Angpt2抑制劑在制備用于治療血管瘤的藥物中的應用
【專利摘要】本發明公開了ANGPT2抑制劑在制備用于治療血管瘤的藥物中的應用，本發明首次證實在小鼠CCM3模型和人的CCM3腦血管組織中，發現ANGPT2顯著上調，在小鼠CCM3敲除模型中應用ANGPT2中和抗體能夠顯著改善因血管滲漏導致的腦出血情況，并顯著降低血管畸形病灶數目。由此可見，ANGPT2在血管發生異常的疾病發病中起重要調控作用，應用ANGPT2中和抗體等抑制劑，能夠為制備血管發生異常疾病相關的藥物提供依據。
【專利說明】
ANGPT2抑制劑在制備用于治療血管瘤的藥物中的應用
技術領域
[0001]本發明屬于生物醫藥技術領域，尤其涉及ANGPT2抑制劑在制備用于治療血管瘤的藥物中的應用。
【背景技術】
[0002]腦海綿狀血管畸形(cerebral carvernous malformat1n，CCM)是發生在中樞神經系統的一種血管錯構畸形，是先天性腦血管畸形的一種，約占腦血管畸形的10%?20%，人群患病率約0.1%?4%。
[0003]CCM由缺乏肌層和彈性纖維的大小不等的海綿狀血管竇組成，團狀毛細血管擴張，內壁為單層扁平的內皮細胞(endothelial cells,ECs)，缺乏周細胞(pericyte，PCs)覆蓋，無正常的血管基膜。由于血管內皮屏障發生改變，導致血管通透性增高，紅細胞外滲，并繼發腦實質炎癥反應，從而顯著增加中風、癲癇、神經功能缺失的風險。
[0004]CCM分為散發性和常染色體顯性遺傳，遺傳性CCM與3個致病基因種系突變相關，包?CCMl(KRITl,7qll.2-q21)^CCM2(MGC4607^7pl5-pl3)^PCCM3(CCM3^3q25.2-q27)o90%l^上的CCM病人攜帶這3個致病基因的突變。近十幾年來，3個CCM致病基因種系突變的研究報道非常多。由于CCM病灶組織內體細胞基因突變的發現提出了“二次打擊”機制(two-hitmechanism)學說，認為其參與了腦海綿狀血管瘤的發病機制，導致表達于腦海綿狀血管瘤毛細血管腔內皮細胞的致病基因編碼蛋白完全失去功能。這種學說最近已經在小鼠動物模型中被證實。出生后特異的內皮細胞Ccm基因的失活，會導致大腦出現CCM樣的損傷。雖然CCM發病機制尚不清楚，但分子遺傳學研究為我們深入理解CCM的發病機制和臨床治療提供了重要依據。鑒于目前缺乏有效的治療藥物，手術切除是CCM的唯一治療手段，因此，研究CCM的發病機制和尋找新的有效藥物或治療方法是當前的研究熱點。
[0005]血管生成素(ang1poietin)是內皮細胞特異性的促血管生成因子，在血管生成中起到重要作用。血管生成素家族有4種亞型，分別為Ang-1，Ang-2，Ang-3，Ang-4.Ang-1為由498個氨基酸組成的同源六聚體，基因位于8q22，主要由血管內皮周圍細胞(如周細胞)分泌，廣泛分布于胚胎及富含血管的成熟組織中，如子宮內膜、卵巢、肺、皮膚等。Ang-2基因位于8q23，是由496個氨基酸組成的同源二聚體，主要由內皮細胞分泌，分布于胚胎及血管重塑明顯的成熟器官，如胎盤、子宮、卵巢等。Tie 2是血管生成素家族的共同受體，Ang-1可與Tie 2受體特異性結合使其磷酸化，調節血管內皮細胞間及和周圍支持細胞間的相互作用，促進微血管結構的成熟和穩定，降低血管通透性。Ang-2(又簡稱ANGPT2)通過競爭阻斷Ang-1與Tie 2受體結合，抑制Tie 2受體磷酸化，減弱內皮細胞與周圍支持細胞及基質間的相互作用，解除血管基底膜和周圍細胞對血管結構的限制，松解血管結構，促使內皮細胞分離和迀移，導致血管的穩定性降低，通透性增加。

【發明內容】

[0006]本發明的目的在于克服現有技術存在的不足之處而提供了ANGPT2抑制劑在制備用于治療血管瘤的藥物中的應用，本發明發現ANGPT2在血管發生異常的疾病發病中起重要調控作用，應用ANGPT2中和抗體等ANGPT2抑制劑，能夠為制備CCM及其他血管瘤疾病藥物提供依據。
[0007]本發明采用的技術方案為:ANGPT2抑制劑在制備用于治療血管瘤的藥物中的應用，所述ANGPT2抑制劑通過降低ANGPT2蛋白水平來治療血管瘤，所述血管瘤以單層擴張的血管內皮細胞和減少的周細胞覆蓋為特征。
[0008]作為對上述技術方案的進一步改進，所述血管瘤為腦海綿狀血管瘤，所述血管內皮細胞為腦血管內皮細胞。
[0009]作為對上述技術方案的更進一步改進，所述腦海綿狀血管瘤由CCM3基因的功能缺失引發。
[0010]作為對上述技術方案的更進一步改進，所述ANGPT2抑制劑為ANGPT2中和抗體。
[0011]作為對上述技術方案的更進一步改進，所述ANGPT2中和抗體為單克隆抗體。
[0012]作為對上述技術方案的進一步改進，所述ANGPT2中和抗體的用量為10yg/g體重。
[0013]作為對上述技術方案的更進一步改進，所述ANGPT2中和抗體隔天腹腔注射。
[0014]作為對上述技術方案的進一步改進，所述藥物通過穩定血管內皮細胞連接、血管內皮細胞和周細胞的相互作用和血管的完整性來抑制血管瘤損害。
[0015]作為對上述技術方案的進一步改進，所述藥物還包括藥學上可接受的載體。
[0016]本發明建立了他莫昔芬誘導內皮細胞特定Ccm3基因敲除的CCM3小鼠動物模型(Ccm3-1ecK0);通過實時全內反射熒光顯微鏡，觀察Ccm3-1ecK0小鼠腦微血管結構出現CCM樣改變，內皮細胞和周細胞松解，縫隙連接被破壞，血管通透性增加；同時，內皮細胞分泌ANGPT2增加。進一步，通過ANGPT2中和抗體，挽救內皮細胞特異性敲除CCM3引起的腦血管病變，病灶數目減少。
[0017]發明人還在人的CCM標本中，證實了ANGPT2在正常腦組織區域不表達，但是在CCM損傷區域顯著上調。
[0018]因此，可以利用ANGPT2中和抗體，制備出治療CCM及其他血管畸形(即血管瘤)疾病藥物。
[0019 ]相對于現有技術，本發明的有益效果為:
[0020]本發明實驗結果首次證實在小鼠CCM3模型和人的CCM3腦血管組織中，發現ANGPT2顯著上調，在小鼠CCM3敲除模型中應用ANGPT2中和抗體能夠顯著改善因血管滲漏導致的腦出血情況，并顯著降低血管畸形病灶數目。由此可見，ANGPT2在血管發生異常的疾病發病中起重要調控作用，應用ANGPT2中和抗體等抑制劑，能夠為制備血管發生異常疾病相關的藥物提供依據。
【附圖說明】
[0021 ]圖1顯示了誘導型的內皮細胞特異性CCM3敲除的小鼠快速出現腦和視網膜CCM病變表型;野生型(WT)和誘導型的內皮細胞特異性CCM3敲除(Ccm3-1ecK0)的小鼠在出生后1-3天喂他莫昔芬，在P2-P10天取腦組織進行檢測；其中，A顯示了P2，P5，PlO天的WT和Ccm3-1ecKO小鼠腦組織切片HE染色結果;B顯示了 P2，P5，PlO天的WT和Ccm3_iecK0小鼠腦組織總CCM病灶數量統計結果;C顯示了 P2，P5，PlO天Ccm3-1ecK0小鼠腦組織CCM不同大小病灶數量統計結果；圖D-G顯示了CCM病變部位血管滲漏，其中:D為PlO天的WT和Ccm3-1ecK0小鼠新鮮腦組織;E-G:P10天的小鼠用FITC-葡聚糖灌注后進行免疫熒光檢測，E為腦組織熒光圖，箭頭指示血管滲漏，F為⑶31染色圖，箭頭表示正常腦組織結構，星號*顯示CCM病灶，G伊文思藍白蛋白檢測評價小鼠血腦屏障滲透性；圖H-J顯示了Ccm3-1ecKO小鼠視網膜病變，對PlO天的WT和Ccm3-1ecKO小鼠視網膜組織的CD31和isolectin蛋白進行免疫熒光染色，放大倍數H為20X，I為80X，星號*顯示CCM病變部位呈海綿狀異常血管團，J顯示了損害區域占比。
[0022]圖2顯示了 Ccm3-1ecK0小鼠血管內皮細胞連接的破壞、EC與PC的解離、和ANGPT2表達的升高;野生型(WT)和誘導型的內皮細胞特異性CCM3敲除(Ccm3-1ecK0)的小鼠在出生后1-3天喂他莫昔芬，在P5和PlO天取腦組織進行檢測;其中，A顯示了PlO天的WT和Ccm3-1ecK0小鼠小腦組織切片內皮細胞標記⑶31和周細胞標記NG2免疫熒光染色，B顯示了⑶31和EC-PC縫隙鏈接標記connexin-43(CX43)染色，其中，箭頭指示正常腦組織結構，星號*顯示CCM病灶，箭指示小腦葉之前的血管;C分別顯示了NG2和CX43在⑶31陽性的血管上的覆蓋率;D-F顯示了 PlO天的WT和Ccm3-1ecK0小鼠小腦組織切片VE-cadherin/CD31染色(D)和claudin-5/⑶31染色(E)，箭頭指示正常腦組織結構，星號*顯示CCM病灶;方框區域圖片用高倍顯示WT和Ccm3_iecK0病灶中VE-cadherin/CD31免疫焚光染色；F分別顯不了 VE-cadherin和claudin-5在CD31陽性的血管上的覆蓋率;G-H顯示了 P5和PlO天的WT和Ccm3-1ecK0小鼠小腦組織切片ANGPT2/⑶31染色結果，其中圖G中的高倍圖源自方框區域，標尺:10ym; I顯示了 ELI SA檢測WT和Ccm3-1ecK0小鼠的小腦、視網膜、肺和血液中的ANGPT2蛋白水平的結果；J-K顯示了 qRT-PCR和蛋白免疫印跡分別檢測P5和PlO天的WT和Ccm3_iecK0小鼠小腦組織中ANGPT2-TIE2信號通路的mRNA水平和蛋白水平的結果，所得統計數據為倍數變化(Ccm3-1ecKO組數值除以WT組數值所得倍數改變，把WT組的數值當為1);L-M顯示了 ANGPT2-TIE2信號通路在人CCM3病灶高表達，人CCM3切片標本作CD31和ANGPT2或p-TIE2(L)或Claudin-5(M)免疫熒光共染色，其中，箭頭指示正常血管，星號*指示CCM病灶，箭顯示CCM病灶中八恥?了2-1'^2染色陽性但(:1311(1丨11-5染色陰性。11=10，沖〈0.05，*仲〈0.01(非配對雙尾七檢驗)，數值為均數土標準誤。
[0023]圖3顯示了CCM3維護EC管腔形成和周細胞募集;其中，A-B顯示了Organotypic血管生成實驗結果;siRNAs轉染的HBMVECs被種在單層融合的成纖維細胞之上，在培養液中加或不加ant1-ANGPT2(10yg/ml)，共培養14天，通過VE-cadherin和collagen IV免疫熒光染色觀察EC出芽和管腔形成過程，結果如圖A所示;B顯示定量分析顯示血管分支的數量、平均管腔直徑、和成管的面積(collagen IV覆蓋的區域)；C_D顯示了3D出芽實驗結果;siRNAs轉染的HBMVECs包被在cytodex球珠上，然后cytodex球珠被埋在fibrin膠里，在EGM2培養液中培養8天，結果如圖C、D所示，其中，箭頭指示出芽，星號指示管腔，圖D顯示了出芽數量、出芽長度和管腔面積的定量分析結果；圖E-F顯示了3D出芽實驗觀察EC-PC相互作用；為了同時觀察出芽過程中的EC和PC，我們把表達綠色熒光蛋白EGFP的HBMVEC轉染不同的siRNAs(包括(:壯1或010或1^(:138)和表達紅色熒光蛋白1110^^7的正常!181^?(:以2:1的比例同時包被在cytodex球珠上，在培養液中加或不加ant1-ANGPT2( 10yg/ml)，共培養8天；圖E、F顯示了觀察到的EC出芽和周細胞覆蓋率及定量分析結果;n= 10，*P〈0.05，#P〈0.01,標尺:ΙΟΟμπι，實驗重復三次；需要說明的是，圖B從左至右依次顯示了 siCtrl、siUNC13B、siCCM3、siCCM3/siUNC13B、siCCM3/aAngpt2的分支數量、管腔直徑、血管面積，圖D從左至右依次顯示了siCtrl、siUNC13B、siCCM3、siCCM3/siUNC13B、siCCM3/aAngpt2 的出芽數量、出芽長度、血管面積，圖 F從左至右依次顯示了 siCtrl、siUNC13B、siCCM3、siCCM3/siUNC13B、siCCM3/aAngpt2、s iCCM3/s iUNCl 3B/aAngpt2 的出芽數量、PC 覆蓋率。
[0024]圖4顯示了 ANGPT2中和抗體能阻斷Ccm3-1ecK0小鼠的CCM血管損害的形成;野生型(WT)、誘導型的內皮細胞特異性CCM3敲除(Ccm3-1ecK0)和在Ccm3_iecKO基礎上合并Unc13b基因敲除(Ccn^kx/^^CdhS-CreEin^UnclSb—A，DK0)的小鼠在出生后1-3天喂他莫昔芬，從P2開始，隔天腹腔注射ANGPT2中和抗體(10yg/g體重)或正常IgGl到小鼠體內，在PlO天取腦組織進行檢測；圖A為新鮮腦組織大體形態學圖片，箭顯示CCM病灶，標尺:2mm;圖B-C顯示了HE染色和CCM病灶統計結果圖；圖D-E顯示了NG2/CD31，VE-cadherin/CD31 和Claudin-5/CD31免疫熒光共染和統計結果圖；圖F顯示了ANGPT2/CD31免疫熒光共染結果圖；G顯示了ELISA檢測腦組織中ANGPT2蛋白水平的結果圖；圖H-1顯示了P-TIE2/CD31免疫熒光共染和定量分析結果圖；η = 1，*P〈0.05，**P〈0.01，標尺:ΙΟΟμπι，數值為均數土標準誤；需要說明的是，圖C、E、G、I分別從左至右依次顯示了WT+IgG、WT+aAngpt2、iecK0+IgG、iecK0+aAngpt2、DK0+aAngpt2的CCM病灶數量，NG2覆蓋率、VE-cad覆蓋率、Cld5覆蓋率，Angpt2蛋白水平和P-TIE2陽性的EC。
【具體實施方式】
[0025]為更好的說明本發明的目的、技術方案和優點，下面將結合具體實施例對本發明作進一步說明。
[0026]我們研究發現，在內皮細胞特異敲除Ccm3基因的小鼠CCM模型中，內皮細胞分泌到胞外的ANGPT2增多，引起周細胞解離，血管通透性增加;通過ANGPT2抗體，中和分泌到胞外的ANGPT2，能夠減輕CCM樣損傷，揭示ANGPT2抗體可能成為CCM治療的新途徑。
[0027]它莫西芬(tamoxifen)，也即他莫昔芬；Ccm3與CCM3可替換使用；Ang_2、Angpt2、ANGPT2可替換使用；磷酸化的TIE2、p-Tie2、p-TIE2可替換使用;Uncl3b和Uncl3B可替換使用;Px天即第X天;aAngpt2即Angpt2中和抗體。
[0028]實施例
[0029]1、材料與方法
[0030]1.1它莫西芬誘導的血管內皮細胞特異性的(:(；1113基因敲除鼠((:(；1113-16(；1(0)模型的建立
[0031]為了便于通過Cre-LoxP系統研究Ccm3在血管內皮細胞中的功能，我們使用Cdh5-CreERT2轉基因小鼠。Cdh5-CreERT2轉基因技術原理是，首先將雌激素受體(ER)的配體結合域(LBD)突變，進而使其與Cre重組酶融合產生一個嵌合重組酶(Cre-ER)，該酶活性依賴于它莫西芬的存在，而不受體內雌激素的影響。通過利用Cdh5基因的啟動子驅動Cre重組酶基因在血管內皮細胞中的表達。該轉基因小鼠若服用它莫西芬，Cre重組酶的活性被激活，SP可導致Cre介導的重組在預定時間內和特定的組織細胞類型(這里是指血管內皮細胞)上發生。Cdh5-CreERT2轉基因小鼠的獲取也可參考已報道的文獻(可參見:Wang，Y.，etal.Ephrin-B2controls VEGF-1nduced ang1genesis andIymphangi ogene s is.Nature.2010May 27；465(7297):483-6.do 1: 10.1038/nature09002.)DCcm3fl/fl 小鼠(可參見:He Y，et al.Stabilizat1n of VEGFR2 s i gna lingby cerebral cavernous malformat1n 3is critical for vascular development.SciSignal.2010Apr 6;3(116):ra26.do1:10.1126/scisignal.2000722.)與Cdh5_CreERT2轉基因小鼠交配，即得到可誘導的血管內皮細胞特異性的Ccm3基因敲除鼠(Ccm3-1ecK0)。為了在小鼠體內用它莫西芬誘導Ccm3基因的敲除，我們用玉米油把它莫西芬(Sigma，T5648)配成濃度為10mg/ml的液體，給剛出生的Ccm3-1ecK0和WT(Ccm3fVfl)幼鼠從Pl至P3每天喂10Ug/g(體重)的它莫西芬一次，連續三天。我們從Dr.Nils Brose(Max Planck Institute ofExperimental Medicine ,Germany)得到Unc 13B基因缺失鼠，該鼠無任何表型，除了在I年后可發生癲癇，這可能是由于UNC13在腦的功能缺失導致。
[0032]1.2臨床樣品
[0033]我們從耶魯大學醫學院的神經病理學系的人體標本檔案館得到CCM3樣品。所有樣品均由兩名獨立的富有經驗的病理學家來評估CCM3樣品的免疫組化結果，他們事先并不知道患者的臨床信息。我們得到8例CCM3患者的蠟塊標本，并且每個蠟塊已有切好的切片20多張。我們通過H&E染色發現6例CCM3樣本含有典型的CCM樣損害，其病變周圍有相對正常的組織包繞;2例CCM3樣本有明顯的血管纖維化。我們進一步把這8例CCM3樣本進行免疫染色分析。
[0034]1.3小鼠體內ANGPT2中和抗體治療
[0035]我們用無菌的生理鹽水把人源化的鼠單克隆ANGPT2中和抗體(Genentech，USA，或DarronMedscience公司(廣州道瑞醫藥科技有限公司))稀釋成lmg/mL。從P2開始，隔天腹腔注射ANGPT2中和抗體(10yg/g體重)或正常IgGl到WT或Ccm3_iecK0小鼠體內。
[0036]1.4異硫氰酸熒光素葡聚糖$11~(:-(1^壯&11)灌注和伊文思藍化^11 Blue)染料滲透試驗
[0037]異硫氰酸熒光素葡聚糖(FD2000S; Sigma-Aldrich公司，St.Louis，M0，美國)溶于無菌的生理鹽水，離心10，OOOg 5分鐘，調整濃度為50mg/ml，收集上清，避光。同胎出生的WT或Ccm3-1ecK0小鼠經ANGPT2中和抗體處理或不經ANGPT2中和抗體處理均稱重，并腹部注射麻醉((氯胺酮100mg/kg+甲苯噻嗪10mg/kg))。眼球后注射按照已發表的文獻進行。注射部位選定為左眼角外眥。用3/10ml胰島素注射器(31G針頭)輕輕的沿45°角刺入小鼠的眼眶靜脈竇。以10μ1異硫氰酸熒光素葡聚糖對應Ig體重來根據體重換算相應異硫氰酸熒光素葡聚糖注射量，并注射入小鼠眼眶靜脈竇。5分鐘后，收集腦和視網膜，并進行組織鋪片或切片免疫染色處理。
[0038]伊文思藍染料滲透性實驗(Miles實驗)。伊文思藍染液(用0.9%NaCl溶液配成1%伊文思藍溶液;Sigma-Aldrich)注射入已麻醉的WT和Ccm3-1ecK0小鼠眼球后血管叢，注射量為ΙΟμΙ/g體重。注射30分鐘后，殺死小鼠并往左心室灌注PBS，以清洗血管內的染料。收集小腦組織，并在60°C中干燥過夜，在伊文思藍染料取出前稱重，用Iml的甲酰胺55°C下孵育小腦組織16小時以取出伊文思藍染料。用分光光度計(激發光波長為630nm)來檢測伊文思藍的含量。
[0039]1.5免疫熒光分析
[0040]收集小鼠腦組織，用4%多聚甲醛固定，OCT包埋并切片(5μπι厚度)，PBS沖洗兩次組織切片以移除OCT，并用PBS配成含5 %驢血清和0.3 % Tri tonX-100的封閉液，封閉和滲透組織切片半小時，以排除非特異性染色。組織切片用一抗4°C孵育過夜，如抗⑶31(1:100)，抗NG2(1: 100)，抗 VE-cadherin(l: 100)，抗 ΖΟ_1(1: 100)，抗 Claudin-5 (1: 100)，抗Ang1poietin-2(l: 100)，抗Connexin_43(l: 100)等。次日用PBS沖洗組織切片三遍，用二抗(l:200to 1:400)在室溫下孵育組織切片I小時。然后用I3BS沖洗三遍，組織切片用含DAPI(Vector Laboratory)的防焚光淬滅封片劑封片并拍照。細胞爬片免疫焚光染色方法與組織切片類似。簡言之，4 % PFA固定HBMVECs 20分鐘，用PBS清洗掉PFA，繼而用0.1 %的TritonX-1OO處理細胞爬片2分鐘以增加細胞通透性。封閉細胞半小時，相繼用一抗二抗孵育細胞，然后進行封片和拍照。
[0041]視網膜熒光染色。異硫氰酸熒光素葡聚糖灌注P5至P15出生的新生小鼠的眼眶周靜脈叢，收集眼球并在冰上用4%多聚甲醛固定2小時。繼而用PBS清洗掉4%PFA，在顯微鏡下去除角膜、晶狀體、鞏膜和玻璃體血管，解剖出完整的視網膜。將視網膜浸潤于含5%驢血清、0.5%Triton的PBS中4°C封閉過夜，然后相繼用含1%驢血清、0.1%Triton的PBS稀釋一抗(1:50)并4°C孵育過夜，熒光二抗4°C孵育過夜，用PBS清洗視網膜5次。以視乳頭為中心，在視網膜上用剪刀對稱地沿周邊視網膜向中心放射狀做4個切口，使視網膜平鋪成花瓣狀，熒光封片劑封片。用TCS SP5共聚焦顯微鏡(Leica，德國)拍照。用NIH Image J軟件統計血管面積占整個視網膜的百分比。
[0042]1.6組織中的基因表達
[0043]用含DNaseI的RNeasy 1^1:((^38611，\^1611(^3，0六)消化組織，提取出總1?嫩。按Qiagen標準程序(Super Script first-strand synthesis system;Qiagen)將RNA(Iyg量)進行反轉錄。繼而用特定引物(如ANGPTl ,ANGPT2和Tie-2)和iQ SYBRGreen Supermix配好反應液，在iCycler實時監測系統(B1-Rad Laboratories, Inc.,Hercules ,CA)進行實時定量聚合酶鏈式反應(qPCR) ^NGPTl，ANGPT2和Tie-2引物序列如下:
[0044 ] 小鼠來源:
[0045]ANGPTIRTF:ATTCTTCGCTGCCATTCT
[0046]ANGPTIRTR:CAGTTCCCGTCGTGTTCT
[0047]ANGPT2RTF:TTCCTCTTGGGTGCTTTA
[0048]ANGPT2RTR:CGCTTATTTGGTGGTTATT[0049 ] T i e 2RTF:AGGGCAAGATGGATAGGG
[0050 ] T i e 2RTR:TGAGCACAGGGAGGGTTA[0051 ]人來源:
[0052]ANGPTIRTF:AGAACCTTCAAGGCTTGGTTAC
[0053]ANGPTIRTR:GGTGGTAGCTCTGTTTAATTGCT
[0054]ANGPT2RTF:CTCGAATACGATGACTCGGTG
[0055]ANGPT2RTR:TCATTAGCCACTGAGTGTTGTTT
[0056]Tie2RTF:TCCGCTGGAAGTTACTCAAGA
[0057]T i e 2RTR:GAACTCGCCCTTCACAGAAATAA
[0058]1.7細胞培養和生長因子
[0059]我們根據以前的實驗方法(可參見:Waters JP,Kluger MS,Graham M,Chang WG,Bradley JR and Pober JS.1n vitro self-assembly of human pericyte-supportedendothelial microvessels in three-dimens1nal coculture:a simple model forinterrogating endothelial-pericyte interact1ns.J Vasc Res.2013;50:324-31.)分離Ccm3_iecK0小鼠腦微血管內皮細胞(Mouse brain microvascular ECs，MBMVECs)。純的微血管內皮細胞表達VE-cadherin，血管性假性血友病因子(von ffillebrand factor)和CD31陽性及VEGFR2信號，但不表達周細胞的標記(如SMA和NG2)。所有實驗我們用3代以內的原代腦微血管內皮細胞。我們用10nM的4羥基它莫西芬(Sigma, H7904)處理MBMVECs以在體外誘導Ccm3基因的敲除，用溶劑(DMSO/乙醇)處理的細胞為正常對照組。我們從Ang1-Proteomie公司(Boston，USA)購買到人腦微血管內皮細胞(Human brain microvascularECs，HBMVECs ； cAP0002)和人腦微血管周細胞(HBMVPCs ； cAP-0030)。內皮細胞用微血管內皮細胞生長液(Microvascular Endothelial Cell Growth Medium_2MV，Lonza)培養，周細胞用含有FBS和生長因子(Ang1-Proteomie)的周細胞培養液培養。人肺成纖維細胞用含有1 % FBS的DMEM培養液培養，并在14代以內使用。
[0060] 1.8慢病毒載體和包裝系統
[0061 ]我們使用Trans-Lentiviral 包裝系統。CCM3-WT(l-212aa)和 CCM3-N(人類患者中含有N端l-95-aa的縮短突變體)的編碼序列通過pLEX MCS載體克隆(Clontech)。從Clontech購買能表達mCherry(rLV.EFl.mCherry-9)的慢病毒。轉染質粒并包裝慢病毒。轉染62小時后，收集條件培養基，通過低速離心清除碎片，0.45-μΜ過濾器(Falcon ,LincolnPark，NJ)過濾。然后用所得條件培養基稀釋病毒載體，并加入8yg/ml聚凝胺(Sigma，St.Louis，M0)，培養過夜轉染HBMVEC。第二天換液，細胞繼續培養36小時，并用熒光顯微鏡觀察RFP的表達量。CCM3突變的表達量用蛋白質印跡檢測。通過50，000g 90分鐘高速離心條件培養液來濃縮病毒載體。離心后的濃縮小球用含有4yg/ml聚凝胺的PBS重懸，PBS體積為0.05%的初始條件培養液的容量，滴定病毒載體濃度并于_80°C中保存。
[0062]1.9酶聯免疫吸附測定ANGPT2
[0063]為測量人內皮細胞的上清液中ANGPT2的含量，處理細胞后在不同時間點收集細胞上清液。ELISA實驗嚴格按照標準的ELISA方法實施，并用以下抗體檢測，R&D的抗ANGPT2抗體、重組人4吣?了2(625-4^025)、人4吣?了21&113(]\^8098)、人4吣?了2生物素化]\&113(831110981)。為了測量在老鼠細胞和組織的ANGPT2，相應的ELISA試劑盒來自R&D(MANG20 WPABCAM(abl71335)。為進行免疫印跡，速凍老鼠組織，并在聚丙烯酰胺凝膠電泳前混勻于RIPA裂解液。為酶聯免疫吸附實驗，需碾碎新鮮的老鼠組織并在無血清培養皿中孵化2小時，進而測定上清液中的ANGPT2蛋白水平。
[0064]1.10實時TIRF顯微鏡
[°065] 我們根據以前的實驗方法(可參見:Zhang Y,Tang W1Zhang H,Niu X，Xu Y,ZhangJ,Gao K,Pan W1Boggon TJ,Toomre D,Min V and Wu D.A network of interact1nsenables CCM3and STK24to coordinate UNC13D-driven vesicleexocytosis inneutrophils.Dev Cel I.2013; 27: 215-26.)進行實時全內反射熒光顯微鏡檢測。具體用1X70倒置顯微鏡像(Olympus)，裝備一個氬激光譜線(488nm)，一個TIRFM冷凝器，一個60 X1.45NA TIRF物鏡(Olympus)和一個EMCCD鏡頭(iXon887;AndorTechnology)。通過iQ軟件(And0rTechn0l0gy)控制成像系統。關于活細胞成像，HBMVEC細胞種入含1.5號玻璃底的35mm培養皿中(MatTek，Ashland，MA)，并用EGM-2-MV培養基培養(Lonza，cc-3202)。首先用RNAiMAX(ThermoFisher)轉染 siRNAs 到HBMVEC 細胞內。24 小時后，用Cytofect-內皮細胞轉染試劑盒(Cell Applicat1ns Inc.,TF101K)轉染VAMP8_Phluorin質粒到細胞內。再經過24小時，細胞放入37 0C的孵化室，以200毫秒的間隔獲取轉染細胞的實時動態圖像，進而用MATLAB系統的ImageJl.42軟件(來源于美國國立衛生研究院)處理分析圖像。
[0066]I.11跨內皮通量和TEER測量
[0067]跨內皮通量的檢測，內皮細胞接種入纖維蛋白包被的96W20idf金電極的ECIS培養皿中(Applied B1Physics)，并用EGM-2培養基(Lonza，cc_3202)培養并轉染siRNAs。通過記錄72小時內的細胞基質的電阻抗傳感來評估內皮細胞的屏障功能。
[0068]1.12 Organotypic血管生成實驗
[0069]我們采用經改進的Organotypic血管生成實驗(可參見:Hetheridge C1Mavria Gand Mellor H.Uses of the in vitro endothelial-fibroblast organotypic co-culture assay in ang1genesis research.B1chem Soc Trans.201I;39:1597-600.)。用逆轉錄病毒(Μ0Ι 20)轉染HBMVECs使其表達綠色熒光蛋白(EGFP)，2天后再轉染siRNAs到細胞體內；或直接給未轉染EGFP的HBMVECs轉染siRNAs，I天后消化HBMVECs，并在預先鋪上2X 14人成纖維細胞并達到融合的24孔板內每孔接種含或不含EGFP表達的經siRNAs轉染的8.5 X 13的HBMVECs。我們每兩天給細胞換EGM2培養液，并在2至14天在熒光顯微鏡下直接通過綠色焚光蛋白觀察小管形成，或通過VE-cadherin和Co I Iagen IV免疫焚光染色觀察小管形成。
[0070]1.13三維出芽實驗
[0071 ]用LipofectamineRNAiMAX(Invitrogen)轉染siCtrl, siUNC13B，siCCM3或siCCM3與siUNC13B的聯合到HBMVECs作用8小時或過夜，接著給HBMVECs換成新鮮的微血管內皮細胞生長液(Microvascular Endothelial Cell Growth Medium_2MV，Lonza)培養。我們參照文南犬(Nakatsu MN and Hughes CC.An optimized three-dimens1nal in vitro modelfor the analysis of ang1genesis.Methods Enzymol.2008 ;443:65-82.)進行三維出芽實驗。細胞轉染24小時后，S卩被消化并與一定數量的微載體珠(C3275，Sigma)混勻在含有1.5ML EGM2 — MV培養液的流式細胞管里，放進培養箱培養，4小時內每隔20分鐘輕拍打管壁，以使最終每個微載體珠包被有接近400個細胞。第二天，把這些包被有HBMVECs的微載體珠包埋在2mg/ml的纖維蛋白膠里，繼而把20，000/孔的成纖維細胞鋪在纖維蛋白膠上層，并給每孔細胞1.01^含或不含4如?12中和抗體(148/!111或1(^8/1111;661^1^6(*或廣州道瑞醫藥科技有限公司)的EGM2—MV培養液。每兩天給細胞換液并從2至13天通過顯微鏡觀察細胞出芽狀況、管腔形成、血管分支形成及融合過程。
[0072]1.14HBMVECS和HBMVPCs共培養系統的三維出芽實驗
[0073]我們參照文獻進行血管內皮細胞和周細胞的相互作用的三維出芽實驗(Waters，J.P.,et al.1n vitro self-assembly of human pericyte-supported endothelialmicrovessels in three-dimens1nal coculture:a simple model for interrogatingendothelial-pericyte interact1ns.J Vasc Res 50，324-331(2013);Chang，W.G.，Andrejecsk,J.ff.,Kluger,M.S.,Saltzman,ff.M.&Pober,J.S.Pericytes modulateendothelial sprouting.Card1vasc Res 100，492-500(2013);Scheppke，L.，etal.Notch promotes vascular maturat1n by inducing integrin-mediated smoothmuscle cell adhes1n to the endothelial basement membrane.Blood I19，2149—2158(2012).首先用逆轉錄病毒(MOI 20)轉染HBMVECs使其表達綠色熒光蛋白(EGFP)，用腺病毒(MOI 20)轉染HBMVPCs使其表達mCherry。繼而用LipofectamineRNAiMAX(Invitrogen)轉染siCtrl，siUNC13B，siCCM3 或 siCCM3 與 siUNC13B 的聯合到 HBMVECs。細胞轉染 24 小時后，即被消化并按ECs:PCs(2:1)的比例與一定數量的微載體珠(C3275，Sigma)混勻，培養在含有
1.5MLEGM2—MV培養液的流式細胞管里，放進培養箱，4小時內每隔20分鐘輕拍打管壁，以使最終每個微載體珠包被有接近400個細胞。我們選擇ECs:PCs(2:1)的比例是因為周細胞比血管內皮細胞長得快，且在ECs: PCs (1:1)的比例條件下周細胞限制內皮細胞的出芽。第二天，把這些包被有HBMVECs的微載體珠包埋在2mg/ml的纖維蛋白膠里，繼而把20，000/孔的成纖維細胞鋪在纖維蛋白膠上層，并給每孔細胞1.0ML含或不含ANGPT2中和抗體(lyg/ml或10yg/ml;美國Genentech公司或廣州道瑞醫藥科技有限公司)的EGM2—MV培養液。每兩天給細胞換液并從2至8天通過熒光顯微鏡觀察內皮細胞出芽狀況、血管內皮細胞形成小管的周細胞的覆蓋率。
[0074]以上試驗中我們所用的siRNA由美國SantaCruz公司合成，人的UNC13B基因為以下三個有效s iRNA的混合物:
[0075]sc-42022A:
[0076]正義鏈序列:GGAUUGCGCUGAAGACUAUtt
[0077]反義鏈序列:AUAGUCUUCAGCGCAAUCCtt
[0078]sc-42022B:
[0079]正義鏈序列:GACAUCAAGUCAAGAGUAAtt
[0080]反義鏈序列:UUACUCUUGACUUGAUGUCtt[0081 ] sc-42022C:
[0082]正義鏈序列:GGAUCGACCUCUCUACAUAtt
[0083]反義鏈序列:UAUGUAGAGAGGUCGAUCCtt
[0084]CCM3基因的s iRNA為以下三種s iRNA的混合物:
[0085]sc-62084A:
[0086]正義鏈序列:GGAUAUAGCUAGUGCAAUAtt
[0087]反義鏈序列:UAUUGCACUAGCUAUAUCCtt；
[0088]sc-62084B:
[0089]正義鏈序列:CAACCGACUAAUUCAUCAAtt
[0090]反義鏈序列:UUGAUGAAUUAGUCGGUUGtt；
[0091]sc-62084C:
[0092]正義鏈序列:GGAUUAUUGCCAUCUUACAtt
[0093]反義鏈序列:UGUAAGAUGGCAAUAAUCCtt。
[0094]2.結論
[0095]2.1誘導型的血管內皮細胞特異性Ccm3敲除的小鼠產生CCM損害
[0096]給剛出生的WT(Ccm3fl/fl)幼鼠和可誘導的血管內皮細胞特異性的Ccm3基因敲除(Ccm3-1ecK0)小鼠從Pl至P3每天喂他莫昔芬，在P2-P10取腦組織進行檢測。結果發現，Ccm3-1ecK0小鼠能在小腦快速產生CCM血管損害，即擴張膨脹伴出血的毛細血管，該病損在P5可見、PlO急劇增大增多(如圖1A—C所示)。沒有Ccm3-1ecK0能存活超過Ρ15(η>50)<^ΙΤ(:-dextran小鼠體內循環灌注實驗顯示，FITC-dextran局限于WT小鼠腦和視網膜的毛細血管床內，但在Ccm3-1ecK0小鼠FITC-dextran彌散滲漏到小腦擴張的毛細血管床外的周邊組織(如圖1D-F所示hEvans Blue染料滲漏實驗也證實了Ccm3_iecK0小鼠小腦增強的血管滲漏(如圖1G所示)XCM樣靜脈血管畸形也在Ccm3ECK0小鼠視網膜周邊血管叢被檢測到(如圖1H-1所示)。
[0097]2.2CCM損害表現為血管內皮細胞連接的破壞和ANGPT2表達的升高
[0098]Ccm3_iecK0小鼠的小腦血管損害以單層擴張的血管內皮和嚴重減少的周細胞覆蓋為特征(如圖2A-C所示)。縫隙連接蛋白connexin-43免疫熒光染色在Ccm3-1ecK0小鼠也明顯減少，這表明血管內皮細胞和周細胞相互作用的完整性受破壞(如圖2A-C所示)。類似地，Ccm3_iecK0小鼠血管內皮細胞粘合連接蛋白VE-cadherin和緊密連接蛋白claudin-5在小腦CCM血管損害處表達不規則、明顯減少(如圖2D-F所示)。血管內皮細胞分泌的ANGPT2被經典地認為是ANGPTl的拮抗劑，ANGPT2能拮抗ANGPTl穩定血管的功能，增加血管內皮細胞通透性。在WT小鼠小腦ANGPT2可在正常血管內皮細胞內檢測到，然而它在Ccm3-1ecK0小鼠的小腦擴張的血管內和血管病損周圍均顯著升高(如圖2G-H所示)JLISA也檢測到Ccm3-1ecKO小鼠的小腦和視網膜顯著升高的ANGPT2蛋白水平，但在Ccm3-1ecK0小鼠的肺和血樣未檢測到升高的ANGPT2蛋白水平(如圖21所示)，這與CCM血管損害形成部位一致。ANGPT2(而不是ANGPTl或TIE2)的mRNA表達水平在P5天Ccm3-1ecK0小鼠的小腦輕度增加，在PlO顯著增加(如圖2J所示)。我們意外地發現Ccm3ECK0小鼠的小腦增加的TIE2蛋白磷酸化水平(如圖2K所示)，提示CCM血管損害發展過程中ANGPT2-TIE2信號通路的激活。為證明ANGPT2的上調具有臨床相關性，我們檢測CCM3病變患者的ANGPT2的表達水平。我們在相對正常區域的腦組織未發現ANGPT2和p-TIE2陽性染色，但在CCM病變區域發現顯著升高的ANGPT2和P-TIE2表達，伴血管內皮細胞緊密連接的破壞(如圖2L-M所示)。
[0099]2.3 CCM3-ANGPT2信號軸調控EC管腔形成和周細胞募集
[0100]如我們在Ccm3-1ecK0小腦所見CCM3調控血管管腔直徑，我們用體外實驗EC出芽模型和管腔形成模型分析CCM3對內皮出芽和管腔形成的影響。表達綠色熒光蛋白EGFP和/或siRNAs轉染的HBMVECs被種在單層融合的成纖維細胞之上，在7至14天共培養過程中觀察管腔形成過程。VE-cadherin和collagen IV免疫熒光染色顯示CCM3缺失的內皮細胞出芽和管腔形成明顯增加(如圖3A所示)。定量分析顯示血管分支的數量、平均管腔直徑、和成管的面積(Co I Iagen IV覆蓋的區域)在CCM3敲低組明顯增加(如圖3A-B所示)。因CCM3缺失引起的增加的EC出芽和擴大的管腔形成不受正常IgG處理的影響，但能被同時沉默UNC13B表達或用ANGPT2中和抗體所抑制(如圖3A-B所示)。為了進一步證實CCM3調控EC管腔形成和周細胞募集，我們用3D出芽實驗來驗證，該實驗中ECs包被在cytodex球珠上，然后cytodex球珠被埋在fibrin膠里，繼而在膠上層鋪上成纖維細胞。我們發現，因CCM3敲低引起的增加的EC出芽和擴大的管腔形成能被同時沉默UNC13B表達或用ANGPT2中和抗體所抑制(如圖3C-D所示)。
[0101]3D出芽實驗也是被用來研究周細胞或平滑肌細胞募集和血管成熟的一個系統。為了同時觀察出芽過程中的E C和PC，我們把表達綠色熒光蛋白EGFP的HBMVE C轉染不同的siRNAs(包括Ctrl或CCM3或UNC13B)和表達紅色熒光蛋白mCherry的正常HBMVPC以2:1的比例同時包被在cytodex球珠上。在出芽過程中，PC被招募到正常的EC上，但CCM3敲低的EC不能招募PC(如圖3E所示)。然而，在EC同時沉默UNCl3B表達或用ANGPT2中和抗體或兩者的結合能恢復正常的PC募集到出芽EC上(如圖3E-F所示)。我們的結果提示CCM3能通過抑制EC中ANGPT2的胞吐作用，維護正常EC細胞連接、EC管腔形成和PC募集。
[0102]2.4 ANGPT2中和抗體能阻斷Ccm3-1ecK0小鼠的CCM血管損害的形成
[0103]研究表明高劑量的ANGPT2中和抗體能強烈抑制血管生成。大體形態學和HE染色結果顯示ANGPT2中和抗體能顯著減少Ccm3-1ecK0小鼠的CCM血管損害的形成(如圖4A-C所示)。我們進一步檢測ANGPT2中和抗體和Uncl3b基因缺失的聯合效應對CCM血管損害的影響。ANGPT2中和抗體能完全消除DKO小鼠(Ccm3-1ecK0:Uncl3b—Λ)小腦和視網膜的CCM血管病變(如圖4Α-C所示)ο微血管周細胞(NG2陽性)覆蓋率在正常IgG處理的Ccm3-1ecKO小鼠為20 %，在ANGPT2中和抗體處理的Ccm3-1ecKO小鼠上升到超過80 %，而在ANGPT2中和抗體處理的DKO小鼠上升到接近100 % (如圖4D-E所示)。在EC粘附連接和緊密連接方面，我們也發現類似的結果(如圖4D-E所示)。我們進一步在體內實驗檢測ANGPT2中和抗體對ANGPT2-TIE2信號通路的影響。我們檢測到Ccm3-1ecK0小鼠的小腦病變擴張血管周圍彌漫著ANGPT2陽性的免疫熒光染色伴隨著升高的TIE2蛋白磷酸化染色(如圖4F，H所示)<XCm3-1ecK0小鼠的病變小腦彌漫的ANGPT2陽性的免疫熒光染色，升高的ANGPT2總蛋白水平和TIE2蛋白磷酸化水平能被ANGPT2中和抗體顯著降低，甚至在DKO小鼠能被ANGPT2中和抗體完全抑制(如圖4F-1所示)。綜上所述，我們的研究結果支持以下結論:Ccm3基因敲除能誘導ECs分泌ANGPT2，從而導致EC細胞連接的破壞、EC和PC的解離，有助于CCM疾病表型的進展。
[0104]3.結論分析
[0105]本研究，我們報道血管內皮細胞特異性Ccm3基因敲除(Ccm3-1ecK0)的小鼠產生的CCM損害表現為小腦出血、EC細胞連接的破壞、EC和PC的解離，這與小腦擴張的微血管周圍升高的ANGPT2分泌有關。我們在Ccm3-1ecK0小鼠小腦和視網膜組織發現升高的ANGPT2分泌，但未在肺組織和血樣中發現升高的ANGPT2分泌。CCM3只在腦和視網膜對ANGPT2有作用，這為血管內皮細胞特異性Ccm3基因敲除的小鼠只在腦和視網膜組織產生CCM損害提供了一個可能的解釋。體外研究證實血管內皮細胞Ccm3基因缺失能導致EC細胞連接的破壞、擴大的管腔形成和減少的周細胞募集。這些EC表型與Ccm3基因缺失內皮細胞中增高的ANGPT2分泌和釋放有關，ANGPT2中和抗體能顯著抑制Ccm3基因缺失的EC表型，在小鼠CCM模型能抑制CCM損害的進展，這與它能穩定EC細胞連接、EC-PC相互作用和血管完整性有關。
[0106]最后所應當說明的是，以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非對本發明保護范圍的限制，盡管參照較佳實施例對本發明作了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的實質和范圍。
【主權項】
1.ANGPT2抑制劑在制備用于治療血管瘤的藥物中的應用，所述ANGPT2抑制劑通過降低ANGPT2蛋白水平來治療血管瘤，所述血管瘤以單層擴張的血管內皮細胞和減少的周細胞覆蓋為特征。2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于:所述血管瘤為腦海綿狀血管瘤，所述血管內皮細胞為腦血管內皮細胞。3.根據權利要求2所述的應用，其特征在于:所述腦海綿狀血管瘤由CCM3基因的功能缺失引發。4.根據權利要求1所述的應用，其特征在于:所述ANGPT2抑制劑為ANGPT2中和抗體。5.根據權利要求4所述的應用，其特征在于:所述ANGPT2中和抗體為單克隆抗體。6.根據權利要求4所述的應用，其特征在于:所述ANGPT2中和抗體的用量為10yg/g體重。7.根據權利要求4所述的應用，其特征在于:所述ANGPT2中和抗體隔天腹腔注射。8.根據權利要求1所述的應用，其特征在于:所述藥物通過穩定血管內皮細胞連接、血管內皮細胞和周細胞的相互作用和血管的完整性來抑制血管瘤損害。9.根據權利要求1所述的應用，其特征在于:所述藥物還包括藥學上可接受的載體。
【文檔編號】A61K45/00GK106075448SQ201610590828
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年7月25日 公開號201610590828.6, CN 106075448 A, CN 106075448A, CN 201610590828, CN-A-106075448, CN106075448 A, CN106075448A, CN201610590828, CN201610590828.6
【發明人】王敏, 周煥嬌
【申請人】廣州道瑞醫藥科技有限公司