專利名稱：犬五聯(犬狂犬、犬瘟熱、犬細小病毒、犬腺病毒2型、犬副流感)活疫苗的制作方法
技術領域：
本發明涉及采用犬副流感病毒、犬瘟熱病毒、狂犬病毒、細小病毒、腺病毒制成的為病毒性抗原的醫藥制品。
犬狂犬病、犬瘟熱、犬細小病毒性腸炎、犬傳染性肝炎/犬傳染性喉氣管炎和犬副流感是犬群中常見的六大傳染病，其中有的疫病發病率與死亡率高達50-100％，嚴重影響了軍犬警犬的發展和名貴犬品種的保種以及民間守門防盜犬的生命安全。國外美、英、法、日、俄等國在70年代就已開始研制預防以上六種犬傳染病的單項活疫苗，到80年代后期，在四聯(無狂犬)苗的基礎上研制成功了包括鉤端螺旋體菌素在內的犬五聯苗。60年代中期我國雖有獸用狂犬病羊腦滅活苗，但因工藝復雜、劑量大、副作用強烈、成本高，很難滿足全國各地防疫需要。1983年農科院中國獸藥監察所從國外引進了狂犬ERA弱毒株，并和有關廠家協作試制成功了獸用狂犬病活疫苗。尤其是犬瘟熱迄今我國仍無源于我國本土制苗的種子毒，且用國外種毒制備的疫苗與我國野毒抗原性仍有偏移，結果導致了部分用苗單位的動物保護不確實。
本發明的目的是采用獲自我國病犬體內分得的野毒并經致弱馴化的犬瘟熱弱毒株為對象，以及和從國外引進的狂犬病毒、犬細小病毒、犬腺病毒2型、犬副流感病毒一起配制成五聯苗，并加適當耐熱穩定劑而制成。該五聯苗安全性可靠、免疫效果好、且針對性強，適合我國病犬疾病的預防，可用于預防狂犬病、犬瘟熱、犬細小病毒、犬傳染性肝炎/犬傳染性喉氣管炎和犬副流感六種傳染病；且制苗工藝科學，程序可操作性強，經濟效益可觀，適于工業化生產。
本發明的目的是這樣實現的犬五聯(犬狂犬、犬瘟熱、犬細小病毒、犬腺病毒2型、犬副流感)活疫苗。其生產工藝主要流程是種毒分離鑒定→細胞上傳代馴化→變溫變速擴增→收毒→安全、效力檢驗→濃縮→測定毒價→按比例配苗→加穩定劑→分裝→凍干→成品檢驗→貼簽包裝。其中作為制苗用種毒的犬狂犬病毒毒株ERA-836為國內多數現行制苗的毒種，犬細小病毒CPV-XN1、犬腺病毒2型CAV2-XN3和犬副流感病毒CPIV-XN4三株病毒均由從國外引進的SoLovary公司出品的犬四聯苗中分離鑒定篩選而得，其特別之處在于本發明中的犬瘟熱病毒弱毒株為在我國西北地區病犬體內分得的一株野毒，經在種源有異的細胞上傳代馴化、克隆擴增、誘變減毒、篩選而得，經鑒定，此毒株馴化譜清晰(見表)遺傳穩定性可靠、與國際標準毒株SH-CDVOnder-stepoot株具有共同抗原性。因此，該犬瘟熱病毒弱毒毒株系制備活疫苗的最佳候選毒株。
在疫苗生產過程中本發明提供了一種變溫變速旋轉培養新工藝。經理論探討可能在35℃培養的病毒，隨著增殖不斷釋放在培養液中，該病毒因對光色素及鹽離子抵抗力較脆弱，使病毒在液體里不斷滅活，這樣就降低了單位體積內的毒價，如果待病變達30％時，將溫度降至22℃增高轉速，待病變形成80-90％時收毒，這樣可提高毒價33％左右，平均TCID50可提高3倍。
本發明還提供了采用培養物物理性凍融濃縮新技術。將馴化后病毒苗液半成品冷凍后，再將凍結的毒液移至室溫下，令其自然融化，抽棄上層約1/3或1/2的區帶液體，將剩余毒液進行濾過，所得濾液即為制苗用濃縮性原苗。
本發明還提供了一種新的耐熱穩定劑配方，用于保護疫苗的抗原性，見表II。
附圖
為犬五聯疫苗的工藝流程簡圖。
下面將結合(附圖)實施例作進一步詳述。
從國外引進的Solovary公司制作的犬四聯苗中，分離篩選出增殖性良好的CPV-XN1、CAV2-XN3、和CPIV-XN4毒株，另外還通過離體異種細胞交叉傳代，獲得我國唯一的CPV-112毒株，狂犬病毒ERA-836則系國內現行制苗弱毒株。用于培養的雞胚成纖維細胞(CEF)用SPF雞胚自行制備，BHK21株地鼠腎細胞，非洲綠猴腎細胞系Vero，F81株貓腎細胞系和MDCK株狗腎細胞系，均由農業部中監所或衛生部藥品檢定所提供。將ERA-836、CPV-XN1、CPV-XN112，CAV2-XN2和CPIV-XN4分別在BHK21、F81CFF、MDCK和Vero細胞上培養。
其過程分別為
①CDV-XN112雞胚絨毛尿囊膜上盲傳5代→雞胚成纖維細胞上連傳47代→三次蝕斑克隆篩選種毒→MDCK細胞上傳40代→雞胚成纖維細胞上傳20代。傳至90代時，該毒株對犬即失去致病性。
②CPV-XN1在F81上傳1-5代。即為制苗用犬細小病毒性腸炎疫苗種毒，③CAV2-XN3在MDCK上傳2-5代，即為犬肝炎與喉氣管炎疫苗種子毒。
④CPIV-XN4在Vero增養7天即為犬副流患種子毒。
⑤ERA-836前期由蘭州獸醫生物藥廠提供，后期在BHK21細胞上培養制備而得。
在培養過程中當病毒的CPE達30％時，就將培養瓶由35℃、轉速8-9轉/分轉移至22℃、轉速14轉/分條件下，以提高單位體積內的毒價。
培養過程完成后測定疫苗的安全性、效力及病毒抗原滴度，然后將裝有單種疫苗的培養瓶在-30℃下冷凍12小時，然后將培養瓶移至室溫下，待瓶內毒液自然融化后，抽棄上層約1/2-1/3液體，下層的毒液即為濃縮后的疫苗液，換算效價后，可將ERA-636、CPV-XN1，CDV-XN112，CAV2-XN3和CPIV-XN4培養液按0.15、0.40、0.15和0.15ml的比例混合均勻，將此弱毒苗液與耐熱穩定劑等量混合，充分搖勻，銅網過濾后，定量分裝于瓶中，每瓶2ml，置可自動壓塞的凍干機中凍干升華，最后測定其真空度含水量，并做三檢后于低溫或4-8℃保藏。
將疫苗作無菌、安全與效力測定。(見表III)。
本發明的優點1、針對性強生產犬五聯苗中所用的犬瘟熱弱毒株為從我國病犬體內分得，與進口的四株毒株按適當比例配比適于我國病犬六種傳染病犬狂犬病、犬瘟熱、犬細小病毒性腸炎、犬傳染性肝炎/犬傳染性喉氣管炎、犬副流感的預防，確系我國病犬傳染病預防首選特效藥品。
2、保護性好此犬五聯苗中所用的耐熱穩定性配方速溶性好，耐熱性強，外觀可與進口疫苗相比美。
3、毒價效力高生產工藝中采用轉溫轉速培養及冷凍濃縮兩種新工藝，使疫苗中平均毒價提高1～2倍左右，且保持原抗原滴度的穩定性，可保持五種弱毒病毒粒子的完整性。值得一提的是該工藝還可剔除苗液中的小牛血清，避免犬體接種后所產生的異種蛋白性過敏反應發生，使單位體積內病毒含量成倍地提高。
本發明生產工藝科學，設備要求不高、可適于工業化大批量生產，因而此犬五聯苗高效價廉，有利于在我國普遍推廣應用。
表I CDV-XN112株毒株馴化譜增殖 乳鼠神回 歸※傳代代次 增殖基質 溫度 CPETCID50經毒力 電鏡 動 物1代雞胚絨 35℃ 非膿性※ 1-1兩相熱毛尿囊膜 蝕斑±2代雞胚絨 35℃ 10-2± 萎頓毛尿囊膜3代雞胚絨 35℃ 10-3+ 萎頓毛尿囊膜4-5代 雞胚成 33℃+10-3.510-4+ 萎頓纖維細胞6-10代 蝕斑克隆 33℃+10-410-3+ 一過型(Vero)11-30代 小斑擴增 33℃+10-410-3.5+減食一天(Vero)31-50代 小斑擴增 33℃+10-4.510-3+一過型(Vero)51-80代 犬MDCK 33℃+10-5.010-4+無異常細胞81-100代 犬MDCK 33℃+10-5.510-3+無異常細胞101-110代 雞胚成33℃+10-4.510-2+無異常纖維細胞
權利要求
1.犬五聯(犬狂犬、犬瘟熱、犬細小病毒、犬腺病毒2型、犬副流感)活疫苗，其生產工藝主要流程是種毒分離鑒定→細胞上傳代馴化→變溫變速擴增→收毒→安全、效力檢驗→濃縮→測定毒價→按比例配苗→加穩定劑→分裝→凍干→成品檢驗→貼簽包裝。其中作為制苗用種毒的犬狂犬病毒毒株ERA-836為國內多數現行制苗的毒種，犬細小病毒CPV-XN1、犬腺病毒2型CAV2-XN3和犬副流感病毒CPIV-XN4三株病毒均從國外引進的SoLovary公司出品的犬四聯苗中分離鑒定篩選而得，其特征在于本發明中的犬瘟熱病弱毒株為在我國西北地區病犬體內分得的一株野毒，經在種源有異的細胞上傳代馴化、克隆擴增、誘變減毒、篩選而得，經鑒定，此毒株馴化譜清晰，遺傳穩定性可靠、與國際標準毒株SH-CDV株具有共同抗原性，該犬瘟熱病毒弱毒毒株系制備活疫苗的最佳候選毒株。
2.根據權利要求1所述的犬五聯苗，其特征在于在疫苗生產過程中本發明提供了一種變溫變速培養新工藝，即在培養過程中待細胞病變達30％時，將溫度調降并增高轉速，待病變形成80-90％時收毒，這樣可提高毒價33％左右，平均TCID50可提高3倍。
3.根據權利要求1或2所述的犬五聯苗，其特征在于在疫苗生產過程中本發明還提供了一種培養物物理性凍融濃縮新技術，將病毒苗液半成品冷凍后，再將凍結的毒液移至室溫下，令其自然融化，抽棄上層約1/3或1/2的區帶液體，將剩余毒液進行濾過，所得濾液即為制苗用濃縮性原苗。
4.根據權利要求3所述的犬五聯苗，其特征在于本發明還提供了一種新的耐熱穩定劑配方，用于保護疫苗的抗原性，其配方為脫脂奶粉800～1200g，三餾水600～9000ml，蔗糖3％～10％，明膠0.1～0.4％，VC 1∶100～1∶200，谷氨酸鈉6％～10％，丁胺卡那霉素100～200萬μ，兩性霉素3.25～6.25mg，強力解毒敏50～200毫升/萬，K2HO410～13.15g，KH2PO42.0～4.48g。
全文摘要
犬五聯(犬狂犬、犬瘟熱、犬細小病毒、犬腺病毒2型、犬副流感)活疫苗。本發明采用我國病犬體內分得的野毒并經致弱馴化的犬瘟熱弱毒株為對象，以及和從國外引進的狂犬病毒、犬細小病毒、犬腺病毒2型、犬副流感病毒一起配制成五聯苗，并加適當耐熱穩定劑而制成，在制苗過程中本發明提供了轉溫擴增、物理冷凍濃縮新技術、及改良的耐熱穩定劑，使疫苗濃度高，免疫效果好，且針對性強，生產工藝科學，設備要求不高，因而此五聯苗高效價廉，有利于在我國普遍推廣應用。
文檔編號A01N63/04GK1137347SQ9510674
公開日1996年12月11日 申請日期1995年6月22日 優先權日1995年6月22日
發明者李六金 申請人:中國人民解放軍第四軍醫大學