或不良細胞(例如病毒感染細胞或惡性細胞)中產生畸型結構的抗原的情況下，最好是使免疫系統激活，從而最終導致殺死不良細胞。
MHC-連接的肽最近幾年，對與MHCⅠ和Ⅱ類分子相結合的肽的分析有了顯著進步(綜述可參考例如Janeway，1991;Rotzschke & Falk，1991;Stauss，1991;Tsomides & Eisen，1991)。因此已發現，MHCⅠ類分子連接只含約8-12個氨基酸的短鏈肽，MHCⅡ類分子連接約10-17個氨基酸的肽。
進一步發現，從制備抗原產生的肽片段被轉移至細胞表面，該細胞表面連接于MHC分子的細胞外部分上的溝中。對于MHCⅠ型分子，發現位于沿肽鏈確切位置上的單氨基酸仙鏈連在鈦連接的溝中(Madden等，1991)。連接它們的這些袋囊和氨基酸的位置對于不同的等位基因變種可以不同。因此，不同的MHCⅠ類分子可以連接不同的組合肽鏈，并且為各種MHC等位基因找到了特定等位基因型主(Van Bleek & Nathenson，1990;Falk等，1991;Jardetzky等，1991)。例如，連接HLA-A 2.1的肽優選在2位含有L或M以及在9位，即C-端位置含有V或L(Rotzschke & Falk，1991)。
在鼠體中能夠連接MHCⅠ類分子的肽的例子是ASNENMETM和SGPSNTPPEI(SEQ ID NO1和2)，它們都存在于H-2-Db分子中。在人體中能夠連接MCHⅠ類分子的肽的一個實例是GILGFVFTL(SEQID NO3)，其存在于HLA-A2.1分子中(Falk等，1991)。
Elofsson等(1991)描述了將MHC(Ⅱ類)連接的肽DYGILQINSR(SEQ ID NO19)與碳水化合物4-O-α-D-吡喃半乳糖基-β-D-吡喃半乳糖相結合。
WO 89/07448披露了調節宿主免疫反應的組合物，使用了與鈦連接的MHCⅠ類分子同源的肽。
作為T細胞特定抗原決定基載體的合成肽CTLs可從涂覆三硝基氯苯(TNP)的小鼠脾制備，并為殺死TNP-涂覆的同源靶細胞而選擇。現已發現，一些如此制備的CTLs能夠識別短MHCⅠ類(Kb)鍵合的10氨基酸肽，對于該肽，TNP連到內部(6位)的賴氨酸殘基上。而且，一些CTLs可殺死處理和提供連在不同載體蛋白質(MSA、BSA和KLH)上的TNP的同源靶細胞，還可殺死TNP-涂覆的同種靶細胞(Ortmann等，1992)。
與腫瘤有關的抗原能夠從外部通過免疫系統(基于腫瘤細胞的畸型特征)識別腫瘤的可能性為發展有效的癌治療提供了很有價值的機會。在實驗系統中，腫瘤顯示出高的致免疫性，并且觸發的免疫反應足以使得腫瘤細胞減少。但在臨床階段，作為多重遺傳性和適應性變異產物的腫瘤，當其成為醫學上的難題時，卻具有很低的致免疫性。因此，幾乎沒有發現真正的與腫瘤有關的蛋白質抗原，即僅在腫瘤細胞中發生作用的抗原。
與缺乏同腫瘤有關的蛋白質抗原相反，針對腫瘤細胞提出了各種畸變的碳水化合物(CHO)結構(綜述參見Hakomori，1991)。在決定CHO鏈組合的酶系統中，這些碳水化合物是作為畸變的結果而形成的。由于CHO抗原決定基(在正常細胞上不存在或被掩蓋)在腫瘤細胞上的表達，這些CHO鏈常常被縮短。
畸變CHO結構在腫瘤細胞上以糖蛋白、糖脂的形式存在，或以這兩種形式的復合物形式存在。糖蛋白通常被分泌進入體液，而糖脂在很大程度上限于膜的范圍內。
與腫瘤有關的碳水化合物抗原的實例有GM3神經節苷脂，其已在小鼠黑瘤B16細胞里得到鑒定(Nores等，1987);與人黑瘤細胞有關的GD3神經節苷脂(Portoukalian等，1979);以及在Burkitt淋巴瘤細胞中得以表達Gb3神經節苷脂(Wiels Brodin等，1988)。
與傳染性疾病有關的碳水化合物與傳染性疾病有關的碳水化合物可在傳染性病原體、從這些病原體上分泌或脫出的物質或在感染宿主細胞表面上得以表達。
有一些被證實的或公認的碳水化合物類T細胞反應的實例，其與被感染病原體如鼠傷寒沙門菌(Robertsson等，1982)，利什曼原蟲屬菌(Moll等，1989)、白色念珠菌(Domer等，1989)和分枝桿菌(Crowle，1988)引起的疾病有關。
Hansen等(1990)描述了與HIV感染有關的碳水化合物抗原。
腫瘤的免疫療法腫瘤的免疫療法在醫學上已有很長的歷史，并嘗試過非專一性療法和專一性療法。在非專一性療法中，通過各種因子如BCG、IL-2等活化免疫系統，以便提高業已存在的對腫瘤的本底免疫性。在專一性療法中，使用腫瘤細胞或由此得到的物質培養疫苗。
以T細胞為中介的免疫反應在抗腫瘤免疫方面起著關鍵作用。盡管T細胞對蛋白質反應的活化機理在某種程度上(參見上文)已進行了表征，但對碳水化合物來說這種活化機理基本上是未知的。由于MHC蛋白質的肽連接溝施加的結構上的限制，對MHC分子來說，碳水化合物抗原是差的候選對象。然而，Ishioka等(1992)指出CHO部分可以成為能夠為T細胞識別的抗原決定簇的重要組成部分，并提出雖然存在對產生CHO特異性T細胞反應的限制，但這種反應仍能通過將碳水化合物地放入MHC-鍵合肽而產生。
Longenecker及其合作者(WO 88/00053;Henningson等，1987)描述了使用“合成的與腫瘤結合的糖共軛物”(S-TAG)刺激抗癌T細胞免疫性。在這些實驗中，將在大部分人腺癌上表達的合成的Thomsen-Friedenreich(TF)和Tn抗原、碳水化合物與載體蛋白質共軛，并用來說明遲發型超敏反應(DTH)效應體細胞能夠識別和與碳水化合物決定基相對應。由TF抗原組成的S-TAG偶合到載體(鎖眼
血蘭蛋白)上并用Ribi輔藥乳化，而后施于有TA3-Ha腺癌的小鼠。當給藥前用環磷酰胺處理時，觀察到有50-90%的宿主長時間存活(Fung等，1990)。
Thurin等(1991)描述了包含下列成分的共軛物;(ⅰ)關于腫瘤的碳水化合物半抗原;(ⅱ)含有病毒小鼠輔性T細胞抗原決定基的肽;以及(ⅲ)基于輔藥的Quil-A糖苷。用該共軛物免疫的小鼠顯示出對病毒抗原決定基半抗原及輔性T細胞反應性專一1gM反應。
本發明的主要目的是提供產生對碳水化合物結構的T-細胞免疫性，尤其是對碳水化合物抗原的抗腫瘤免疫性的方法。
雖然現有技術指出對碳水化合物抗原的抗腫瘤免疫性可用合成疫苗提高，但實踐過程中為此目的而取得的進展仍不能令人滿意。例如，Longenecker的S-TAG(在前面的段落中已有敘述)使用普通蛋白質作為碳水化合物結構的載體。該糖蛋白在其呈現在細胞表面以前須進行蛋白分解，這意謂著對最終產生TCR不能進行控制。而且，大的載體蛋白質含有幾個不同的抗原決定基，將競爭T細胞。
進一步說，盡管已進行了較多的研究，現有技術對研制癌癥免疫療法的努力還是取得了令人失望的結果。而且，現有技術中刺激對與碳水化合物有關的抗原的免疫反應只取得了有限的成功，尤其是在需要刺激對與疾病有關的碳水化合物結構的免疫反應的情況下更是如此，例如碳水化合物結構是在腫瘤細胞上表達的，而不是在正常細胞上表達的。
本發明優于現有技術的地方在于提供了一類新的含有MHCⅠ類結合肽以及碳水化合物結構的共軛物，該共軛物可特別用于能誘發抗腫瘤免疫性的合成疫苗的研究之中。而且本發明的共軛物能夠對該碳水化合物結構產生毒性T細胞反應而不是輔性T細胞反應。另外，本發明的共軛物可提供對(1)所產生的抗原決定基的特性以及(2)T細胞克隆的擴展的高度控制。
本發明的另一個目的是使用Ⅰ類MHC-鍵合肽制備碳水化合物特異T細胞，即毒性T細胞。按照本發明制備的碳水化合物特異T細胞不須要進行MHC-限制。因此，用某一個體制備的細胞可以與來自另一個體的細胞、來自同種甚至另一種屬的細胞反應。
按照本發明制備碳水化合物特異T-細胞與現有技術的實驗具有很大的不同。在現有技術中，制得的輔性T細胞反應是直接針對肽抗原決定基的，因為這里的半抗原與載體蛋白質共軛以獲得對半抗原的抗體反應;或者是Thurin等人將該概念擴展到限定的MHCⅡ類-鍵合肽的應用之中。
正如所指出的那樣，通過將能夠連接MHCⅠ類分子的適宜的肽共軛到適當的碳水化合物結構上達到了本發明的目的。將碳水化合物共軛到肽上最適宜的位置，碳水化合物抗原可以獲得對TCR的高的親和性，這就使得反應獨立于粘附載體，即T細胞將不受MHC限制。這將從毒性及輔性T細胞產生CHO-特異反應。
應用領域本發明的共軛物可用于治療惡性腫瘤疾病，包括黑瘤、乳腺癌、肺癌和胃腸癌，還可用于治療被感染劑引起碳水化合物靶分子表達的疾病。
本發明的共軛物可在體內用于誘導T細胞反應，以消除腫瘤和/或感染。它們還可在體外用于誘導T細胞反應，采用體外刺激技術，隨后將激活的T細胞用于病人。
根據要獲得的免疫反應的種類，共軛物可以一次給藥，或者如果必要的話，進行連續的常規的免疫作用。
本發明首先提供了能夠對碳水化合物結構產生T細胞免疫性的共軛物，所述共軛物包括(ⅰ)能夠鍵接MHCⅠ類分子的肽;和(ⅱ)帶有所述碳水化合物結構的致免疫特性的碳水化合物成分。
本發明還提供了在病人體內刺激產生毒性T細胞(CTL)的方法，其中所述的CTL有能力殺死或削弱呈現特性疾病的碳水化合物結構的細胞，該方法包括將有效劑量的本文定義的共軛物向病人給藥。
本發明還進一步提供了產生毒性T細胞(CTL)的方法，該毒性T細胞能夠殺死或削弱帶有與特性疾病有關的碳水化合物結構的疾病細胞，該方法包括將細胞群與本文定義的共軛物相接觸，所述的細胞群包括(a)帶有MHCⅠ類分子的細胞，該Ⅰ類分子能夠鍵接在所述共軛物的肽阻分上;和(b)能夠轉化為CTL的細胞，CTL具有所述的與帶有連在MHCⅠ類分子上的共軛物細胞(a)相互作用的能力。
CTL還可按照下述的方法的制備，即將肽/碳水化合物共軛物給藥于動物，這樣就在體內制得了CTL。另一方面，CTL還可在體外制備，即將從動物體取出的細胞與肽/碳水化合物共軛物相接觸。這樣制得的CTL可作為治療方法的一部分進行用藥(例如，可將其用于相同或不同的動物)。
本發明還提供了使用本文描述的肽/碳水化合物共軛物制備藥物組合物的方法。
更具體地說，本發明提供使用共軛物制備能夠病人所須要的免疫狀態的藥物組合物，其中所述的免疫狀態由所述共軛物與MHCⅠ類分子的相互作用得到，這樣免疫系統的細胞成分被刺激產生了與所述碳水化合物結構特別有關的反應。
本發明優選的肽組分、碳水化合物組分以及碳水化合物具有下面幾段所述的性質。
肽組分本發明的肽/碳水化合物共軛物的一個重要特點是，其肽組分應能夠鍵接MHCⅠ類分子。對于給定的肽，鍵接MHCⅠ類分子的能力可由幾種方法測定。例如，肽可帶有某些選擇的結構特征，如肽鏈的大小或在具體位置上存在特定的氨基酸殘基。另一方面，待選多肽鍵接MHCⅠ類分子的能力可通過一個或多個免疫實驗進行經驗性評價。再一方面，本發明肽/碳水化合物共軛物的肽組分可帶有與通過拆分天然存在的肽與MHCⅠ類分子間的復合物而分離出的肽基本上一致的序列。這些中每個表示肽對MHCⅠ類分子鍵合能力的因素將在下文更詳細地描述。
Science(257卷，1992，8，14)上發表的三篇文章(Fremont等，1992;Matsamura等，1992;和Latron等)在此引作具體的參考文獻。
這些文章描述了能夠鍵接MHCⅠ類分子的肽序列特征。對于MHCⅠ型分子，特別提到了鼠類MHCⅠ類分子H-2Kb和人類Ⅰ類分子HLA-A2(后者存在于約40%的人口中)。
與其鍵接一類特性識別肽能力有關的MHCⅠ類分子的特征是存在限制一毓通常為六個叫作“袋”的肽連接溝，這六個所謂的“袋”容納或固定可被鍵接的肽的結構單元。該肽連接溝或裂縫的側面被兩個α-螺旋結構限定，而其底面限定在β-褶面上。
在這六個袋(通常稱作A、B、C、D、E和F)中，一般有兩個用來分別容納肽的-NH2端和-COOH端。
共軛物的肽組分優選地選自具有連接MHCⅠ類分子的最佳數目氨基酸的肽，即具有5-25個氨基酸。尤其是8-12個氨基酸，所選擇的肽鏈的大小便于在肽連接溝中獲得適宜的連接。能夠在MHCⅠ類分子的溝中獲得充分連接的最佳肽鏈帶有8或9個氨基酸，特別優選帶有9個氨基酸的肽鏈。
本發明共軛物最優選的肽組分在C-端位置帶有一個疏水氨基酸，用來加強在F袋中的連接。肽組分的其他氨基酸優選地選自那些在肽連接裂縫中適于其他袋囊的氨基酸。正如Masazumi(1992)所描述的那樣，對適宜的和優選的氨基酸殘基的選擇可借助于基于計算機的分子模擬技術。
肽可通過已知的方法合成。通過化學改性可進一步提高共軛物中肽部分的致免疫性。包含該改性肽的共軛物也是本發明的一部分。
被合成的肽可選自那些文獻中已知的肽或選自那些其致免疫性已被已知方法確定的肽。在后一種情況下，肽可從全細胞溶解產物或從純化的MHC分子中離析出來，并通過例如高效液相色譜分離。肽對MHC分子的最佳連接體現為在抗原呈現細胞表面上的肽-MHC復合物的高度穩定性。
本發明進一步提供了制備上面定義的肽/碳水化合物共軛物的方法，其包括一個或多個下面的工藝步驟(a)通過合成肽的已知技術合成共軛物的肽組分(b)通過合成碳水化合物的已知技術合成共軛物的碳水化合物組分;
(c)在將肽組分共價偶合到碳水化合物組分上之前保護肽組分的一個或多個-COOH、-OH、-NH2或-SH基團;
(d)在將碳水化合物組分共價偶合到肽組分上之前保護碳水化合物組分的一個或多個-OH、-COOH、-NH2、-CHO或＝CO基團;
(e)活化碳水化合物組分中未被保護的-OH、-COOH、-NH2、-CHO或＝CO基團;
(f)活化肽組分中未被保護的-OH、-COOH、-NH2或-SH基團;
(g)使碳水化合物組分和肽組分中的至少一個與雙功能團連接試劑反應;
(h)使碳水化合物組分和肽組分進行共價反應形成所需要的共軛物，所述阻分被適宜地保護、活化和1或與雙功能團連接試劑反應;
(i)使中間保護的肽/碳水化合物共軛物進行去保護基步驟。
在本文中，“能夠鍵含MHC Ⅰ類分子”的肽可進一步定義為那些與MHC Ⅰ類分子的復合的肽，其在呈現抗原細胞表面上是穩定的。
上述復合物的穩定性可通過本領域技術人員熟知的體外實驗測定。由于復合物離解得很慢，其穩定性測定可在細胞表面上長時間進行。另一個反映高穩定性的特征是肽濃度很低情況下的靶細胞對相應CTL∶S的致敏作用。穩定性還可反映為，在體外和低摩爾濃度下，肽對某些靶細胞上相應Ⅰ類分子表達調節的能力。
當短鏈肽直接注入小鼠體內時，穩定性還與體內的高度致免疫性有關。
糖肽被MHC Ⅰ類分子連接的能力可通過設計的免疫實驗測定一種或多種下列性質來評價(1)糖肽連到溶解的MHL-Ⅰ上導致形成的復合物可采用常規的生化技術檢測，例如，用依賴于構型的單克隆抗體，或用與標記的β2-微球蛋白結合;
(2)當糖肽連到位于變異宿主細胞(RMA-S和T2細胞)表面上的空MHL-Ⅰ分子上后，對CHO部分進行表征，隨后CHO部分可被CHO特異的單克隆抗體如MC2101(Gal2特異)檢測;
(3)用MHC-Ⅰ特異性單克隆抗體通過糖肽調節相應的MHC-Ⅰ限制單元;
(4)糖肽的循環能力(參見下文第3部分-“內在化后外部的MHC-Ⅰ連接肽循環至細胞表面)。
為了進行這些測定，可使用能夠檢測MHC Ⅰ類分子的抗體及能夠檢測特定碳水化合物的抗體。后者的一個具體實例是市場上可以買到的單克隆抗體MC2102(New Biocarb，Lund，瑞典)，該抗體能檢測碳水化合物Gal2。
按照下述方法，這些步驟可用來評價給定的肽被連到MHC Ⅰ類分子上的能力。
首先合成糖肽，其中Gal2共價連到肽上。然后就可以在帶抗原靶細胞上測定糖肽連到MHC Ⅰ類分子上的能力，以及測定被表達的碳水化合物部分、即被連到構型上的情況，在構型中，Gal2表位處在可被特異性抗體檢測的位置上。另外，對相應MHC-Ⅰ限制單元的調節可通過測定帶抗原細胞與抗MHC Ⅰ類抗體的相互作用來評價。
共軛物的循環能力可通過在37℃培養細胞(連接共軛物)來評價，此時糖肽將內在化。然后可降低溫度，異用蛋白分解酶(如鏈霉蛋白酶)處理剝去暴露的肽/碳水化合物共軛物。再加熱時，通過使用抗-Gal2抗體探測Gal2抗原決定基可檢測到循環的共軛物。
在另一實驗中，共軛物可用免疫實驗檢測，并可評價其刺激形成CTL的能力。在對比實驗中，相對于肽組分(沒有碳水化合物組分)測定產生的CTL，用來說明觀察到的CTL-刺激與碳水化合物有關(參見下面的“實驗測定體系”)。
碳水化合物組分共軛物的碳水化合物部分可用已知方法合成，并優選地選自下列碳水化合物結構(a)能穩定地在靶細胞上表達，因此總是相同的部分被暴露在T細胞受體表面上;
(b)在靶細胞上具有較高的密度，這樣T細胞受體可以獨立于MHC的限制以及粘附受體而被引發;以及(c)具有較強的連接膜，這樣就可避免進入總循環的分泌。可是由于誘發T細胞的外圍抑制并阻止保護性免疫的產生，溶解的碳水化合物相對來說容易產生不良的結果。
選擇在靶細胞上具有高度表征性的碳水化合物的另一個優點是，該高度表征性可導致膜中的二次改性，從而提高暴露的CHO抗原決定基的靶細胞特異性。
碳水化合物的大小應使T細胞受體能夠包圍CHO抗原決定基。優選碳水化合物的尺寸是肽長度的一半。但本發明并不僅局限于此是肽長度的一半。
雖然并不排除單糖部分，但本發明共軛物的碳水化合物組分優選含有至少兩個連接的糖單元，即是二糖或低聚糖。連接的糖單元的精確數目取決于碳水化合物結構的致免疫特異性，但通常含有3、4、5或更多的連接的糖單元。
優選的碳水化合物組分的尺寸上限要符合這樣的要求，即其大小應能使T細胞受體同時包圍碳水化合物結構的抗原決定基以及Ⅰ類限制單元。一般的上限不超過10個糖單元;優選的不超過8個，最優選地不超過5個糖單元。因此，優選的范圍是1-10、更優選1-8、最優選1-5個糖單元。對每個上述的優選范圍，如果需要可將下限1提高至2、3、4、或5。
單個的糖單元優選地選自戊醛糖、戊酮糖;乙醛糖和己酮糖。它們可以是線性或環狀結構，如果需要，可通過氧化、還原、胺化、乙酰化或這些作用的組合制得。氧化作用包括將一個或多個-CH2OH基團轉化為-CHO或COOH基團，以及將-CHOH-基團轉化為-CH2-基團。還原作用包括這些轉化的任意逆轉化。戊醛糖包括D-核糖、D-阿糖、D-木糖和D-來蘇糖，以及這些糖的其他立體異構體，即L-異構體。己醛糖包括D-阿洛糖、D-阿卓糖、D-葡萄糖、D-甘露糖、D-古洛糖、D-艾杜糖、D-半乳糖和D-塔羅糖，以及這些糖的其他立體異構體，即L-異構體。戊酮糖包括D-核酮糖和D-木酮糖，以及這些糖的其他立體異構體，即L-異構體。己酮糖包括D-阿洛酮糖、D-果糖、D-山梨糖和D-塔格糖，以及這些糖的其他立體異構體，即L-異構體。當環化后，糖單元可呈α-或β-構型以及呈(如果合適的話)吡喃糖或呋喃糖形式。
最優選的碳水化合物組分所含的一個或多個糖單元，其選自那些通常存在于糖脂和糖蛋白中的糖部分的單元。這些糖單元包括β-L-果糖(Fuc)、β-D-半乳糖(Gal)、β-D-N-乙酰基半乳糖胺(Gal NAC)、β-D-N-乙酰基葡萄糖胺(Glc NAC)、β-D-甘露糖(Man)、神經氨糖酸(Neu)和唾液酸(Sia)。
與糖脂中神經節苷脂的球形的神經節系列的CHO部分相對應的碳水化合物組分是適宜的腫瘤靶的又一實例，因它們大部分是膜連接的并且不能被分泌(參見Oettgen，1989;第六章“與腫瘤有關的抗原的一般概念抗原的化學、物理和酶基礎”)。
連接相鄰糖單元的方式不是關鍵性的，也就是說，使用戊糖的1-5個碳原子中的任一個和己糖的1-6個碳原子的任一個均可進行鍵合。而且鍵合可以是α型或β型。最優選的鍵合涉及到3位和4位碳原子，并且優選鍵合β構型。
碳水化合物組分和肽組分可通過任意方便的方法共軛(或共價連接到一起)。在肽組分中包括帶羥基氨基酸(如在絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸中)的情況下，可以通過O-糖苷鍵。在肽組分中包括含有-NH2側鏈(如在天冬酰胺中)的氨基酸的情況下。鍵合可以通過N-糖苷鍵。
另一方面，連接會涉及到在碳水化合物組分和肽組分之間引入所謂的“間隔臂”。例如，在肽組分包括含有-SH側鏈的氨基酸(半胱氨酸)的情況下，碳水化合物組分可通過-(CnH2n)-O-鍵合到-SH側鏈上，其中n大于2，優選2-4。
碳水化合物組分在肽/碳水化合物共軛物中的位置應當優選地這樣選擇，即當連到MHC Ⅰ類分子上時，碳水化合物組分占據肽連接溝的大致中間位置，并且至少有部分碳水化合物組分從溝中伸出，使其呈現給CTL。
適于共軛的碳水化合物的實例與人類腫瘤或感染疾病有關的，并適于共軛的碳水化合物結構的實例在下列表1中給出。提到的腫瘤是為了舉例說明能用本發明的共軛物治療的癌癥種類。為了敘述的需要，術語“碳水化合物結構”應理解為包括舉例說明的碳水化合物的衍生物，如內酯和內酰胺。
表1與人類腫瘤有關的碳水化合物1.
51.1 大多數腫瘤Galβ4GlcβCer 乳糖酰基鞘氨醇1.2 黑瘤10 NeuAcα8NeuAcα3Galβ4GlcβCer GD39-O-Ac-GD3NeuAcα8NeuAcα3(GalNAcβ4)Galβ4GlcβCer GD29-O-Ac-GD2這些物質的內酰胺形式151.3 結腸癌和其他種類的癌:
GalNAcα-Ser(Thr)(糖蛋白) Tn-抗原NeuAcα6GalNAcα-Ser(Thr) 唾液基-Tn-抗原Galβ3GlcNAc 1型鏈20 NeuAcα3Galβ3(Fucα4)GlcNAcβ 唾液基Lewis aNeuAcα3Galβ3(Fucα4)[NeuAcα6]GlcNAcβ 二唾液基-Lewis aGalβ3(Fucα4)GlcNAcβGalβ3(Fucα4)GlcNAβ 二聚Lewis aNeuAcα3Galβ4(Fucα3)GlcNAβ 唾液基Lewis xGalβ4(Fucα3)GlcNAcβ3Galβ4(Fucα3)GlcNAcβ 二聚Lewis x25 Galβ4(Fucα3)GlcNAβ3Galβ4(Fucα3)GlcNAcβ3Galβ4(Fucα3)GlcNAcβ三聚Lewis xNeuAcα3-二聚Lewis xNeuAcα3-三聚Lewis xNeuAcα6-低聚Lewis x30在唾液酸的情況下這些物質的內酰胺形式
1.4肺癌和其他類型的癌Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ ⅰ-抗原(表示乳糖胺)Galβ3(Fucα4)GlcNAcβGalβ4(Fucα3)GlcNAcβ Lewis a-Lewis xFucα2Galβ3GalNAcβ4(NeuAcα3)Galβ4GlcβCer Fuc-GM1Fuc-GM1的內酰胺形式1.5Burkitt 氏淋巴瘤Galα4Galβ4GlcβCer Gb31.6乳腺癌Fucα2Galβ3GalNAcβ3Galα4Galβ4GlcβCer Fuc-GlobopentaTn-抗原唾液基-Tn-抗原1.7畸胎瘤NeuAcα3Galβ3GalNAcβ3Galα4Galβ4GlcβCer 唾液基Globopenta上述物質的內酯形式2.與實驗性腫瘤有關的碳水化合物2.1黑瘤(倉鼠)NeuAcα3Galβ4GlcβCer GM3GD39-O-Ac-GD3GD2這些物質販內酯形式2.2黑瘤(小鼠)GM3
GM3的內酯形式3.與感染病原體有關的碳水化合物得自白色念珠菌的甘露聚糖得自牛結核分枝桿菌BCG菌株的多糖離析物得自利什曼原蟲屬的磷脂聚糖得自鼠傷寒沙門菌的O-抗原性聚糖4.與HIV有關的碳水化合物Fucα2galβ4(Fucα3)GlcNAcβ Lewis yGalNAcα3(Fucα2)Galβ3GlcNAcβ A1血型NeuAcα6GalNAcα-Ser(Thr) 唾液基Tn-抗原GalNAcα-Ser(Thr) Tn-抗原共軛物的優選性質碳水化合物可以偶合到載體肽的氨端、羧端、或偶合到內部的氨基酸上。正如所指出的那樣，內部偶合是優選的。
而且，如上所述，特異固定型氨基酸，連在MHC分子上的袋囊中，在文獻中被確定為連接各種MHC分子的肽。這些固定型氨基酸最好不用于同碳水化合物結構的共軛。
當與載體肽共軛時，合成的碳水化合物應當具有高度的分子穩定性，以便高特異性地暴露碳水化合物的抗原決定基。碳水化合物在共軛物中的位置應當使T細胞受體能夠識別CHO抗原決定基，從而產生T細胞的最佳引發。
而且，CHO的大小和位置應當最有利于被TCR識別。尤其是被第三輔助性決定區域(CDR3)識別。優選的位置是位于糖肽的中心，但本發明并不限制于此。
CHO和肽可通過任意的連接單元共軛，這些連接單元可以是另外的氨基酸，如半胱氨酸，或是其他適宜的化合物。
實驗檢測系統本發明共軛物的致免疫性可用本領域技術人員熟知的免疫實驗測定。CHO特異性可通過“十字交叉”實驗分析對共軛物“CHO-A”反應的T細胞用CHO-A測定，其中A表示肽;用肽A單獨測定;用CHO-B測定，其中B表示不同于A的肽;以及單獨用肽B測定。例如，如果對CHO-A反應的CTL還殺死帶有CHO-B的細胞，但不能殺死僅帶有肽的細胞，可得出結論該反應是CHO-特異的。而且，T細胞可相對于糖脂形式中帶CHO部分的靶細胞進行測定。
藥物制劑本發明的共軛物可以常規的藥劑形式使用。當以疫苗形式使用時，優選地包括一種或多種適宜的輔藥。
已經發現，使用本發明的肽/碳水化合物共軛物可以導致共軛物連到細胞表面的空MHC分子上。這種連接之所以可能是因為糖肽已實際上被預先合成出來，即糖肽不必再進入細胞溶質進行合成。
另一方面，共軛物可以嵌入到能夠促使進入細胞溶質的結構之中，以便獲得與MHC分子的較早連接。這些結構可以是脂質體或“刺激免疫復合物”(iscoms)(Morein等，1984)。
下列實施例描述本發明共軛物的合成方法。
1.糖共軛物的制備1.1.糖肽的合成可通過例如偶合預先制備的間隔臂糖苷和含巰基官能團的肽合成糖肽。
于是，將半胱氨酸部分引入肽序列，利用半胱氨酸硫原子的親核性質在肽和以糖苷連到碳水化合物部分的親電間隔臂之間生成一個硫醚連接鍵。使用的間隔臂是3-溴-2-溴甲基丙-1-基(DIB)(Magnusson等，1982)和2-溴乙基(Dahmen等，1983b)基團。通過這種方法，可將代表各種抗原決定基的碳水化合物和抗原決定基偶合到同一個肽序列上。后者也可通過標準的肽合成技術獲得，并在共軛前進行生物活性評價。這樣就使合成肽所需的時間維持最短。
偶合反應在二甲基亞砜或N，N-二甲基甲酰胺中進行。
偶合前，使用N，N，N，N-四丁基氟化銨除去DIB基團中的氫溴酸(Magnusson等，1982)。得到的烯丙基溴再與含半胱氨酸的肽反應。由于副反應，如形成不反應的烯丙基溴，該方法不能得到用于回收的過量的碳水化合物衍生物。
當使用2-溴乙基糖苷時，碳酸銫用作促進劑(Dahmen等，1983b)。
偶合時需要的N，N，N，N-四丁基氟化銨或碳酸銫的用量取決于所用的肽中包括的三氟乙酸量。包括的三氟乙酸量隨肽的批量和結構而變化。溶劑的選擇和用量由肽的溶解性能決定。
偶合反應用HPLC監測，并通過加入含0.1%三氟乙酸的水中止。用制備HPLC純化得到的糖肽，而產物的分子量則用FABMS確定。
據報道，丙基溴和烯丙基溴都能與未被保護的肽中的半胱氨酸硫醇反應得到作為主要產物的S-烷基化肽。
在N，N-二甲基甲酰胺/二甲基亞砜/乙腈的混合物中和PH6-9的情況下，Yang等人(1991)使含有半胱氨酸的八肽和十五肽與法尼基溴反應制得法尼基化的肽。N，N-二異丙基乙胺被用作促進劑。據報道，即使在PH10-12時也生成全部的S-烷基化產物。
含半胱氨酸的肽的選擇的S-烷基化還可使用各種烷基化試劑，如一級溴丙基衍生物，在甲醇胺或乙醇胺中進行(Or等人，1991)。
1.2.間隔臂苷的合成(

圖1和2)用于偶合的間隔臂糖苷舉例說明如下NeuNAcα3Galβ4Glc(3″-唾液基乳糖)的DIBβ-糖苷和2-溴乙基β-糖苷、Galα4Gal和Galα4Galβ4Glc的2-溴乙基β-糖苷以及“GM3內酰胺”的2-溴乙基糖苷(分別是化合物9、15、28、48和55)。
3″-唾液基乳糖的DIBβ-糖苷(9)可從2-三甲基硅基乙基2，3，6-三-O-乙酰基-4-O-(2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖基)-β-D-吡喃葡糖苷(1)用11個步驟合成(Jansson等，1988)。對(1)去乙酰基化得到(2)，對(2)進行異亞丙基化和芐基化得到芐基保護的3′，4′-O-異亞丙基乳糖衍生物(3)。水解3′，4′-縮醛得到總產率為51%的糖基受體(4)。在乙腈中和-23℃下對乳糖衍生物(4)進行糖基化(Marra和Sina
，1990)使用唾液酸甲酯的乙酰基保護的α-黃原酸酯(5)(Marra和Sina
，1989)作為糖基給體，使用三氟甲基磺酸的二甲基(甲硫基)硫鎓鹽(DNTST)作為促進劑，在去芐基和乙酰基化后得到產率為17.5%的三糖衍生物(6)。當反應產物的不反應羥基官能團的乙酰基化在芐基醚氫解前進行時，(6)的純化難易程度和其產率可得到少許的改善。將2-三甲基硅基乙基糖苷(6)轉化為相應的1β-乙酸酯(7)(Jansson等，1988)，(7)在路易斯酸催化的3-溴-2-溴甲基丙-1-醇的糖基化中用作糖基給體，得到保護的β-糖苷(8)，產率46%。先用甲醇鈉再用甲醇鈉-氫氧化鈉水溶液除去(8)的保護基，得到3″-唾液基乳糖的DIBβ-糖苷(9)。對(9)去除HBr后得到相應的2-溴甲基丙-2-烯-1-基糖苷，其用作與肽的偶合。
3″-唾液基乳糖的2-溴乙基β-糖苷(15)也可以通過五個順序步驟從乙酰基保護的乳糖的2-溴乙基糖苷(10)合成(Magnusson等，1982)。對(10)去乙酰基化得到(11)，對(11)異亞丙基化(Catelani，1988)得到產率為86%的3′，4′-O-異亞丙基衍生物(12)。在-60℃部分苯甲酰化(Murase等，1989)，接著水解3′，4′-縮醛得到產率為31%的2，6，6′-三-O-苯甲酸酯(13)。使用黃原酸酯(5)作為糖基給體以及三氟甲基磺酸的甲基硫鎓鹽作為促進劑，對乳糖衍生物(13)在-60℃進行糖基化(L
nn和Stenvall，1992)得到保護的三糖衍生物(14)，產率75%。象對(8)那樣對(14)去保護基得到產率為96%的2-溴乙基糖苷(15)。
1.3.實驗除非另有說明，用Varian Gemimi 300分光計分別在300和75MHz并在CDCl3中記錄1H-和13C-NMR譜，分別在7.25和77.0ppm的未氘代溶劑信號用作內參信號。
用Perkin Elmer 241旋光儀測定旋光度。
在Merch DC-Fertigplatten(硅膠60 F2540.25mm)上進行薄層色譜實驗，通過噴涂10%硫酸并接著在高溫下碳化和/或噴涂鉬磷酸/CeSO4/稀硫酸并接著加熱來觀察色譜點(Renaud和Seebach，1986)。MatrexTM硅膠Si0.35-0.70μ用于制備色譜。
使用Beckman System Gold色譜系統在Beckman Ultrasphere C-18(4.6×150mm)柱上用含0.1%三氟乙酸的乙腈-水混合物進行HPLC實驗。對于制備性的操作，使用Beckman Ultraprep C-18(10μ，21.2×150mm)柱。色譜214mm操作。
2-三甲基甲硅烷基乙基4-O-β-D-吡喃半乳糖基-β-D-吡喃葡糖苷(2)將2-三甲基甲硅烷基乙基2，3，6-三-O-乙酰基-4-O-(2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖基)-β-D-吡喃葡糖苷(1)(Janssan等，1988)(29.4g，40mmol)在甲醇鈉(5.8mM，515ml)中攪拌15小時。用乙酸中和，蒸發并用乙醇結晶得到(2)(14.6g，82%)。
m.p.175-177℃[α]D22+18.5°(c 1.0，水)1H-NMR(D2O，(CH3)3Si(CD2)2COONa)δ4.51(d，1H，J＝8Hz，H-1/H-1′)，4.46(d，1H，J＝7.5Hz，H-1/H-1′)，4.10-3.50(13H)，3.30(t，1H，J＝8.5Hz)，1.09(td，1H，J＝13，13和6Hz，CH2Si)，0.98(td，1H，J＝13，13和5.5Hz，CH2Si)，0.04(s，(CH3)3Si)ppm.
13C-NMR(D2O，(CH3)3Si(CD2)2COONa)δ105.7(C-1/C-1′)，104.2(C-1/C-1′)，81.2，78.2，77.6，77.4，75.7，75.4，73.8，71.4，71.2，63.8，62.9，20.4(CH2Si)，0.4((CH3)3Si)ppm。
2-三甲基甲硅烷基乙基2，3，6-三-O-芐基-4-O-(2，6-二-O-芐基-3，4-O-亞異丙基-β-D-吡喃半乳糖基)-β-D-吡喃葡糖苷(3)向化合物(14.5g，32.9mmol)在2，2-二甲氧基丙烷(250ml)中的溶液中加入對甲苯磺酸-水合物(1.6g)。攪拌該混合物165分鐘，然后加入三乙胺(9ml)，再蒸發混合物。剩余物(含縮醛混合物)用5%乙酸水溶液(100ml)處理50分鐘，再蒸發得到(依據TLC)主要產物和微量的次要成分(估計可能是4′，6′-縮醛)。
將粗產物(15.5g)的一部分(11.9g，25.3mmol)在氮氣下溶于干燥的N，N-二甲基甲酰胺中。加入氫化鈉(60%，6.16g，154mmol)，攪拌混合物達1小時。然后在15分鐘時間內加入芐基溴(21ml，177mmol)，繼續攪拌14小時，向混合物中加入甲醇，接著加水，然后使混合物在二氯甲烷和水之間分配。水相用二氯甲烷萃取一次，合并的有機相經干燥(Na2SO4)、過濾和蒸發。再通過色譜分離(甲苯-乙酸乙酯)得到糖漿狀的化合物3(15g，73%)。D22+16.5°(c 1.2，氯仿)1H-NMR δ7.45-7.25(25H，Ar-H)，5.0-4.3(12H，異頭物和芐基信號)，4.15-3.90(4H)，3.85-3.30(10H)，1.42(s，3H，CH3)，1.37(s，3H，CH3)，1.14-0.97(m，2H，CH2Si)，0.05(s，(CH3)3Si)ppm.
13C-NMRδ139.3，139.0，138.8，138.7，138.6，128.5-127.4，109.9((CH3O)2C)，103.3(C-1/C-1′)，102.0(C-1/C-1′)，83.1，82.0，80.7，79.9，75.4，75.1，74.9，73.6，73.4，73.2，72.0，68.9，68.34，67.3，27.8，26.2，18.3(CH2Si)，-1.7((CH3)3Si)ppm。
2-三甲基甲硅烷基乙基2，3，6-三-O-芐基-4-O-(2，6-二-O-芐基-β-D-吡喃半乳糖基)-β-D-吡喃葡萄苷(4)將在80%乙酸水溶液(110ml)中的化合物3(14.9g，15.9mmol)在80℃下攪拌30分鐘，然后蒸發。通過色譜分離(甲苯-乙酸乙酯4∶1)得到化合物4(12.3g，86%)。分析樣品用庚烷結晶。
m.p.98.8-100.1℃[α]D22+15.6°(c 1.4，氯仿)1H-NMRδ7.45-20(25H，Ar-H)，5.05-4.56(7H)，4.50-4.35(5H)，4.10-3.30(14H)，2.53(bs，1H，OH)，2.45(bs，1H，OH)，1.13-0.97(m，2H，CH2Si)，0.04(s，(CH3)3Si)ppm。
13C-NMRδ139.4，139.0，138.6，138.5，138.2，128.7-127.4，103.3(C-1/C-1′)，102.7(C-1/C-1′)，82.9，82.6，80.1，76.7，75.2，74.1，74.9，73.5，73.46，73.2，72.8，68.8，68.6，68.4，67.4，18.3(CH2Si)，-1.7((CH3)3Si)ppm。
2-三甲基甲硅烷基乙基2，3，6-三-O-乙酰基-4-O-｛2，4，6-三-O-乙酰基-3-O-[(5-乙酰胺基-4，7，8，9-四-O-乙酰基-3，5-二脫氧-D-甘油基-α-D-半乳糖基-2-壬酮吡喃糖)羧酸甲酯]-β-D-吡喃半乳糖基｝-β-D-吡喃葡糖苷(6)在氮氣下，將干燥乙腈(114ml)中化合物4(8.8g，9.9mmol)、化合物5(2.93g，4.9mmol)和粉末狀分子篩(3A，12g)冷卻至-23℃。攪拌下向該混合物加入三氟甲磺酸二甲基(甲硫基)硫鎓鹽(Marra和Sina
，1990)(25.7mmol)的乙腈(50ml)溶液(50ml)，反應混合物在-23℃下攪拌2小時，然后用硅藻土過濾，并在飽和的碳酸氫鈉水溶液和二氯甲烷之間分配。用二氯甲烷萃取水相一次，合并的有機相經干燥(Na2SO4)，過濾和蒸發。并通過色譜分離(甲苯-乙酸乙酯-甲醇，35∶35∶1)得到含有一個主要成分和兩個次要成分的級分(1.96g)。在乙酸酐-吡喃(1∶1)中乙酰化12小時，蒸發后得到粗產物，對該粗產物在35psi下和冰醋酸中用10%鈀/碳作為催化劑(50ml乙酸、0.75g10%Pd/C(每克基礎物)氫化4.5小時。過濾、蒸發并通過色譜分離(甲苯-乙醇，6∶1)得到主要級分。對該級分象上面那樣乙酰化。再經色譜分離(甲苯-乙醇，18∶1→10∶1)，得到無定形化合物6(1.0g，17.5%)。D22-8.8°(C1.2，氯仿)
1H-NMR δ5.54(ddd，1H，J＝9.5，5.0和2.5Hz，H-8″)，5.38(dd，1H，J＝9.5和2.8Hz，H-7″)，5.17(t，1H，J＝9.5Hz，H-3)，5.08(d，1H，J＝10.5Hz，NH)，4.97-4.82(4H，H-2，H-2′，H-4′，H-4″)，4.62(d，1H，J＝8Hz，H-1′)，4.54-4.37(4H，特別是H-1，H-3′)，4.18(dd，1H，J＝12和5.5Hz)，4.1-3.8(10H)，3.83(s，CH3O)，3.65-3.49(3H)，2.58(dd，1H，J＝12.5和4.5Hz，H-3″ekv.)，2.23，2.15，2.07，2.05，2.03，2.02，2.0和1.84(單峰每個3H，CH3CO)，2.06(s，6H，2×CH3CO)，1.67(t，1H，J＝12.5Hz，H-3″ax)，1.01-0.81(m，2H，CH2Si)，-0.015(s，(CH3)3Si)ppm.
13C-NMRδ171.2，170.9(2C)，170.8，170.7，170.5，170.1，170.0，169.94，169.88，168.3(C-1″)，101.1(C-1/C-1′)，100.0(C-1/C-1′)，96.8(C-2″)，76.4，73.6，72.5，72.0，71.9，71.4，70.4，69.9，69.3，67.7，67.4，67.3，66.9，62.3，62.2，61.4，53.0(CH3O)，49.0(C-5″)，37.2(C-3″)，23.0，21.3，20.7-20.4，17.7(CH2Si)，-1.8((CH3)3Si)ppm。
元素分析對C49H72NO29Si的計算值C，50.4;H，6.2;N，1.2.實驗值C，50.3;H，6.4;N，1.2。
1，2，3，6-四-O-乙酰基-4-O-｛2，4，6-三-O-乙酰基-3-[(5-乙酰胺基-4，7，8，9-四-O-乙酰基-3，5-二脫氧-D-甘油基-α-D-半乳糖基-2-壬酮吡喃糖)羧酸甲酯]-β-D-吡喃半乳糖基｝-β-D-吡喃葡糖苷(7)將化合物6(840mg，0.72mmol)溶于甲苯(5.6ml)和乙酸酐(1.06ml)的混合物中，向該溶液中加入醚合三氟化硼(0.36ml，2.91mmol)的甲苯(2.04ml)溶液(1.45ml)。攪拌反應混合物140分鐘，然后將其在二氯甲烷和飽和碳酸氫鈉水溶液之間分配。水相用二氯甲烷萃取一次，合并的有機相經干燥(Na2SO4)、過濾和蒸發得到粗產物(7)(815mg)。用甲醇結晶得到化合物7(586mg)。母液經色譜分離(甲苯-乙醇，20∶1→10∶1)得到另外的化合物(7)(154mg)。(7)的總產量為740mg(92%)。根據NMR，化合物(7)中包含了結晶時用的甲醇，其摩爾比為0.5摩爾甲醇對1摩爾(7)。NMR檢測到少于5%的1-α差向異構體。D22-0.2°(c 1.9，氯仿)1H-NMRδ5.67(d，1H，J＝8.5Hz，H-1)，5.51(ddd，1H，J＝9.5，4.5和2.5Hz，H-8″)，5.40(dd，1H，J＝9.5和2.5Hz，H-7″)，5.22(t，1H，J＝9Hz，H-3)，5.08(d，1H，J＝10.5Hz，NH)，5.04(dd，1H，J＝9.5和8.5Hz，H-2)，4.96-4.83(3H，H-2′，H-4′和H-4″)，4.65(d，1H，J＝8Hz，H-1′)，4.50(dd，1H，J＝10.5和3.5Hz，H-3′)，4.42(dd，1H，J＝12.5和2Hz，H-9″)，4.42(dd，1H，J＝12.5和＜2Hz，H-6/H-6′)，4.20(dd，1H，J＝12和5Hz，H-9″)，4.08-3.80(9H)，3.84(s，CH3O)，3.75(ddd，1H，J＝10.5和2Hz，H-5/H-5′)，3.62(dd，1H，J＝11和3Hz，H-6/H-6′)，3.45(d，1.5H，J＝5.5Hz，CH3OH)，2.57(dd，1H，J＝12.5和5Hz，H-3″ekv.)，2.24-1.83(CH3CO信號)，1.67(t，1H，J＝12.5Hz，H-3″ax.)，1.09(q，0.5H，J＝5.5Hz，(CH3OH)ppm。
13C-NMR((測定經過色譜分離的，不含甲醇的樣品))δ171.2，170.9，170.7，170.66，170.61，170.5，169.94，169.9，169.8，169.2，168.2，101.0(C-1′)，96.8(C-2″)，91.6(C-1)，75.7，73.5，73.1，71.9，71.3，70.6，70.4，69.8，69.2，67.7，67.2，66.7，62.0，61.8，61.5，53.2(CH3O)，49.0(C-5″)，37.2(C-3″)，22.9，21.3，20.7，20.6，20.5，20.5，20.4ppm。
3-溴-2-溴甲基丙-1-基2，3，6-三-O-乙酰基-4-O-｛2，4，6-三-O-乙酰基-3-O[(5-乙酰胺基-4，7，8，9-四-O-乙酰基-3，5-二脫氧-D-甘油基-α-D-半乳糖基-2-壬酮吡喃糖)羧酸甲酯]-β-D-吡喃半乳糖基｝-β-D-吡喃葡糖糖苷(8)將化合物7(0.96g，0.86mmol)和3-溴-2-溴甲基丙-1-醇(Ansari等，1987)(1.5g，6.5mmol)溶于干燥二氯甲烷(30ml)中，然后冷卻至0℃。加入醚合三氟化硼(1.9ml，15mmol)，在0℃下攪拌該混合物40分鐘。除去冷卻浴，繼續攪拌5小時。然后用二氯甲烷稀釋混合物，并用冰冷的飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌。二氯甲烷相經干燥(Na2SO4)、過濾和蒸發。并經過色譜分離(甲苯-乙醇，20∶1→12∶1)，得到無定形的化合物8(512mg，46%)。D22-0.5(c 2.6，氯仿)1H-NMRδ5.54(ddd，1H，J＝9.5，5和2.5Hz，H-8″)，5.40(dd，1H，J＝9.5和3Hz，H-7″)，5.19(t，1H，J＝9.5Hz，H-3)，5.04(d，1H，J＝10Hz，NH)，4.97-4.82(4H)，4.67(d，1H，J＝8Hz，h-1′)，4.54-4.37(4H)，4.19(dd，1H，J＝12和5.5Hz，H-9″)，4.10-3.80(10H)，3.84(s，CH3O)，3.66-3.42(8H)，2.58(dd，1H，J＝12.5和4.5Hz，H-3ekv.)，2.38-2.22(m，CH(CH2Br)2)，2.24(s，3H)，2.16(s，3H)，2.10(s，3H)，2.08(s，6H)，2.07(s，3H)，2.06(s，6H)，2.04(s，3H)，2.00(s，3H)，1.85(s，3H)，1.68(t，1H，J＝12.5Hz，H-3″ax.)ppm。
13C-NMRδ171.1，170.94，170.9，170.7，170.6，170.6，170.5，170.0，169.97，169.7，169.8，166.2(C-1″)，101.1，100.8，96.8(C-2″)，76.2，73.1，72.7，72.0，71.6，71.3，70.4，69.6，69.2，69.1，67.7，67.2，66.8，62.1，61.4，53.0(CH3O)，47.0(C-5″)，42.4(CH(CH2Br)2)，37.2(C-3″)，32.7(CH2Br)，31.6(CH2Br)，22.9，21.3，20.7，20.5，20.4，20.4ppm。
3-溴-2-溴甲基丙基4-O-｛3-O-[(5-乙酰胺基-3，5-二脫氧-D-甘油基-α-D-半乳糖基-2-壬酮吡喃糖)羧酸鈉]-β-D-吡喃半乳糖基｝-β-D-吡喃葡糖苷(9)將化合物8(384mg，0.30mmol)溶于甲醇鈉(0.03M，60ml)并攪拌過夜。加入水(100μl)，用二氧化硅中和混合物，經過濾、濃縮和色譜分離(氯仿-甲醇-水，65∶53∶6)，得到無定形的化合物9(189mg，74%)。D22-3.4°(c 0.3，甲醇)1H-NMR(CD3OD)δ4.44(d，1H，J＝8Hz，H-1/H-1′)，4.31(d，1H，J＝8Hz，H-1/H-1′)，2.86(dd，1H，J＝12.5和3.5Hz，H-3″ekv.，實際上是偶合的)，3.43-2.31(m，1H，CH(CH2Br)2)，2.02(s，3H，NCOCH3)，1.73(bt，1H，J＝12.5Hz，H-3″ax.，實際上是偶合的)ppm。
13C-NMR(CD3OD)δ175.5，174.9，105.1(C-1/C-1′)，104.6(C-1/C-1′)，101.1(C-2″)，54.0(C-5″)，44.4(CH(CH2Br)2)，42.1(C-3″)，33.9(CH2Br)，33.7(CH2Br)，22.7(NCOCH3)ppm。
2-溴乙基4-O-β-D-吡喃半乳糖基-β-D-吡喃葡糖苷(11)按照Dahmen等人(1983b)的方法制備2-溴乙基4-O-(2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖基)-2，3，6-三-O-乙酰基-β-D-吡喃葡糖苷(0.17mmol)。該粗產物溶于甲醇鈉(0.01M，1L)并攪拌3小時。混合物用二氧化硅中和，經過濾、濃縮、色譜分離(二氯甲烷-甲醇-水，65∶20∶3)，并用乙醇結晶，得到化合物11(37g，51%)。
m.p.151-152℃1H-NMR(D2O，丙酮)δ4.57(d，1H，J＝8.0Hz，H-1)，4.45(d，1H，J＝8Hz，H-1′)，4.26-4.19(m，1H，OCH2CH2Br)，3.98(dd，1H，J＝12.5和1Hz，H-6/H-6′)，3.93(d，1H，J＝3.5Hz，H-4′)，3.55(dd，1H，J＝10和8Hz，H-2′)，3.40-3.30(m，1H，H-2)ppm。
13C-NMR(D2O，丙酮)δ105.7(C-1′)，104.9(C-1)，75.5(C-2′)，73.7(C-2)，71.3(C-4′)，63.8(C-6/C-6′)，62.9(C-6/C-6′)，33.9(CH2Br)ppm。
2-溴乙基4-O-(3，4-O-亞異丙基-β-D-吡喃半乳糖基)-β-吡喃葡糖苷(12)將化合物11(35g，78mmol)和對甲苯磺酸(1.5g，8mmol)在2，2-二甲氧基丙烷(800ml)中的混合物在50℃下攪拌1小時，然后在室溫下攪拌過夜。加入三乙胺(12ml，80mmol)，攪拌混合物30分鐘，濃縮，并用甲苯蒸發，除去過量的三乙胺。粗產物溶于甲醇-水(10∶1，900ml)，并回流2小時。加入飽和的碳酸氫鈉水溶液(20ml)，并濃縮混合物。經快速色譜分離(氯仿-甲醇-三乙胺，10∶1∶0.01)和用乙醇結晶得到化合物12(32.7g，86%)。
m.p.171-172℃[α]D22+11.1(c 0.7，甲醇)。
1H-NMR(D2O，丙酮)δ4.56(d，1H，J＝8Hz，H-1)，4.49(d，1H，J＝8.5Hz，H-1′)，4.37(dd，1H，J＝5.5和1.5Hz，H-4′)，3.51(dd，1H，J＝8和8.0Hz，H-2′)，3.36(dd，1H，J＝9.0和8Hz，H-2)，1.55(s，3H，CH3)，1.40(s，3H，CH3)ppm.
13C-NMR(D2O，丙酮)δ113.7((CH3)2C)，104.9(C-1/C-1′)，81.4(C-5)，81.3(C-3′)，77.5(CH2CH2Br)，77.0(C-3)，76.5(C-4′)，76.2(C-5′)，75.5(C-2/C-2′)，63.5(C-6/C-6′)，62.8(C-6/C-6′)，33.8(CH2CH2Br)，29.9(CH3C)，28.1(CH3C)ppm。
元素分析對C17H29BrO11的計算值C，41.7;H，6.0實驗值C，41.5;H，6.0。
2-溴乙基2，6-二-O-苯甲酰基-4-(6-O-苯甲酰基-β-D-吡喃半乳糖基)-β-D-吡喃葡糖苷(13)
將化合物12(9.0g，18.4mmol)溶于干燥吡啶(60ml)和二氯甲烷(150ml)的混合物中，并冷卻至-50℃。在3小時內滴加在干燥二氯甲烷(150ml)中的苯甲酰氯(10.5ml 90.6mmol)，混合物再繼續攪拌1小時。然后加入甲醇，濃縮溶液。將殘余物溶于二氯甲烷(500ml)，并用鹽酸(2M，250ml)，和飽碳酸氫鈉水溶液(250ml)和飽和氯化鈉水溶液(250ml)洗滌，干燥(Na2SO4)，濃縮。粗產物溶于80%乙酸水溶液(250ml)，在80℃下攪拌30分鐘，然后濃縮。經色譜分離(二氯甲烷-甲醇，30∶1)得到無定形的化合物13(4.3g，31%)。D22+15.8°(c 1.0，氯仿)。
1H-NMRδ8.24-8.02(m，15H，Ar-H)，5.19(dd，1H，J＝9.5和8Hz，H-2)，4.84(dd，1H，J＝12.0和1.5Hz，H-6/H-6′)，4.66(dd，1H，J＝12和3.5Hz，H-6/H-6′)，4.64(d，1H，J＝8Hz，H-1)，4.48(dd，1H，J＝12.0和6Hz，H-6/H-6′)，4.37(dd，1H，J＝12和9Hz，H-6/H-6′)，4.35(d，1H，J＝8Hz，H-1′)ppm.
13C-NMRδ166.8，166.6，165.5，104.1(C-1′)，101.0(C-1)，81.7，73.5，73.2，73.1，73.02，72.96，70.8，69.6，68.9，64.1(C-6/C-6′)，63.9(C-6/6′)，29.6(OCH2CH2Br)ppm。
元素分析對C35H37BrO14的計算值C，55.2;H，4.9。實驗值C，55.2;H，4.9。
2-溴乙基2，6-二-O-苯甲酰基-4-O-｛6-O-苯甲酰基-3-O-[(5-乙酰胺基-4，7，8，9-四-O-乙酰基-3，5-二脫氧-D-甘油基-α-D-半乳糖基-2-壬酮吡喃糖)羧酸甲酯]-β-D-吡喃半乳糖基｝-β-D-吡喃葡糖苷(14)在氬氣下，將化合物13(200mg，0.26mmol)、化合物5(263mg，0.44mmol)和粉末狀分子篩(3A，300mg)在乙腈和二氯甲烷(9∶4，8ml)的混合物中的溶液攪拌1小時。加入三氟甲基磺酸銀(118mg，0.45mmol)，將反應混合物冷卻至-60℃。在5分鐘內滴加甲基亞磺酰溴(Dasgupta和Garegg，1988)的二氯甲烷溶液(3.48M，126μl，0.44mmol)，然后攪拌混合物1小時。加入二異丙胺(0.7ml，2.6mmol)，繼續攪拌0.5小時。混合物升至0℃，過濾、濃縮、經色譜分離(氯仿-甲醇，50∶1)得到無定形的化合物14(244mg，75%)。D22+14.9°(c 1.0，氯仿)1H-NMRδ5.33(m，1H，H-8″)，5.28(dd，1H，J＝8.0Hz，H-7″)，5.26(dd，1H，J＝9.5Hz，H-2)，5.03-4.93(m，2H，H-4″，H-6/H-6′)，4.74(dd，1H，J＝12和3.5Hz，H-6/H-6′)，4.70(d，1H，J＝8Hz，H-1)，4.59(d，1H，J＝8Hz，H-1′)，4.50(dd，1H，J＝12和6Hz，H-6/H-6′)，2.70(dd，1H，J＝13.0和4.5Hz，H-3″ekv.)ppm。
(H-3，H-2′和H-4′在14乙酰化后移至低場13C-NMRδ170.7，170.4，170.3，170.1，170.1，168.1(C-1″，JC-1″-H-3″ax＝6.1Hz)，166.6，166.1，165.4，104.4(C-1′)，101.1(C-1)，97.6(C-2″)，82.2，76.4，73.4，73.0，72.9，63.7，63.4，62.4(C-6，C-6′，C-6″)，53.2(CH3O)，49.6(C-5″)，37.6(C-3″)，29.6(OCH2CH2Br)，23.1(NCOCH3)，21.0，20.7，20.6，20.5ppm。
元素分析對C55H64BrNO26的計算值C，53.5;H，5.2。實驗值C，53.5;H，5.5。
2-溴乙基4-O-｛3-O-[(5-乙酰胺基-3，5-二脫氧-D-甘油基-α-D-半乳糖基-2-壬酮吡喃糖)羧酸鈉]-β-D-吡喃半乳糖基｝-β-D-吡喃葡糖苷(15)化合物14(200mg，0.16mmol)溶于甲醇鈉(0.03M，50ml)，并攪拌6小時。加入50μl水，攪拌混合物5分鐘，用二氧化硅中和、經過濾、濃縮和色譜分離(氯仿-甲醇-水，6∶4∶1)得無定形的化合物25(118mg，96%)。D22-0.9(c 1.0，水)1H-NMR(D2O，丙酮)δ4.57(d，1H，J＝8Hz，H-1/H-1′)，4.54(d，1H，J＝8.5Hz，H-1orH-1′)，2.77(dd，1H，J 12.2和4.3Hz，H-3e″，2.03(s，3H，NCOCH3)，1.81(bt，1H，H-3a″).
13C-NMR(D2O，丙酮)δ177.0，176.7，105.6(C-1′)，105.1(C-1)，102.8(C-2″)，54.7(C-5″)，42.7(C-3″)，34.0(OCH2CH2Br)，25.0(NCOCH3)ppm。
2-溴乙基4-O-(α-D-吡喃半乳糖基)-β-D-吡喃半乳糖苷(28)通過醚合三氟化硼催化的相應八乙酸酯的糖苷化(Dahmen等，(1983a)P.113)(1.25g，異頭物混合物)制備2-溴乙基-2，3，6-三-O-乙酰基-4-O-(2，3，4，6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃半乳糖基-β-D-吡喃半乳糧苷(27)。將粗產物懸浮于甲醇(20ml)中，加入甲醇鈉(0.2M，4ml)，30分鐘后得到透明的溶液。反應混合物繼續攪拌30分鐘，然后用二氧化硅中和。經過濾、蒸發和色譜分離(氯仿-甲醇-水，65∶35∶6)得到化合物28(335mg，41%)。D22+69°(c 1.0，甲醇)1H-NMR(CD3OD)δ特別是4.76(d，1H，J＝2Hz，H-1′)，4.15(d，1H，J＝7Hz，H-1)，4.09(bt，1H，J＝6Hz)，3.92(dt，J＝11.5和6.5Hz)ppm.
13C-NMR(CD3OD)δ105.2，102.5，79.2，76.2，74.6，72.7，71.3，71.1，70.7，62.7，61.1，30.9ppm.
13C-NMR(D2O)，以丙酮33.19ppm作參考)δ105.9，103.2，80.0，78.1，75.2，73.8，73.7，73.1，72.1，72.0，71.6，63.5，63.0，34.1ppm。
元素分析對C14H25BrO11的計算值C，37.4;H，5.6.實驗值C，37.1;H，59。
2-溴乙基4-O-(4-O-α-D-吡喃半乳糖基-β-D-吡喃半乳糖基)-β-D-吡喃葡糖苷(48)通過在10ml0.1M甲醇鈉中攪拌16小時，對2-溴乙基2，3，6-三-O-乙酰基-4-O-[2，3，6-三-O-乙酰基-4-O-(2，3，4，6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃半乳糖基)-D-吡喃半乳糖基]-β-D-吡喃葡糖苷(53)進行去乙酰化(Dahmen等，1984)(35mg)。用二氧化硅中和，過濾，蒸發，色譜分離(氯仿-甲醇-水;65∶35∶6)，接著，進行微量過濾和冷凍干燥，得到化合物48(18.6mg，90%)。D22+51°(c 1.0，水)1H-NMR(D2O，以丙酮2.24ppm作參考)δ4.96(d，1H，J＝4Hz，H-1″)，4.57(d，1H，J＝8.0Hz，H-1/H-1′)，4.52(d，1H，J＝7.5Hz，H-1/H-1)，4.37(bt，1H，4.27-4.19(m，1H，CH3CH2Br)4.09-3.55(19H)，3.36(bt，1H)ppm。
13C-NMR(D2O，以丙酮33.19ppm作參考)δ106.2(C-1/C-1)，1051(C-1/C-1′)，103.3(C-1″)，81.6，80.3，78.4，77.8，77.3，75.7，75.1，73.9，73.8，73.0，72.1，71.9，71.5，63.5，63.3，63.0，33.9(CH2Br)ppm。
“GM3內酰胺”的2-溴乙基糖苷(55)標題化合物(Ray等，1992)相應+乙酸酯在9.5mM甲醇鈉中和室溫下去O-乙酰基7小時。用二氧化硅中和，蒸發，色譜分離(氯仿-甲醇-水，65∶35∶6)得到化合物55(26mg，定量)。
1H-NMR(D2O，(CH3)3Si(CD2)2COONa)δ特別是3.37(bt，1H)，2.61(dd，1H，J＝13和6Hz，H-3″e)，2.05(s，3H，NCOCH3)，1.71(dd，1H，J＝11和13Hz，H-3″a)ppm.
在絲氨酸側鏈O-糖基化的肽可采用固相肽合成技術合成。用O-乙酰化的Gal 24Gal的β-硫糖苷對絲氨酸(分別在氨基端和羧基端以9-芴基甲氧基羰基-和五氟苯基衍生物的形式保護)進行糖基化，得到O-糖基化的絲氨酸衍生物。這些衍生物用于固相肽合成中。從樹脂上剝離下來并經HPLC純化后，得到的糖肽在碳水化合物部分仍以酰基的形式被保護著。用堿催化進行完全地去保護，產物用HPLC純化。產物FAB-MS數據與理論值相吻合。
用于制備糖肽的方法方法A通過2-溴甲基丙-2-烯-1-基間隔臂共軛在氬氣下，將在N，N-二甲基甲酰胺(100μl)中的3-溴-2-溴甲基丙-1-基糖苷(10μmol)和N，N，N，N-四丁基氟化銨(40-100μmol)的漿液攪拌10分鐘。加入溶于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)或二甲亞砜(DMSO)(200-1000μl)中的肽(8μmol)，混合物用聲波處理5分鐘，然后攪拌1.5-2.5小時。用HPLC監測反應。用0.1%的三氟乙酸溶液稀釋混合物，并進行冷凍干燥。經制備的HPLC分離(乙腈-水-0.1%三氟乙酸)得到所需要的糖肽(參見表2)。
方法B通過2-溴乙基間隔臂共軛在氬氣下，將肽(5μmol)加到2-溴乙基糖苷(10μmol)和碳酸銫(20-100μmol)，在N，N-二甲基甲酰胺(400μl)中的漿液中。混合物經聲波處理5分鐘，然后攪拌1-5小時。用HPLC監測反應，用0.1%三氟乙酸溶液稀釋反應物異進行冷凍干燥。經制備HPLC分離(乙腈-水-0.1%三氟乙酸)得到所期望的糖肽(參見表2)。
肽以及合成的糖肽以三氟甲基磺酸鹽的形式存在。
除了使用碳酸銫作促進劑的方法外，肽共軛物24還可根據Or等人的方法制備，HPLC對兩種反應混合物的分析表明主要產物峰具有相同的保留時間。但是，用碳酸銫作為促進劑可獲得更完全的反應和更易純化的產物。
糖肽制備實施例共軛物21在氬氣下，將化合物9(2.9mg，3.4μmol)和N，N，N，N-四丁基氟化銨(9.8mg，30.6μmol)在N，N-二甲基甲酰胺(35μl)中的漿液攪拌10分鐘。加入溶于二甲基亞砜(350μl)中的肽16(8.1mg，2.7μmol)，混合物聲波處理5分鐘，然后攪拌15小時。用HPLC(在0.1%三氟乙酸溶液中的0-40%乙腈梯度，20分鐘)監測反應。混合物用0.1%三氟乙酸溶液稀釋并冷凍干燥，經制備HPLC分離(在0.1%三氟乙酸溶液中的17%乙腈)得到化合物21(1mg，11%)。
保留時間(分析實驗)烯丙基溴(來自9)10.7分;2114.2分;1615.8分。
共軛物22在氬氣下，將化合物9(11mg，12.9μmol)和N，N，N，N-四丁基氟化銨(37mg，116μmol)在N，N-二甲基甲酰胺(130μl)中的漿液攪拌10分鐘，加入溶于二甲基亞砜(750μl)中的肽17(20mg，10.2μmol)，混合物進行聲波處理，再攪拌2.5小時。用HPLC(在0.1%三氟乙酸溶液中的0-40%乙腈梯度，20分鐘)監測反應。用0.1%三氟乙酸溶液稀釋混合物并冷凍干燥。經制備HPLC分離(在0.1%三氟乙酸溶液中的14%乙腈)得到化合物22(3mg，10%)。
保留時間(分析實驗)烯丙基溴(來自9)10.7分;2213.0分;1714.3分。
共軛物23在N，N-二甲基甲酰胺(150μl)中用N，N，N，N-四丁基氟化銨(39mg，124.0μl)處理化合物9(13mg，15.5μmol)，加入溶于二甲基亞砜(600μl)中的肽18(20mg，12.0μmol)，混合物用聲波處理5分鐘，再攪拌2.5小時。用HPLC(在0.1%三氟乙酸溶液中的0-40%乙腈梯度，20分鐘)監測反應。混合物用0.1%三氟乙酸溶液稀釋并冷凍干燥。經制備HPLC分離(在0.1%三氟乙酸溶液中的12%乙腈)得到化合物23(8mg，29%)。
保留時間(分析實驗)2312.2分;1813.5分。
共軛物24在氬氣下，將肽19(10mg，6.8μmol)加到化合物15(10mg，13.6μmol)和碳酸銫(11.5mg，35.2μmol)在N，N-二甲基甲酰胺(550μl)中的漿液中，混合物用聲波處理5分鐘，再攪拌5小時。用HPLC(在0.1%三氟乙酸溶液中的0-30%乙腈梯度，30分鐘)監測反應。混合物用0.1%三氟乙酸溶液稀釋并冷凍干燥。經制備HPLC分離(在0.1%三氟乙酸溶液中的12-15%乙腈梯度，30分鐘)得到24(8.5mg，59%)。
保留時間(分析實驗)158.7分;2418分;1919.3分。
根據Or等人(1991)的方法制備共軛物24在氬氣下將化合物15(8mg，10.5μmol)和肽19(2mg，1.4μmol)溶于干燥N，N-二甲基甲酰胺(400μl)中。該溶液用氨飽和，攪拌1.5小時。用HPLC(在0.1%三氟乙酸溶液中0-30%乙腈梯度，30分鐘)監測反應，表明主峰(52%)具有與按照方法B制備的化合物24相同的保留時間(18分)。
共軛物25在氬氣下，將肽20(10mg，6.0μmol)加到化合物15(9mg，12.0μmol)和碳酸銫(39mg，120μmol)在N，N-二甲基甲酰胺(500μl)中的漿液中，混合物聲波處理5分鐘，再攪拌1小時。用HPLC(在0.1%三氟乙酸溶液中的0-30%乙腈梯度，30分鐘)監測反應。混合物用0.1%三氟乙酸溶液稀釋并冷凍干燥。經制備HPLC分離(在0.1%三氟乙酸溶液中13-18%乙腈梯度，30分鐘)得到化合物25(14mg，60%)。
保留時間(分析實驗)158.7分;2520.5分;2021.7分。
共軛物29在氬氣下，將肽20(20.5mg，12.3μmol)加到化合物28(31.6mg，70.3μmol)和碳酸銫(110.3mg，338μmol)在N，N-二甲基甲酰胺(1.6ml)中的漿液中，混合物用聲波處理5分鐘，接著攪拌3小時。用HPLC在0.1%三氟乙酸溶液中的0-30%乙腈梯度，30分鐘)監測反應，反應物用0.1%三氟乙酸溶液稀釋并冷凍干燥。經制備HPLC分離(在0.1%三氟乙酸溶液中的13-18%乙腈梯度，30分鐘)得到化合物29(17.6mg，70%)。
保留時間(分析實驗)286.2分;2920.8分;2021.8分。
共軛物30在氬氣下將肽26(10mg，6.5μmol)溶于N，N-二甲基甲酰胺(800ml)中，加入化合物28(11.7mg，26μmol)和碳酸銫(21.2mg，65μmol)。混合物用聲波處理5分鐘，再攪拌2小時。用HPLC(在0.1%三氟乙酸溶液中的0-30%乙腈梯度，30分鐘)監測反應。混合物用0.1%三氟乙酸溶液稀釋并凍干。經制備PHLC分離(在0.1%三氟乙酸溶液中的13-18%乙腈梯度，30分鐘)得到化合物30(11.2mg，90%)。
保留時間(分析實驗，在0.1%三氟乙酸溶液中的0-30%乙腈梯度，50分鐘)286.2分;3021.5分;2624.4分。
共軛物31在氬氣下將肽19(15mg，10μmol)溶于N，N-二甲基甲酰胺(1.2ml)。加入化合物28(18mg，40μmol)和碳酸銫(76.2mg，234μmol)。混合物用聲波處理5分鐘，再攪拌3小時。用HPLC(在0.1%三氟乙酸溶液中的0-30%乙腈梯度，30分鐘)監測反應。混合物用0.1%三氟乙酸溶液稀釋并凍干。經制備HPLC分離(在0.1%三氟乙酸溶液中的13-18%乙腈梯度，30分鐘)得到化合物31(13.8mg，75%)。
保留時間(分析實驗)28.6.2分;31.17.7分;1919.1分。
共軛物40在氬氣下將肽38(10mg，7.6μmol)溶于N，N-二甲基甲酰胺(0.8ml)，加入化合物28(13.7mg，30.5μmol)和碳酸銫(24.8mg，76μmol)。混合物用聲波處理30分鐘，再攪拌1小時。用HPLC(在0.1%三氟乙酸溶液中的0-40%乙腈梯度，30分鐘)監測反應。混合物用0.1%三氟乙酸溶液(16ml)稀釋并凍干。經制備HPLC分離(在0.1%三氟乙酸溶液中的16-21%乙腈梯度，30分鐘)得到40(16.6mg，52%)。
保留時間(分析實驗)286.7分;4018.8分;3821分。
共軛物41氬氣下將肽39(10mg，8μmol)溶于N，N-二甲基甲酰胺(0.8ml)，加入化合物28(14.3mg，32μmol)和碳酸銫(27.6mg，85μmol)。混合物用聲波處理15分鐘，然后攪拌65分鐘。用HPLC(在0.1%三氟乙酸溶液中的0-40%乙腈，30分鐘)監測反應。混合物用0.1%三氟乙酸溶液(16ml)稀釋并凍干。將粗產物與分別從5和6mg肽類似制備的另外的兩批產物收集在一起，收集的產物經制備HPLC分離(在0.1%三氟乙酸溶液中19-24%乙腈梯度，30分鐘)得到化合物41(23.7mg，85%)。
保留時間(分析實驗)286.7分;4122.2分;3924.3分。
共軛物42在氬氣下將肽36(5mg，3.6μmol)溶于N，N-二甲基甲酰胺(0.4ml)中。加入化合物28(6.4mg，14.3μmol)和碳酸銫(11.6mg，35.7μmol)。混合物用聲波處理5分鐘，再攪拌2小時。用HPLC(在0.1%三氟乙酸溶液中17-22%乙腈梯度，30分鐘)監測反應。用0.1%三氟乙酸溶液稀釋混合物并凍干。經制備HPLC分離(在0.1%三氟乙酸溶液中的17-22%乙腈梯度，30分鐘)得到42(7.1mg，95%，純度85%)。
保留時間(分析實驗)286.2分;4226.4分;3627.6分。
共軛物43在氬氣下將肽37(10mg，7.35μmol)溶于N，N-二甲基甲酰胺(0.8ml)中。加入化合物28(13.2mg，29.4μmol)和碳酸銫(23.9mg，73.4μmol)。用HPLC(在0.1%三氟乙酸溶液中的5-35%乙腈梯度，30分鐘)監測反應。混合物用0.1%三氟乙酸溶液(16ml)稀釋并凍干。經制備HPLC分離(在0.1%三氟乙酸溶液中的17-22%乙腈梯度，30分鐘)得到43(9.3mg，73%)。
保留時間(分析實驗)28∶6.2分;43∶24.6分;37∶25.9分。
共軛物44在氬氣下將肽32(10mg，8μmol)溶于二甲亞砜(0.8ml)中。加入化合物28(14.5mg，32μmol)和碳酸銫(26mg，80μmol)。混合物用聲波處理10分鐘，再攪拌1小時。用HPLC(在0.1%三氟乙酸溶液中的0-30%乙腈梯度，30分鐘)監測反應。混合物用0.1%三氟乙酸溶液(16ml)稀釋并凍干。粗產物與從10mg肽類似制得的另一批產物收集在一起，收集的產物經制備HPLC分離(在0.1%三氟乙酸溶液中的7-12%乙腈梯度，30分鐘)得到44(14mg，54%)。
保留時間(分析實驗)26∶6.2分;42∶14.6分;32∶16.8分。
共軛物45在氬氣下將肽34(10mg，6.8μmol)溶于N，N-二甲基甲酰胺(0.8ml)中，加入化合物28(11.2mg，25μmol)和碳酸銫(20.2mg，62μmol)。混合物用聲波處理10分鐘，再攪拌2小時。HPLC分離(在0.1%三氟乙酸溶液中的0-30%乙腈梯度，30分鐘)監測反應。混合物用0.1%三氟乙酸溶液(16ml)稀釋并凍干。經制備HPLC分離(在0.1%三氟乙酸溶液中的13-18%乙腈梯度，30分鐘)得到45(7.9mg，63%)。
保留時間(分析實驗)28∶6.2分;45∶20.5分;34∶25.2分。
共軛物46在氬氣下將肽35(10mg，6.7μmol)溶于N，N-二甲基甲酰胺(0.8ml)中，加入化合物28(12.1mg，27μmol)和碳酸銫(43.7mg，134μmol)。混合物用聲波處理20分鐘，再攪拌4小時。用HPLC(在0.1%三氟乙酸溶液中的0-30%乙腈梯度，30分鐘)監測反應。混合物用0.1%三氟乙酸溶液(16ml)稀釋并凍干。經制備HPLC分離(在0.1%三氟乙酸溶液中的13-18%乙腈梯度，30分鐘)得到46(17.4mg，56%)。
保留時間(分析實驗)28∶6.2分;46∶21.0分;35∶23.8分。
共軛物47在氬氣下將肽33(10mg，8μmol)溶于二甲亞砜(0.8ml)中，加入化合物28(14.5mg，32μmol)和碳酸銫(26mg，80μmol)。混合物用聲波處理10分鐘，再攪拌1小時55分鐘。用HPLC(在0.1%三氟乙酸溶液中的0-30%乙腈梯度，30分鐘)監測反應。混合物用0.1%三氟乙酸溶液(16ml)稀釋并凍干。粗產物與分別從5和10mg肽類似制備的另外的兩批產物收集在一起，收集的產物經制備HPLC分離(在0.1%三氟乙酸溶液中的10-15%乙腈梯度，30分鐘)得到47(18.9mg，59%)。
保留時間(分析實驗)28∶6.2分;47∶18.3分;33∶20.6分。
共軛物49在氬氣下將肽26(15mg，9.8μmol)溶于N，N-二甲基甲酰胺(1.2ml)中，加入化合物48(23.8mg，39μmol)和碳酸銫(31.9mg，98μmol)。混合物用聲波處理10分鐘，再攪拌1小時50分鐘。用HPLC(在0.1%三氟乙酸溶液中的0-30%乙腈梯度，30分鐘)監測反應。混合物用0.1%三氟乙酸溶液(24ml)稀釋并凍干。經制備HPLC分離(在0.1%三氟乙酸溶液中的13-18%乙腈梯度，30分鐘)，得到49(17.8mg，88%)。
保留時間(分析實驗)48∶10.1分;49∶21.9分;26∶24.4分。
共軛物50在氬氣下將肽32(15mg，21.1μmol)溶于二甲亞砜(0.6ml)和N，N-二甲基甲酰胺(0.6ml)的混合物中，該混合物用聲波處理1分鐘。加入化合物48(29.6mg，48μmol)和碳酸銫(39.4mg，121μmol)。混合物用聲波處理15分鐘，再攪拌1小時50分鐘。用HPLC(在0.1%三氟乙酸溶液中的0-30%乙腈梯度，30分鐘)監測反應。混合物用0.1%三氟乙酸溶液(16ml)稀釋并凍干。粗產物與從5mg肽類似制備的另外的一批產物收集在一起，收集的產物經制備HPLC分離(在0.1%三氟乙酸溶液中的7-12%乙腈梯度，30分鐘)得到50(14.3mg，74%)。
保留時間(分析實驗)48∶10.1分;50∶15.2分;26∶16.8分。
共軛物51在氬氣下將肽19(15mg，10μmol)溶于N，N-二甲基甲酰胺(0.4ml)中，加入化合物55(6mg，8.3μmol)和碳酸銫(56mg，172μmol)。混合物用聲波處理10分鐘，再攪拌2小時。用HPLC(在0.1%三氟乙酸溶液中的0-30%乙腈梯度，30分鐘)監測反應。混合物用0.1%三氟乙酸溶液稀釋并凍干。經制備HPLC分離(在0.1%三氟乙酸溶液中的10-14%乙腈梯度，30分鐘)得到51(8.2mg，45%)。
保留時間(分析實驗)55∶13.0分;52∶20.3分;79∶21.3分。
共軛物52在氬氣下將肽20(5mg，3μmol)溶于N，N-二甲基甲酰胺(0.4ml)中。加入化合物55(4.3mg，6μmol)和碳酸銫(37mg，114μmol)。混合物用聲波處理5分鐘，再攪拌3小時45分鐘。用HPLC分離(在0.1%三氟乙酸溶液中的0-30%乙腈梯度，30分鐘)監測反應。混合物用0.1%三氟乙酸溶液(8ml)稀釋并凍干。粗產物與從5mg肽類似制備的另外的一批產物收集在一起，收集的產物經制備HPLC分離(在0.1%三氟乙酸溶液中的13-18%乙腈梯度，30分鐘)得到52(9.3mg，65%)。
保留時間(分析實驗)55∶13.0分;52∶22.7分;20∶23.6分。
2.通過用合成的9-鏈節肽免疫獲得體內病毒特異性CTL的初級誘發2.1方法通過使用本發明的新共軛物免疫進行毒性T細胞(CTL)的體內初級誘發，其方法類似于下述的通過使用合成的9-鏈節肽免疫進行的體內病毒-特異性CTL的初級誘發。
用預先處理的合成肽，即相應于感冒A病毒-感染細胞中制備的內生9-鏈節肽，對大鼠接種，產生了較強的初級CTL反應。生成的CTL有效地殺死病毒感染的靶細胞，尤其是那些與免疫所用的肽具有相同氨基酸序列的病毒株。用溶于IFA的100μg肽在尾根部進行皮下注射可獲得體內初級CTL反應的最佳條件。用最佳的低濃度肽(0.05μm)對預先已接觸抗原7-10天的脾細胞在體外重新刺激5天，并對病毒感染的和用肽處理的靶細胞測試。肽誘發的CTL是MHCl類抑制的和CD8陽性的。
肽肽ASNENMETM(表示為Pep9(PR8);SEQIDNO∶1)和ASNENMDAM(表示為Pep9(NT60);SEQ ID NO4的3-11殘基)分別取自感冒A病毒株A/PR/8/34和A/NT/60/68的NP366-374。Pep9(PR8)用Applied Biosystems 430A肽
其意義是若第一題答錯，重放第一單元內容;
若第二題答錯，重放第一、二單元內容;
若第三題答錯，重放第三單元內容;
(3)將每個單元序號安排在學習該單元應知問題處(即該單元的起始位置)，根據下述固化在機內微電腦程序存儲器中程序，在順序放像時，每當機內微電腦通過雙音頻解碼器接收到一個單元序號，立即轉為“靜像”狀態，輸出一幀數字存儲式靜像，然后，機內微電腦等待接收學習者鍵入自己對問題所選擇的答案，并把這一答案與此前由控制程序中獲得的正確答案相比較，控制放像機順序放像或重放由控制程序指定序號單元。
由于本實施例采用雙音頻方式記錄控制程序，所以可以充分利用其抗干擾能力強的優勢，在電視臺播放教學錄像時，利用第二伴音通道，發送相應程序和單元序號，使擁有此種錄像機者，可以在晚間定時錄下電視臺播放的課件，用于次日學習。
此外，亦可采用將教學進程控制程序記錄在兩場視頻信息之間對應的場消隱區間，利用圖文電視系統中的解碼裝置作為磁帶放像機/或視盤放像機中讀取教學進程控制程序裝置。
2.2.結果使用9-鏈節肽抗感冒A病毒特異性CTL的體內初級誘發如以前所述(Townsend等，1985，1986)，用H-2b小鼠中活性感冒A病毒誘發的CTL主要是直接針對免疫顯性的NP365-380抗原決定基。我們曾經根據Alchele等人(1990)描述的方案，起初試圖用得自PR8和NT60菌株的肽NP365-380對小鼠免疫以誘發CTL反應。然而，盡管多次提高劑量，還是僅觀察到對肽包覆和病毒感染細胞的較低水平的致死活性。但是，當用100μg短鏈Pep9(PR8)皮下注射并且在體外用5μmPep9(PR8)再刺激脾細胞時，雖然病毒感染靶細胞沒被殺死，但誘發了對Pep9(PR8)包覆的RMA(未示出)和EL4細胞的較強的CTL反應(表3)。當用更低濃度的Pep9(PR8)在體外再刺激時，產生的CTL對Pep9(PR8)包覆的靶細胞和病毒感染細胞具有更高的致死活性;這些細胞也溶解了(表3)。如表3所示，免疫的最佳劑量是100μg，再刺激的最佳劑量是5或0.05μm。用10μg或1μg免疫產生較弱的或甚至不產生CTL反應。溶于完全弗羅因德氏佐劑(CFA)或PBS中的肽不產生反應。靜脈內注射肽也不產生體內初級CTL反應(未示出)。
如圖3所示，另一個從NT60獲得的9鏈節肽可給出更強的抗肽和抗病毒CTL反應。
由Pep(PR8)和Pep(NT60)誘發的CTL的特異性根據這些結果，我們研究了產生的CTL關于Pep9(PR8)和Pep(NT60)的精確特異性。CTL優先殺死與其相應的肽包覆和病毒感染細胞(圖4)。CTL與肽包覆細胞比與病毒感染靶細胞顯示出更高交叉活性。
CTL對活性病毒或肽的響應用活性PR8病毒使大鼠接觸抗原，并且用病毒感染刺激細胞再刺激免疫脾細胞(圖5A)或者在0.05μmPep(PR8)存在下用正常的同源脾細胞再刺激免疫脾細胞(圖5B)。在體內用活性病毒使其接觸抗原并用低濃度的Pep(PR8)使其再激活的CTL具有識別病毒感染細胞和肽包覆細胞的出色能力(圖5B)。應當指出，少量的再刺激肽足以刺激在體外被病毒激活的CTL，并且與病毒感染細胞具有同樣的效力。當Pep(PR8)用于體內激活以及病毒感染細胞或Pep(PR8)用于體外再刺激時(圖5C和D)，產生了針對肽包覆和病毒感細胞的CTL反應。活性病毒比游離肽具有更高的激活CTL的功效。
用Pep(PR8)免疫后CTL活性的時間歷程為了確定用Pep(PR8)免疫后CTL活性的動力學，用Pep(PR8)使小鼠接觸抗原一次。用Pep(PR8)免疫2-30天后，免疫動物的脾細胞在體外再激活，并評價CTL活性。對Pep(PR8)包覆的RMA靶細胞的CTL活性在免疫后七天達到頂峰，隨后活性則逐漸降低(圖6)。激活30天后，還能檢測到較低水平的CTL活性。
CD8+和MHCI類限制的細胞調節體內肽誘發的細胞毒性如圖7a所示，排除掉CD8T細胞的Pep(PR8)誘發的CTL不能溶解Pep(PR8)包覆的EL4細胞。另一方面，排除CD4+T細胞不影響對Pep(PR8)包覆的靶細胞的毒性活性。因此，Pep(PR8)特異的CTL表現為CD4-CD8+表現型。
在被感冒PR8菌株感染的同源EL4(H-2b)、同種P815(H-2d)和L929(H-2k)靶細胞上測試源于C57B6/J(H-2b)的在體內被肽激活的CTL。如圖7b所示，對H-2b靶細胞有明顯的抑制特異性。
表3 體內激活和體外再刺激的被不同劑量的肽誘發的CTL活性。
＊ 效應物靶細胞比值。
3.內在化后外部MHC-1連接的肽的循環至細胞表面已經知道連接MHC-1的外部肽可在B2-M存在下調節相應的限制單元的表達(Otten等，1992)。該體外的調節反應與體內的肽致免疫性有關。正如我們已發現的那樣，核內體抑制劑氯喹抑制這種調節(圖8)，很可能是該過程需要肽的內在化和膜的循環。為了支持這種模型，一些早期的研究發現了通過chlatrin包覆凹六的MHC-1內在化，還發現了MHC-1循環。
為了研究外部MHC-1連接肽的可能的循環，我們合成了兩個Db連接肽，其代表在得自腺病毒(序列SGPSNPPEI;SEQ ID NO∶1)的核蛋白質上的免疫顯性抗原決定基。將半胱氨酸加到氨端或羧端，作為分子標記生物連接(molecular marker galabios)(Gal-Gal)的生化偶合點，為此可得到特異性單克隆抗體(MC2101)(Brodin等，1988)。正如以前所報道的，將半胱氨酸加到氨端不會破壞Db的調節能力，或肽的體內致免疫性(Zhou等，1992b)。將galabios加到同樣的部位，產生的糖肽可在ELISA實驗中(表4)被gaoabios特異性單克隆抗體MC2101強烈地識別。Gal2-CSG11肽(共軛物29)比GAL2-CAS10肽反應強烈。為了證實引入的galabios。不改變Db連接能力或體內致免疫性，這兩個糖肽都進行了體外Db調節和體內致免疫性實驗。與單獨的肽相比，Db調節類似于糖肽(沒有給出數據)。用糖肽體內注射或體外再刺激產生的CTLs，在交叉實驗方式中(圖9)，屬于嚴格的肽特異性并且當以另外的肽呈現時不能識別Gal。從這些結果我們可以得出結論，糖肽中的Gal2起著惰性標記作用。
為了使外部的糖肽最大數目地連到膜Db分子上，使用了變異RMA-S細胞。這些細胞由于失去了Tap-2肽運輸系統，本質上缺乏將過程中的肽從細胞溶質運送到ER區域的能力。因此，在細胞表面，RMA-S細胞比非變異細胞顯示出更高比例的空Db分子。這些表達的空Db分子可以通過低溫(26℃)進一步增加以及通過在37℃加入Db連接肽進行穩定(圖3)。因此，通過在B2-M存在下用高濃度糖肽處理低溫誘發的RMA-S細胞，膜Db分子的大部分變得與相同的糖肽相飽和。這樣處理的RMA-S細胞顯然已被MC2101抗體污染(圖10)，說明了Gal2抗原決定基的膜表達，假定是以MHC-1連接糖肽的形式。通過用鏈霉蛋白酶處理，從這些細胞中除去了所有的Db和Gal2表達(圖10)。如果這些細胞的溫度轉化為37℃，并培養1小時，Db和Gal2表達又回到細胞表面(圖10)。Gal2抗原決定基的回復受到氯喹的抑制(未給出數據)。由于普通的MHC-1呈現通道在RMA-S細胞中不起作用，因此胞液肽不能運送到ER區域，結果有力地表明了Db連接糖肽的核內體循環。用Gal2-CASIO糖肽獲得了類似的結果(未給出)。
為了在功能水平上證實這些結果，產生了感冒A(PR8)特異CTL，并針對RMA-S和EL-4靶細胞進行了實驗;這些靶細胞相應于Gal2-CASIO糖肽(共軛物31)中的靶抗原決定基的肽(ASNENMETM)進行了處理。如以前報道(R tzshke等，1990)的那樣，兩種靶細胞都可被強烈地殺死(圖11)。用鏈霉蛋白酶處理這些經過肽處理的靶細胞，除去了大部分Db表達以及對特異CTL∶S的大部分敏感性(圖11)。在37℃培養經鏈霉蛋白酶處理的細胞，使Db和有關的肽再次表達，產生了對CTL致死易感性的回復。與EL-4細胞相比，對RMA-S細胞來說這種回復更快、更徹底，并且這種回復可被抗-Db單克隆抗體和氯喹阻斷(未給出數據)。
我們解釋這些結果的目的是想說明，MHC-1連接肽通過細胞間的區域循環，而細胞間區域類似于以前T細胞中的核內體。很可能該機理使肽交換發生，以便最好地實現膜肽的表達。Hochman等人(1991)指出Ⅰ類MHC分子在核內區域中進行了結構上的變化，表明B2-M的離去并且在重鏈上。因此，導致這種作用的低PH還可使肽交換發生。為了支持這種觀點，Harding(1992)最近報道，使用外生抗原的electroporation，通過低溫和弱堿胺可阻止MHC-1的呈現。
已知MHC-1分子用很高的親和性連接最佳長度的肽，而不是略長的肽;這一現象反映在許多體外實驗中。這些實驗包括MHC-1膜調節實驗、對特異CTL的靶細胞敏感實驗、肽直接連接變異細胞上的空Ⅰ類鏈、在來自變異細胞的溶解物中肽誘發MHC-1的集結以及MHC-1連接肽的離去速率測定。最佳長度肽鏈上的這種更高的親和性可能與恰好適合Ⅰ類鏈上的肽連接溝有關，因為這種溝兩端都是閉合的(Madden等，1991)。因此，大小最合適的肽可形成三肽-重鏈B2-M復合物，該復合物與長鏈肽組成的復合物相比更易于從核內體中循環出來。
在靶T細胞中，最佳MHC-1連接肽的循環可導致被本文中的相應特異CTL∶S的最有效識別。迄今為止，關于MHC-1循環的大部分證據都是在T細胞中獲得的。然而，如果類似的機理在某些呈現抗原的細胞中運作，在膜水平的最適宜肽的累積在免疫反應的輸入臂也是重要的。尤其是樹突細胞應當在這方面進行探討;樹突細胞被認為是體內和體外對CTL產生起關鍵作用的細胞。在肽的體外調節MHC-1表達的能力與其體內致免疫性之間存在的相互關系指出這種機理可能是系胞間反應的重要機理。
表4 在ELISA實驗中單克隆抗體MC2101對Gal2糖肽的識別
在0.05M碳酸鹽緩沖液(PH9.6)中稀釋肽(50μg/ml)，以100μl/穴加到平底Costar微型盤(cat.No3590)中，在4℃下培養過夜。用PBS洗滌微型盤一次，在室溫下用0.5%PBS預培養30分鐘，并用PBS/0.05%吐溫緩沖液洗滌兩次。在0.5%明膠/PBS/0.05%吐溫中稀釋單克隆抗體，加到微型盤中，在室溫下培養2小時，并用PBS/吐溫快速洗滌。堿性磷酸酶共軛的家兔抗-小鼠免疫球蛋白(Dakopatts代碼No.S414)在PBS/吐溫中稀釋至1/1000，加入量為100μl/穴。在室溫下培養2小時后，用PBS/吐溫洗滌4次，加入100μl堿性磷酸酶基質溶液。在室溫下過2小時后，使用Multiskan系統(實驗系統)在405nm讀取微型盤的光密度。
4.通過用在內部致免疫位置帶有碳水化合物部分的糖肽接種產生碳水化合物特異性CTL反應。
將碳水化合物galabiose(另外，Gal-α-4Gal被認為是Gal2)偶合到12-鏈節肽SGVENPGGYCLT(SEQID NO∶9)的內半胱氨酸(10位)上，該肽代表淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)的Hz-Db限制的CTL免疫顯性抗原決定基(Oldstone等人，1988)。糖肽稱為SGV-12-Gal2(共軛物30;圖12)，如實施例1所述，偶合時采用S鍵連到硫羥基上。
如實施例2和Zhou等人(1992a)所述，小鼠用SGC12-Gal2糖肽免疫，用相同的SGV12-Gal2糖肽在體外再刺激后，針對用下列肽和糖肽包覆的H2-Db和Kb陽性EL-4細胞測試產生的毒性T細胞1.SGVENPGGYCLT(SGV12;SEQ ID NO∶9)2.SGV12-Gal23.ASNENSETM(ASN9;SEQ ID NO∶1)與Gal2連到6位的S上(ASN9-6S-Gal2)4.ASN9-6S
5.CSG11-Gal2(參見實施例3和圖9)6.CSGPSNTPPEI(CSG11;SEQ ID NO∶8)7.CRG與Gal2連到1位的C上(CRG9-Gal2)8.CRGYVYQGL(CRG9;SEQ ID NO∶13)肽1-6是已知的、改性的Db連接T細胞抗原決定基，連到RMA-S細胞上，如通過體外Db調節測定的那樣(未給出數據)。肽7-8表示已知的Kb抗原決定基(RGYVYQGL;SEQ ID NO∶27)并且兩個肽都調節RMA-S細胞上的Kb(未給出數據)。通過連接糖肽的細胞表面上的FACS測定Gal2抗原決定基的表達。使用糖肽2，5和7發現了Gal2的較高表達(未給出數據)當連到RMA-S細胞上時，糖肽3不能被抗-Gal2單克隆抗體識別。其結論是，當在不同的載體肽上致免疫SGV12-Gal2時，糖肽5和7表達了相同的Gal2抗原決定基。CSG11-Gal2糖肽與Db相連，CRG9-Gal2糖肽與Kb相連。因此，糖肽2，5和7共享的唯一抗原決定基是Gal2。
當SGV12-Gal2產生的CTL細胞針對用上述肽和糖肽包覆的EL-4細胞測試時，發現用糖肽2和5包覆的靶細胞被殺死了，并且用糖肽7涂覆的靶細胞在較低含量時也可被殺死(圖13)。因此，產生的CTL細胞不能識別單獨的載體肽(SGV12)或其他作對比實驗的肽，包括糖肽3(其在細胞表面水平上不能表達Gal2抗原決定基)。
從上面的結果可總結出，用糖肽SGV12-Gal2免疫可產生Gal2特異性T細胞反應。其原因可能是Gal2碳水化合物部分取向在T細胞識別的最佳位置。與糖肽7包覆的靶細胞相比，糖肽5包覆的靶細胞之所以有較高的致死率可能是因為這樣一個事實，即糖肽5是由Db顯示的，而糖肽7是由KbⅠ類鏈顯示的。
在另一組實驗中(采納與上述相同的概念)，用糖肽RGY8-4h-Gal(“RGY8”表示八肽RGYVYQGL;4h表示4位的V被高絲氨酸取代;Gal2表示糖Gal2共軛到高絲氨酸羥基上)使小鼠免疫。如實驗中所述，參考圖13，針對RGY8-4h-Gal2和RGY8-4h包覆的EL-4細胞測試RGY8-4h-Gal2產生的CTL細胞。
從圖14(A)顯示的結果可以看出，產生了肽和糖肽特異性CTL細胞。
當這些不同基因的效應物細胞群在本質上針對另一載體肽(SGV12-Gal)和SGV12肽上的用Gal2包覆的EL-4細胞測試時(圖14(B))，只殺死了用糖肽包覆的細胞。
通過“交叉”實驗結果證明了CTL具有Gal2特異性(參見上述的標題為“實驗測試系統部分特異)。
這里給出的數據可總結在下面的表5和6中。
表5Kb連接肽和糖肽的分析肽 ELISA 調節 膜表達 致免疫性 特異性P G GPGal2-CAP9 + + - + +FAP9-5h-Gal2+ + + +Gal2-CRG9 + - + + +RGY8-4h-Gal2+ + + + + +肽 致免疫性 評價CAP9 (SEQ ID NO:14) +FAP9 (SEQ ID NO:20) + 強,有高FAP9-5h反應性FAP9-5h (SEQ ID NO:26) + 較弱,有低FAP9反應性CRG9 (SEQ ID NO:13) +RGY8 (SEQ ID NO:27) + 一些RGY8-4h反應性RGY8-4h (SEQ ID NO:25) + 強,有RGY8反應性表6對Db連接肽和糖肽的分析肽 ELISA MHC-1 膜表達循環 致免疫性 特異性7.4 9.6 調節 P G GPGal2-CAS10 + + + + + +GM3-CAS10 -GM3-laktam-CAS10 毒ASN9-6h-Gal2+ - + + + + +ASN9-6S-Gal2- + - -ASN9-4S-Gal2(+) - -Gal2-CSG11 + + + + + +GM3-CSG11 -GM3-laktam-CSG11 + +SGP10-6h-Gal2+ + + + + -SGP10-6S-Gal2- + - -SGP10-4S-Gal2(+) - - -SGV12-Gal2+ + + + + +肽 致免疫性CAS10 (SEQ ID NO:7) +ASN9 (SEQ ID NO:1) +ASN9-6h (SEQ ID NO:21)ASN9-6S -ASN9-4SCSG11 (SEQ ID NO:8) +SGP10 (SEQ ID NO:2) +SGP10-6h (SEQ ID NO:23)SGP10-6S +SGP10-4S
對實驗(表5和6)的注釋ELISAELISA實驗按與表4有關的敘述進行。
MHC-1調節正如上面與圖8和圖10A有關的敘述那樣，其原理是肽可連到顯示抗原細胞的細胞表面上的空MHC-1重鏈上，這就導致了穩定化以及相應MHC-1鏈的調節。
膜表達當糖肽與細胞表面上的MHC-1相連時，相應CHO部分的表達(及可達性)可通過FACS中的抗體污染檢測，這正如上面關于圖10C和E所述的那樣。
膜循環在圖10D和F中描述。
致免疫性小鼠用糖肽免疫并在本文中描述，測定體外再激活的CTL細胞殺死用不同的肽和糖肽包覆的靶細胞的能力。特異性P是指CTL細胞僅識別肽部分，G指僅識別CHO部分，以及GP指僅識別二者的組合。
附圖的簡單說明圖1在“間隔臂糖苷的合成”部分中敘述化合物1-15的化學結構。
圖2在“糖肽的合成”部分中敘述糖肽產物21-25的化學結構。
圖3pep9(NT60)誘發的CTL使用用于再刺激的0.05μMpep9(NT60)比使用5μM和0.5μM pep9(NT90)能更有效地溶解病毒特異性細胞和肽包覆的EL4細胞。用一次皮下注射100μg pep9(NT60)產生CTL。在(A)，5μM;(B)，0.5μM;和(C)，0.05μM pep9(NT60)存在下，用同源輻射脾細胞再刺激免疫脾細胞5天，并針對未處理的EL4(○-○)、NT60-感染(●-●)、pep9(NT60)-包覆(□-□)測試。
圖4pep9(PR8)(A)和pep9(NT60)(B)誘發的CTL特異性。效應物CTL針對EL4未處理(○-○)、PR8-感染(●-●)、NT-60感染(□-□)、pep9(PR8)包覆(■-■)、pep9(NT60)包覆(△-△)測試。
圖5用活性病毒和肽激活和再刺激CTL反應。小鼠用PR8活性病毒(A，B)或pep9(PR8)(C，D)在體內接觸抗原，并用PR8-感染脾細胞(A，C)或在0.05μM pep9(PR8)存在下用輻射脾細胞(B，D)再刺激。靶細胞是EL4未處理(○-○)、PR8-感染(●-●)、pep9(PR8)-包覆(□-□)。
圖6通過一次皮下注射pep9(PR8)誘發的CTL活性動力學。用100μg pep9(PR8)使小鼠在體內接觸病原，并在接觸病原后第2、7、10、20和30天用5μM pep9(PR8)在體外再刺激。產生的CTL針對RMA未處理(○-○)和pep9(PR8)-包覆(●-●)，測試。效應物靶細胞比值，60∶1。
圖7用CD8+和H-2Db限制的T細胞調整肽誘發的細胞毒性。a通過pep9(PR8)誘發CTL。然后使用Dynabeads系統對等數目的CTL除去CD4+和CD8+T細胞。對余下的細胞針對pep9(PR8)-包覆的EL4細胞測定溶解活性。未處理CTL(○-○)、CD4+除去(●-●)和CD8+除去(□-□)針對pep9(PR8)-包覆的EL4細胞測定溶解活性。b針對PR8-感染的EL4(○-○)、PR8-感染的P815(●-●)和PR8-感染的L929(□-□)測試pep9(PR8)誘發的CTL。
圖8肽中介的H-2Db調節可被氯喹抑制。在氯喹存在或不存在情況下，用感冒A(PR8)肽NP366-374(50μM)培養RMA-S細胞6小時。培養后洗滌細胞，并用抗Db(28-14-8S)單克隆抗體在冰上污染30分鐘，洗滌，用家兔抗-小鼠F(ab′)2-FITC(F313，Dako，哥本哈根，丹麥)培養30分鐘。污染的細胞用1%甲醛固定，并在FACScan流動血細胞計數器(Becton Dickinson;Mountain View，CA)上分析。
圖9糖肽(A和C)的合成。通過將2-溴乙基-4-O-(α-D-吡喃半乳糖基)-β-D-吡喃半乳糖苷(化合物28)與帶有硫羥官能團的肽偶合合成糖肽。將半胱氨酸部分加到母體肽序列的氨端。使用碳酸銫作為促進劑，利用半胱氨酸硫原子的親核性質，在肽和以糖苷形式與碳水化合物部分相連的親電間隔臂之間形成一個硫醚鍵，Gal2偶合反應在N，N-二甲基甲酰胺中進行。偶合反應用HPCL監測，并通過加入含0.1%三氟乙酸的水中止。得到的糖肽(共軛物29(A)和31(C))用制備色譜純化，產物的分子量用FAB MS確定。
CTL實驗(B和D)。在尾根部皮下注射不完全弗羅因德氏佐劑中的100μg糖肽使小鼠免疫。激活10天后，使用與25×106輻射(2500拉德)同源脾細胞共同培養的25×106反應細胞在體外對脾細胞再刺激。再刺激是這樣進行的在50ml組織培養燒瓶中，在0.05μM糖肽存在下，使用RPMI/10%FCS在37℃再刺激5天。RMA-S靶細胞用50μM肽在37℃涂覆1小時，并洗滌。用100μCiNa512CrO4在37℃對細胞標記1小時，洗滌兩次。通過淋巴細胞離心作用分離效應物淋巴細胞，并在V-形微滴定穴中以150μl/六的量使用500051Cr標記的靶細胞在不同的比例下測定。在300g離心微型盤，并在37℃下培養4小時。培養后對微型盤再次離心，取50μl上清液用γ發光計數器測試。
圖10A組將RMA-S細胞在26℃培養24小時，以在細胞表面誘發空DbMHC-1鏈的表達，并在37℃下培養，并污染Db表達。B組用在26℃下預培養的鏈霉蛋白酶處理的RMA-S細胞除去Db表達。用鏈霉蛋白酶處理2小時和4小時，在4小時內完全除去Db。C和E組用糖肽Gal2-CSG11(C組)或Gal2CAS10(E組)以300μM的濃度在37℃處理26℃誘發的RMA-S細胞，洗滌并污染Gal2表達。D和F組如用C和E組那樣，糖肽處理的RMA-S細胞用鏈霉蛋白酶處理以除去Db和糖肽表達，洗滌，并進一步在37℃下培養，使得糖肽重新表達，并污染Gal2表達。
圖11如同特異性CTL檢測到的那樣，用鏈霉蛋白酶處理后與EL4(A)和RMA-S(B)細胞上的肽相連的Db的重新表達。用肽NP366-374(100μM)處理EL4(A)和RMA-S(B)細胞1.5小時。洗滌后，細胞用鏈霉蛋白酶E(ProE，在RPMI1640中，4mg/ml)處理，洗滌，在37℃下培養0，1和3小時，并在4小時51Cr釋放實驗中評價。CTL的制備前面已有敘述(Zhou等，1992b)。簡單地說，通過靜脈內注射在PBS中稀釋的20HAU感冒A/PR/8/34病毒(倫敦國家醫學研究院的A.Douglas博士贈送的禮物)使C57B6/J雌性小內鼠免疫。免疫1-4周后，用輻射的、病毒感染的同源脾細胞再刺激免疫脾細胞5天。
圖12糖肽SGV12-Gal2(共軛物30)，用于產生碳水化合物特異性的CTL反應(參見實施例4)。
圖13針對用實驗組中所示的肽/糖肽包覆的EL-4細胞測試SGV12-Gal2產生的CTL細胞。E/T，效應物靶細胞比值。
圖14(A)和(B)
針對用所示出的肽/糖肽包覆的EL-4細胞測試RGY8-4h-Gal2產生的CTL細胞。E/T，效應物靶細胞比值。
以上有關的引文，已說明其作者名稱以及文章發表的年份，現再將有關的書刊名稱詳細說明如下Alchele et al.(1990)，J.Exp.Med.171，1815.
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下表列出具有各種平面形狀的、裝在殼蓋上的隔聲板的小型電動機的漏出噪聲的測量結果。在測量中，將待測量噪聲的小型電動機20放置在一塊海綿狀材料的板21上，測量噪聲的定向麥克風22放置在離開小型電動機20一個10cm距離L的位置上，在這樣的相對位置上測量小型電動機漏出的噪聲。在測量中所用的小型電動機是音頻設備用的調速電動機，這種小型電動機在無載狀態下以2400轉/分的轉速轉動。
(單位dB)
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(發表于1992年11月。)
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Arg Gly Tyr Val Tyr Gln Gly Leu1 權利要求
1.一種能夠產生對碳水化合物結構的T細胞免疫性的肽/碳水化合物共軛物，所述的共軛物包括(i)能夠連接MHC Ⅰ類分子的肽組分；以及(ii)碳水化合物組分，該組分具有所述碳水化合物結構的致免疫特異性。
2.根據權利要求1的共軛物，其能夠產生對與腫瘤有關的碳水化合物結構的T細胞免疫性，所述的共軛物包括(ⅰ)能夠連接MHC Ⅰ類分子的肽組分;以及(ⅱ)碳水化合物組分，該組分具有所述與腫瘤有關的碳水化合物結構的致免疫特異性。
3.根據權利要求1的共軛物，其產生對在感染病原體和/或被感染宿主細胞上表達的碳水化合物結構的T細胞免疫性，所述的共軛物包括(ⅰ)能夠連接MHC Ⅰ類分子的肽組分;以及(ⅱ)碳水化合物組分，該組分具有在感染病原體和/或被感染宿主細胞上表達的所述碳水化合物結構的致免疫特異性。
4.根據權利要求1-3的任一個權利要求的共軛物，其中肽組分由5-25個氨基酸組成。
5.根據權利要求1-4的任一個權利要求的共軛物，其中肽組分由8-12個氨基酸組成。
6.根據權利要求1-5的任一個權利要求的共軛物，其中肽組分由9個氨基酸組成。
7.根據權利要求1-6的任一個權利要求的共軛物，其中肽組分能夠連接人類MHC Ⅰ類分子。
8.根據任一前述權利要求的共軛物，其中肽組分在6位具有氨基酸V、I、L或T。
9.根據權利要求8的共軛物，其中肽組分在6位具有氨基酸V。
10.根據權利要求1-9的任一個權利要求的共軛物，其中肽組分在C-端位置具有氨基酸V或L。
11.根據權利要求1-10的任一個權利要求的共軛物，其中肽組分在C-端位置具有氨基酸L。
12.根據權利要求1-11的任一個權利要求的共軛物，其中肽組分具有序列GILGFVFTL(在序列表中SEQ IDNO∶3)。
13.根據權利要求1-12的任一個權利要求的共軛物，其中碳水化合物組分與肽組分共軛的位置使得碳水化合物組分連接T細胞受體的高可變區域。
14.根據權利要求1-13的任一個權利要求的共軛物，其中碳水化合物組分的大小使得T細胞受體能夠包圍所述碳水化合物結構的抗原決定基。
15.根據權利要求1-14的任一個權利要求的共軛物，其中碳水化合物組分是說明書的表1中定義的任意碳水化合物。
16.一種藥物制劑，其含有作為活性成分的根據權利要求1-15的任一個權利要求的共軛物。
17.用于治療的根據權利要求1-15的任一個權利要求的共軛物。
18.一種在病人體中刺激產生毒性T細胞(CTL)的方法，其中所述的CTL具有殺死或削弱帶有與特性疾病有關的碳水化合物結構的細胞的能力，該方法包括向病人給藥有效劑量的權利要求1-15的任一個權利要求要求保護的共軛物。
19.一種產生毒性T細胞(CTL)的方法，CTL具有殺死或削弱與疾病有關的細胞的能力，這些細胞帶有與特性疾病有關的碳水化合物結構，該方法包括使細胞群與權利要求1-15任一權利要求要求保護的共軛物接觸，其中所述的細胞群包括(a)帶有能夠連接所述共軛物肽組分的MHC Ⅰ類分子的細胞和(b)能夠轉化為CTL的細胞，CTL具有所述的與細胞(a)相互作用的能力，而細胞(a)具有連接MHC Ⅰ類分子的所述共軛物。
20.根據權利要求19的方法，其中所述的細胞群包括可從動物體取出或分離的細胞。
21.根據權利要求20的方法，其包括將如此制備的CTL引入動物體的步驟，該動物體帶有所述的與疾病有關的細胞。
22.根據權利要求1-15中任一的共軛物用于制備在病人體中刺激產生毒性T細胞(CTL)的藥物組合物，其中所述的CTL具有殺死或削弱帶有與特性疾病有關的碳水化合物結構的細胞的能力。
23.根據權利要求1-15中任一的共軛物用于制備產生毒性T細胞(CTL)的藥物組合物的用途，CTL具有殺死或削弱與疾病有關的細胞的能力，這些細胞帶有與特性疾病有關的碳水化合物結構，該方法包括使細胞群與所述的共軛物接觸，其中所述的細胞群包括(a)帶有能夠連接所述共軛物肽組分的MHC Ⅰ類分子的細胞和(b)能夠轉化為CTL的細胞，CTL具有所述的與細胞(a)相互作用的能力，而細胞(a)具有與MHC Ⅰ類分子相連的所述共軛物。
24.根據權利要求23的用途，其中所述的細胞群包括從動物體中取出或分離的細胞。
25.根據權利要求24的用途，其包括將如此制備的CTL引入動物體步驟，該動物體帶有所述的與疾病有關的細胞。
26.權利要求1-15中任一個要求保護的共軛物用于生產在病人體中誘發所需的免疫狀態的藥物組合物的用途，其中所述的免疫狀態產生自所述共軛物和MHC Ⅰ類分子間的相互作用，從而免疫系統的細胞成分被刺激，以誘發與所述碳水化合物結構有關的特異反應。
27.一種在病人體中誘發所需免疫狀態的方法，其中所述的免疫狀態產生自所述共軛物和MHC Ⅰ類分子間的相互作用，從而免疫系統的細胞成分被刺激，以誘發與所述碳水化合物結構有關的特異反應，該方法包括用有效劑量的權利要求1-15中任一要求保護的共軛物給藥。
28.根據權利要求1-15中任一的共軛物在制備治療惡性疾病的藥物的用途。
29.根據權利要求28的用途，用于制備治療黑瘤、乳腺癌、肺癌或胃腸癌的藥物。
30.根據權利要求1-15中任一的共軛物在制備治療感染疾病的藥品中的用途。
31.根據權利要求30的用途，用于制備治療寄生病原體引起的感染疾病的藥物。
32.根據權利要求31的用途，用于制備治療細胞內病原體引起的感染疾病的藥物。
33.一種治療惡性疾病的方法，該方法將治療有效量的根據權利要求1-15中任一的共軛物給藥于需要這種治療的宿主。
34.根據權利要求33的方法，其中治療黑瘤、乳腺癌、肺癌或胃腸癌。
35.一種治療感染疾病的方法，包括將治療有效量的根據權利要求1-15中任一的共軛物給藥于需要這種治療的宿主。
36.根據權利要求35的方法，其中治療由寄生病原體引起的感染疾病。
37.根據權利要求35的方法，其中治療由細胞內病原體引起的感染疾病。
38.一種制備權利要求1-15中任一要求保護的肽/碳水化合物共軛物的方法，包括一個或多個下列工藝步驟(a)通過已知的肽合成技術合成共軛物的肽組分，(b)通過已知的碳水化合物合成技術合成共軛物的碳水化合物組分，(c)在肽組分共價偶合到碳水化合物組分上之前，保護肽組分的一個或多個-COOH、-OH、-NH2或-SH基團，(d)在碳水化合物組分與肽組分共價偶合前，保護碳水化合物組分的一個或多個-OH、-COOH、-NH2、-CHO或＝CO基團，(e)活化碳水化合物組分未保護的-OH、-COOH、-NH2、-CHO或＝CO基團。(f)活化肽組分未保護的-OH、-COOH、-NH2或-SH基團，(g)使碳水化合物組分和肽組分的至少一個雙功能團連接試劑反應，(h)使碳水化合物組分和肽組分共價反應，從而形成所需的共軛物，所述組分被適當地保護，活化和/或與雙功能團連接試劑反應，(i)使中間保護的肽/碳水化合物共軛物進行去保護基步驟。
全文摘要
本發明涉及一類新的生物活性化合物，其制備方法及其在治療上的用途。更具體地說，本發明提供致免疫共軛物，該共軛物用于產生對與腫瘤有關的碳水化合物結構或在感染病原體上和/或被感染宿主細胞上表達的碳水化合物結構的T細胞免疫性。所述的致免疫共軛物包括，(i)能夠連接MIC I類分子的肽組分；以及(ii)碳水化合物組分，該組分具有所述碳水化合物結構的致免疫特異性。
文檔編號C07K9/00GK1096032SQ93106340
公開日1994年12月7日 申請日期1993年4月28日 優先權日1992年4月28日
發明者M·揚達爾 申請人:阿斯特拉公司