H10n8亞型禽流感病毒二重rt-pcr檢測引物組、試劑盒及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于禽類病毒檢測技術領域，尤其設及一種H10N8亞型禽流感病毒二重 RT-PCR檢測引物組、試劑盒，化及鑒定化0亞型禽流感病毒、N8亞型禽流感病毒的引物對或 引物對組及其試劑盒。
【背景技術】
[0002] 禽流感病毒（AvianInfluenzaVi;rus，AIV)根據表面糖蛋白化emagglutinin，HA) 和神經氨酸酶（Neuraminidase,ΝΑ)抗原性差異分為不同的亞型，目前已發現有18種HA亞 型化1-H18)和11種NA亞型（N1-N11)。AIV是一種有包膜、單股負鏈、分節段的RNA病毒， 病毒基因組由8個分節段負鏈RNA組成。AIV基因組的分節段特性使得兩種或兩種W上不 同亞型流感病毒共同感染一個細胞時，子代病毒在裝配時其核酸片段可能W同源交換的形 式發生基因重排而導致抗原轉變，從而產生能引起大流行的新流行株。
[0003] 2013年12月6日，江西省南昌市一名73歲女子罹患H10N8亞型禽流感，因呼吸衰 竭、休克死亡，運是全球首例人類感染H10N8的死亡案例。2014年1月25日，也是在南昌， 又確診一例H10N8亞型禽流感。
[0004] 目前，急需建立一種快速檢測H10N8禽流感病毒的方法及開發相應試劑。

【發明內容】
陽0化]本發明要解決的技術問題是提供一種H10N8亞型禽流感病毒二重RT-PCR檢測引 物組、試劑盒及其應用。
[0006] 為解決上述技術問題，本發明采用W下技術方案：
[0007] 一種用于鑒定化0N8亞型禽流感病毒的引物組，包括2對特異性引物，分別是引物 對H10-1和H10-2、引物對N8-1和N8-2,其分別具有如沈QIDNo. 1至沈QIDNo. 4所示 的序列。
[0008] 一種用于鑒定H10亞型禽流感病毒的引物對，包括特異性引物H10-1和化0-2,它 們分別具有序列表SEQIDNo. 1至SEQIDNo. 2的堿基序列。
[0009] -種用于鑒定N8亞型禽流感病毒的引物對，包括特異性引物N8-1和N8-2,它們分 別具有序列表SEQIDNo. 3至SEQIDNo. 4的堿基序列。
[0010] 一種H10N8亞型禽流感病毒二重RT-PCR檢測試劑盒，包括反轉錄試劑、PCR試劑、 DEPC水和無RNA酶的超純水，所述的PCR試劑中含有2對特異性引物，其分別具有如SEQID No. 1至沈QIDNo. 4所示的序列。
[0011] 作為優選，所述的特異性引物H10-1和化0-2,N8-1和N8-2在所述的PCR試劑中 的終濃度為0. 1-0. 8μM。
[0012] 作為優選，所述的反轉錄試劑每管16μL其中SXReverseTranscriptase Buffer10μL、50pmol9merRandomPrimer2μL、10mMdNTPMixture2μL、40U RibonucleaseInhibitor1μL、5U/μLAMVReverseTranscriptaselμL。
[0013] 作為優選，所述的PCR試劑的體積為26. 2μL/管，其中包含2XEasy化qTMPCR SuperMix25μL，50μΜHlO-1 和HlO-2 引物各 0. 2μL、50μΜN8-1 和N8-2 引物各 0. 4μL。
[0014] 本發明還提供了所述的用于鑒定H10N8亞型禽流感病毒的引物組、所述的引物對 或所述的H10N8亞型禽流感病毒二重RT-PCR檢測試劑盒在鑒別H10N8亞型禽流感病毒、 H10亞型禽流感病毒和N8亞型禽流感病毒中的應用。 陽015] 本發明具有如下有益效果：
[0016] 1.發明人專口針對化0亞型禽流感病毒HA基因、N8亞型禽流感病毒NA基因設計 了 2對特異性引物，組合成H10N8亞型禽流感病毒二重RT-PCR檢測試劑盒，一管檢測即可 確定是否為H10N8亞型禽流感病毒、H10亞型禽流感病毒和N8亞型禽流感病毒的感染。利 用本發明的引物對、引物對組或試劑盒，可W檢測待測樣品中是否含有H10N8亞型禽流感 病毒、H10亞型禽流感病毒和N8亞型禽流感病毒感染。本發明建立了一次RT-PCR反應就 能同時檢測和鑒別H10亞型禽流感病毒、N8亞型禽流感病毒、H10N8亞型禽流感病毒的二 重RT-PCR檢測試劑盒。通過擴增條件優化、特異性和敏感性試驗，建立H10亞型禽流感病 毒和N8亞型禽流感病毒的二重RT-PCR檢測試劑盒，該試劑盒具有特異性強、靈敏度高、低 成本、高效率等優點，可用于臨床檢測H10N8亞型禽流感病毒。
[0017] 2.由于本發明在引物設計上利用擴增片段長度的不同直接判定擴增結果，使得該 法在結果判定時更簡便、直觀和實用。實驗證明，該法對同一樣品中的H10亞型禽流感病毒 和N8亞型禽流感病毒模板進行擴增，結果均得到與試驗設計相符的267bp化10亞型禽流感 病毒）、464bp(N8亞型禽流感病毒）的特異性擴增條帶，對新城疫、傳染性支氣管炎和傳染 性喉氣管炎常見禽病的檢測全為陰性。敏感性試驗結果表明，該法最低能檢測到1〇3拷貝/ μL的H10亞型禽流感病毒、N8亞型禽流感病毒。
[0018] 3.本發明可為Η10亞型、Ν8亞型、Η10Ν8亞型禽流感病毒的發病早期提供準確的 診斷結果，對切斷其傳播途徑有重要意義，可及時隔離與處理，對Η10Ν8亞型禽流感的有效 防控具有重要意義，應用前景廣闊，對養禽業可持續發展也有重要現實意義。
【附圖說明】
[0019] 圖1為本發明所建立Η10Ν8亞型AIV二重RT-PCR檢測試劑盒的特異性試驗結果 圖；
[0020] 其中：M-DLlOOOMarker;1-H10+N8 ;2-H10N7 ;3-冊N8 ;4-HlNl;5-H2N3 ;6-冊N2 ; 7-H4N6 ;8-H5Nl;9-H7N2 ;10-冊N4 ;11-朋N2 ;13-H12N5 ;14-H13N6 ;15-H14N5 ; 16-H15N9 ;17-NDV;18-IBV;19-ILTV;20-空白對照。 陽02U 圖2為本發明所建立H10N8亞型AIV二重RT-PCR檢測試劑盒的敏感性試驗結果 圖；
[0022]其中：M-DLlOOOMarker;1-1〇8拷貝/μL;2-1〇7拷貝/μL;3-1〇6拷貝/μL;4-1〇5 拷貝 /μL;5-1〇4拷貝 /μL;6-10 3拷貝 /μL;7-100 拷貝 /μL;8-10 拷貝 /μL;9-空白對 照。
【具體實施方式】
[0023] 下面結合具體實施例，對本發明作進一步詳細的闡述，但本發明的實施方式并不 局限于實施例表示的范圍。運些實施例僅用于說明本發明，而非用于限制本發明的范圍。此 夕F，在閱讀本發明的內容后，本領域的技術人員可W對本發明作各種修改，運些等價變化同 樣落于本發明所附權利要求書所限定的范圍。
[0024] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所 使用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。 陽0巧]AIV毒株化3N8、冊N8、H1N1、冊N2、H4N6、H9N2 和H11)、NDV、IBV和ILTV由廣西獸 醫研究所分離鑒定保存；AIV毒株化2N3、冊M、H10N3、H12N5)由香港大學惠贈；AIV毒株 的RNA化10N7、冊Nl、H7N2、H13N6、H14N5和H15N9)由美國康涅狄格州大學惠贈。Minibest viralRNA/DNAextractionkitver. 4.0和反轉錄試劑購自大連寶生物公司；膠回收試劑 盒購自Axygen公司；PCRSuperMix購自北京全氏金生物公司。
[0026] 連施例1:禽流威病毒二電RT-PCR引物設計及試劑盒的制備
[0027] (1)引物的設計
[0028] 根據GenBank中H10、N8亞型AIVHA和NA基因，用DNAStar軟件比對序列找出保 守區域，用Primer5.0軟件分析引物的擴增條件，通過NCBIBlast驗證，設計并合成了 2 對特異性引物（見表1)，用于H10亞型禽流感病毒和N8亞型禽流感病毒的檢測。 W29] 表1引物信息
[0030]
[0031] 注：AIVH10-1和H10-2引物對用來檢測是否含有化0