一株粘質沙雷氏菌及其在抑制腫瘤中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及一株粘質沙雷氏菌，及其在抑制腫瘤中的應用，屬于生物技術領域。
【背景技術】
[0002] WHO《全球癌癥報告2014》數據顯示，2012年全球癌癥患者和死亡病例都在增加，新 增病例近一半出現在亞洲，其中大部分在中國、印度。在肝、食道、胃和肺等4種惡性腫瘤中， 中國新增病例和死亡人數均居世界首位。手術治療有效，但多數患者就診時已經錯過手術 時機，只能依賴化療、放療，療效不佳。尋找新機制的治療方法是領域內不懈的追求。二十世 紀八十年代，有人發現細菌感染者的皮膚癌、淋己癌和白血病患病幾率較低，且發現運些細 菌注入動物體內會導致腫瘤萎縮，從此細菌及其產物治療腫瘤成為熱口課題之一。
[0003] 沙雷氏菌是眾多具有抑瘤效果的細菌之一。有關沙雷氏菌治療惡性腫瘤實驗研究 和臨床研究均不乏報道，1997年斬小青等發現粘質沙雷氏菌S311抑制小鼠艾氏腹水癌，小 鼠 P388白血病，小鼠 B16黑色素瘤肺轉移和小鼠 Lewis肺癌腫瘤細胞;2003年斬小青采用小 鼠模型研究粘質沙雷氏菌苗的抑制腫瘤的效果，提示腹腔注射可明顯抑制小鼠 HCA的原發 灶和轉移灶、抑制腫瘤轉移和復發。1993年化vas HF首先將粘質沙雷氏菌復方制劑用至臨 床11例難治性惡性腫瘤，發現1例輕微反應，1例部分反應，4例病情暫時穩定，5例病情進展， 其中一例艾滋病Kaposi's肉瘤患者病情得到改善。有關粘質沙雷氏菌治療腫瘤的報道資料 國內多于國外，1999年徐永茂等通過胸、腹腔內注射觀察了粘質沙雷氏菌S311的療效，發現 在5例癌性胸水患者中4例完全緩解，在9例癌性腹水患者中5例完全緩解。2000年顧建慶將 粘質沙雷氏菌S311制劑進行了 I期臨床試驗，結果提示制劑對胸水有效。2000年張巧平臨床 資料報道粘質沙雷氏菌S311制劑對惡性胸腔積液有效率為88.6%，完全緩解率48.6%，尤 其對少、中量積液療效較好。2001年朱允中在n臨床試驗中對241惡性胸水做了觀察，總有 效率92.1 %，且部分胸水癌細胞轉陰。2002年茅國新報道粘質沙雷氏菌制劑控制癌性胸腔 積液有效率達90.6 %，生活質量改善率為84.4%，0.5年、1年、1.5年生存率分別是:93.8%、 62.5 %、40.6%，毒副反應為胸痛（18.8 % )和發熱（15.6 % )。2007年王慶蓉對18例腦神經膠 質細胞瘤術后患者進行觀察，采用化療囊瘤內注射，發現1、2、4年的生存率分別為72.2%、 55.68 %、55.68%，高于對照組。2002年何曉文采用改良端粒重復序列擴增(TRAP)-銀染方 法檢測20例膀脫移行上皮細胞癌腫瘤組織粘質沙雷氏菌制劑灌注前后的端粒酶活性，發現 粘質沙雷氏菌制劑可使腫瘤組織端粒酶活性降低。
[0004] 有關沙雷氏菌的抑瘤現象已被諸多實驗資料證實，但是其療效機制至今研究不 明；綜合諸多資料，其抑瘤機制可歸納為兩個主要途徑，抑瘤機制之一是粘質沙雷氏菌胞壁 含有多種對腫瘤細胞直接細胞毒活性，具有直接殺傷腫瘤細胞的作用，比如1994年趙虎等 人發現粘質沙雷氏菌能夠直接殺傷體外培養的SMMC-7721細胞株、HeLa細胞株、KM3細胞株、 SO肉瘤細胞株等腫瘤細胞，對正常組織細胞無明顯的影響作用。還有些人認為粘質沙雷氏 菌抑制腫瘤的療效與其在28°C產生的靈菌紅素有關，且進行了提純，新合成的PG衍生物 GX15-070,作為多種癌癥的治療藥物，已進入臨床n期研究。根據NIC公布的數據，靈菌紅素 對人60個常見癌細胞株的平均IC50值約為2.化M，靈菌紅素NSC編號為47147-F。抑瘤機制之 二則認為粘質沙雷氏菌的抑瘤效果與免疫調節機制有關。資料提示，粘質沙雷氏菌制劑具 有巨隧細胞及T淋己系統刺激活性，可誘導巨隧細胞吞隧功能增強和分泌腫瘤壞死因子 (TNF)、干擾素（IFN)、白介素I(IL-I)及IL-2等免疫因子，可增強NK細胞殺傷活性，可抑制腫 瘤轉移相關基因nm23-l和Tiam-I的表達。比如粘質沙雷氏菌DNA含有的乂 pG結構"，具有強 大的免疫調節作用，能活化NK細胞、巨隧細胞和樹突狀細胞等抗原提呈細胞，使之產生IFN 和IL-12等化1細胞因子，從而抑制化2細胞因子化-4、比-5的產生，并阻斷I巧的合成，從而 有效抑制反應原誘導的高反應性及變態反應性改變，改善免疫功能的素亂。同時粘質沙雷 氏菌可W提高外周血及局部灌注周圍組織的T細胞亞群的功能，CD4+和CD8+細胞增加，改善 機體免疫功能低下，激活免疫系統，糾正細胞免疫及體液免疫的異常，從而促進疾病的恢 復。
[0005] 總之，對于粘質沙雷氏菌，前人雖然已做了許多研究，也公開過多個專利資料，但 終因療效不夠突出至今沒有發展成真正的臨床藥物，一直停留在實驗室研究階段。

【發明內容】

[0006] 針對上述現有技術，為了獲得更加突出的抑瘤效果的沙雷氏菌，本發明對引自中 國菌種庫的沙雷氏菌進行了紫外誘變，并采用抑瘤實驗、觀察抑瘤效果，篩選獲得了一株對 A549實體瘤和S180腹水瘤療效非常突出的粘質沙雷氏突變菌株，而且療效是在不產生靈菌 紅素的情況下產生的。經16S rDNA測序、比對，確定所篩選菌株為粘質沙雷氏菌。
[0007] 本發明是通過W下技術方案實現的：
[000引一株粘質沙雷氏菌，該菌株分類命名為沙雷氏菌Serratia SP.，已于2016年Ol月 11日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、，保藏編號為CGMCC NO.11987。
[0009] 所述粘質沙雷氏菌的16S rDNA序列，經與Genbank中其它菌的16S rDNA序列相比 對，此菌株與Genbank中Serratia SP.CH-B17同源性為99.79% ;與Serratiasp.E化4相似率 99.78% ,Serratia marcescens strainTCCC11387相似率99.77% ,Serratia marcescens 8付日;[]141]1209相似率99.76%，56祥日1:13 1]1日1'。63。6]13 8化日;[]1沈1?1相似率99.437%，運些 菌株同屬于粘質沙雷氏菌。
[0010] 所述粘質沙雷氏菌，經實驗證明，對A549實體瘤和S180腹水瘤的抑制效果明顯，療 效非常突出，因此，可W W該粘質沙雷氏菌為原料制備用于抑制腫瘤的藥物，比如:培養該 菌獲得培養物，并添加或不添加其它藥物、輔料等加工制備成菌劑。本發明為研究沙雷氏菌 的抑制腫瘤機制、用途、藥物開發等提供了優良的菌種資源。
【附圖說明】
[0011] 一株粘質沙雷氏菌SM-1，該菌株分類命名為沙雷氏菌Serratia SP.，已于2016年 Ol月11日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、，保藏編號為CGMCC NO. 11987，保藏地址為:北京市朝陽區北辰西路1號院3號，郵編：100101。
[001 ^ 圖1:正常對照組動物腹腔洗液涂片（200 X )。
[0013]圖2:正常對照組動物腹腔洗液涂片(400 X )。
[0014] 圖3:模型組動物腹水涂片(200 X )。
[0015] 圖4:模型組動物腹水涂片(400 X )。
[0016] 圖5:多西他賽對照組動物腹水涂片(200X )。
[0017] 圖6:多西他賽對照組動物腹水涂片(400X )。
[001引圖7: A群鏈球菌對照組動物腹水涂片(200 X )。
[0019] 圖8:4群鏈球菌對照組動物腹水涂片（400乂）。
[0020] 圖9: SMl組組動物腹水涂片(200 X )。
[0021] 圖10: SMl組動物腹水涂片(400 X )。
[0022] 圖11:模型對照組長出腫瘤的小鼠圖。
[0023] 圖12:模型組死亡的小鼠。
[0024] 圖13:接種A549細胞各組小鼠的腫瘤照片，其中，A為模型對照組，B為多西他賽治 療組，C為A群鏈球菌治療組，D為SM3組，E為SMl，F為SM5組。
[00巧]圖14:實驗組脾臟組織增大。
[00%]圖15:進化樹示意圖。
【具體實施方式】
[0027] 下面結合實施例對本發明作進一步的說明。
[0028] 下述實施例中所設及的儀器、試劑、材料等，若無特別說明，均為現有技術中已有 的常規儀器、試劑、材料等，可通過正規商業途徑獲得。下述實施例中所設及的實驗方法，檢 測方法等，若無特別說明，均為現有技術中已有的常規實驗方法，檢測方法等。
[0029] 實施例1菌種誘變
[0030] ( - )菌種誘變方法
[0031] 1.菌種擴增
[0032] 菌種源自中國普通微生物菌種保藏管理中屯、保藏的粘質沙雷氏菌，保藏號： CGMCC1.0589。無菌條件下，取原菌種10倍梯度稀釋后分別涂布在LB斜面培養基上37°C培養 2地。選擇菌落數目約為20個的平板，挑取較大、界限清晰、呈乳白色長勢良好的單菌落作為 紫外誘變的出發菌株，取其菌體于生理鹽水和玻璃珠的S角瓶中制成無菌菌懸液SOOmL，30 °C、250巧m水浴地，制備成IO 6CFlVmL的誘變菌懸液，備用。
[0033] 2.菌株誘變
[0034] 紫外燈預熱25min，分別取菌懸液IOmL置于多個平板(D = 9cm)中，均勻放置紫外燈 下25cm處照射不同的時間（0，10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60s )，然后分別從每個平 板中取出ImL的菌懸液W生理鹽水定容至IOmL,逐級稀釋至1〇-1、1〇-2、1〇- 3、1〇-4、1〇-5、1〇-6 倍，取各個梯度的稀釋液10化L在暗處涂布于平板固體培養基上，37°C培養2地;取出，挑取 長勢良好的菌落，試管斜面固體培養基保存，進行高產菌株的篩選。同時，用未照射的菌懸 液做空白對照，計算紫外誘變致死率。
[0035] 致死率=紫外誘變菌懸液的菌落數/未誘變菌懸液的菌落數。
[0036] 3.菌株選擇一一根據細菌生長狀況選擇
[0037] 3.1.平板初篩
[003引根據紫外誘變選取照射30s的誘變菌懸液生理鹽水稀釋至10-1、10-2、10- 3、10-4、10 4、1(T6倍，分別涂布于平板固體培養基，37°c培養24h。^菌落大小和生長狀態為觀測指標 選取單菌落35株，試管斜面傳代3次后，穩定生長的共6株，分別命名為SMl~6。
[0039] 3.2.搖瓶復篩
[0040] ①菌種：SMl、SM2、SM3、SM4、SM5、SM6。
[0041 ]②方法步驟:將上述菌株與出發菌株SMO分別采用10 %的接種量置于裝有LB液體 培養基的S角瓶(25mL/100mL)中、37°C培養2化，搖床