一組結節病血清特異性標志蛋白及其檢測試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬生物技術和醫學檢驗領域，涉及用于識別結節病的檢測標志物及其檢測 試劑盒。尤其涉及一組結節病血清特異性標志蛋白及其檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002] 臨床研究顯示，結節病病因不明，以非干酪性上皮樣肉芽腫為病理特征，全身各個 器官幾乎均可受累，其中最為常見的受累器官是肺臟和胸內淋巴結。由于結節病臨床表現 多樣且缺乏特異性，其確診主要依靠排他性診斷，需要除外許多其他肉芽腫性疾病，其中 最為困難的是結節病與菌陰結核病的鑒別診斷，尤其在中國這樣的結核病高發國家顯得 更為突出。目前對于兩者的鑒別診斷多集中在尋找結核桿菌的證據方面，而且多側重于 結核病的標志物的研究。有研究報道，結節病血清標志物有血清可溶性白細胞介素受體 2(sIL-2R)，血清血管緊張素轉化酶（SACE)和II型肺泡細胞表面抗原6(KL-6)等，但實踐 證實，這些標志物的敏感性和特異性并不理想，并且對于結節病和結核病的鑒別診斷方面 未見后續報道。還有研究通過實時定量PCR方法檢測結節病和結核病病理組織中結核分 枝桿菌DNA，從病理組織角度建立結節病和菌陰結核病的鑒別診斷方法；以及通過建立臨 床-影像-病理綜合評分系統用于二者的鑒別診斷，所述方法可以用于解決部分結節病與 菌陰結核病的鑒別難題，但仍然存在假陽性和假陰性的問題，并且所述方法必須以取得病 理活檢為應用前提，而病理活檢的方式及病理醫師診斷經驗常會對診斷的正確率產生很大 的影響；
[0003] 本申請的的發明人之前的研究中用結節病患者血清標本篩選出血清淀粉樣物質 A(SAA)作為診斷標志物，其診斷結節病特異度僅為52. 5%，作為單一的指標用于結節病的 診斷明顯不足。
[0004] 因此，尋找一種更為特異、敏感、簡便、可靠的用于上述兩種疾病的鑒別診斷的檢 測試劑及其檢測試劑盒已成為本領域研究人員較為關注的問題。

【發明內容】

[0005] 本發明的目的是克服現有技術的缺陷，提供一種用于識別結節病的檢測標志物及 其檢測試劑盒。
[0006] 本發明中，所述的檢測試劑含有一組或一組以上的相關結節病與結核病的血清學 差異蛋白，本發明的實施例中篩選相關結節病與結核病的血清學差異蛋白瘦素（leptin) 及細胞間粘附分子1 (ICAM-1)。
[0007] 本發明的另一目的是提供含有上述檢測試劑的檢測試劑盒。
[0008] 所述的檢測試劑盒包含固相和上述相關結節病與結核病的血清學差異蛋白，本發 明的實施例中優選血清學差異蛋白1印tin及ICAM-1。
[0009] 本發明的另一目的是提供上述相關結節病與結核病的血清學差異蛋白1印tin及 ICAM-1在制備用于鑒別診斷結節病的檢測試劑中的用途。
[0010] 本發明通過下述技術方案實現：
[0011] 利用蛋白芯片技術，將篩選出的差異蛋白用酶聯免疫吸附試驗（ELISA)以及免疫 組化（IHC)的方法驗證后，篩選其中的相關結節病與結核病的血清學差異蛋白，本發明的 實施例中優選血清學差異蛋白1印tin及ICAM-1 ;進一步的進行所述的差異蛋白的血清濃 度數據的統計學分析處理以及平行試驗與序列實驗的靈敏度及特異度分析處理，確定相關 結節病與結核病的血清學差異蛋白，尤其是差異蛋白1印tin及ICAM-1聯合用于檢測結節 病與結核病的血清濃度，為鑒別結節病和菌陰結核病提供便捷的特異度及靈敏度高的檢測 試劑以及檢測試劑盒。
[0012] 本發明中，還提供了采用所述的檢測試劑以及檢測試劑盒對于結節病以及菌陰結 核病進行檢測的方法及其模型。
[0013] 本發明通過檢測血清中差異表達的蛋白，聯合采用統計學的方法分析處理，在不 需取得活檢組織的情況下，僅僅通過檢測患者的血清蛋白，既能在一定程度上獲得兩種疾 病的血清蛋白之間的差別后，基于受試者工作特征曲線（ROCcurve)對制備的診斷試劑及 其試劑盒的檢測效力進行評價。
[0014] 本發明中將上述的相關結節病與結核病的血清學差異蛋白，尤其是差異蛋白 leptin及ICAM-1運用R0C曲線、邏輯回歸（logisticregression)及平行序列實驗分析等 統計學方法建立一組鑒別模型，對所述的差異蛋白的血清濃度數據以及平行試驗與序列實 驗的靈敏度及特異度分析處理，確定相關結節病與結核病的血清學差異蛋白表達的差異， 尤其是差異蛋白leptin及ICAM-1聯合或單獨使用的差異，分析結果有利于鑒別診斷參考。
[0015] 本發明中，采用所述的檢測試劑盒通過下述步驟對結節病以及菌陰結核病進行檢 測：
[0016] 1)包被
[0017] 取所要包被的商品化leptin和ICAM-1抗體，設計所需濃度，根據各包被孔數計算 所需包被物的量，用包被液稀釋至所需體積，分加至各孔中：
[0018] 包被條件：ELISA板直接置4°C過夜；或先置37°C孵育2小時再轉入4°C過夜；
[0019] 2 洗滌
[0020] 包被結束后棄掉包被液，用PBST進行洗滌，方法為PBST加滿每孔，靜置5-10min， 棄掉洗液，重新加滿，重復洗滌3-5次，最后拍干ELISA板等待下一步封閉；
[0021] 3 封閉
[0022] 常用10%小牛血清，取步驟2的ELISA板加封閉液至每孔，體積至少為所加包被液 的兩倍；封閉條件：置于4°C過夜，或置于37°C溫育2-4h;
[0023] 4 洗滌
[0024] 封閉結束的ELISA板進行洗滌，方法同步驟2,排干ELISA板；
[0025] 5加入待檢樣品（血清）
[0026] 按實驗所需稀釋倍數用包被液稀釋進行稀釋，至所需濃度后加入相應孔中，反應 條件為37°C孵育2h;
[0027] 6 洗滌
[0028] 具體同步驟4;
[0029] 7加相應HRP-標記的商品化二抗
[0030]加相應的商品化HRP-標記的二抗（如一抗為鼠源物質則對應加抗鼠二抗），一般 也用封閉液稀釋，稀釋倍數參考二抗說明書；將稀釋好的二抗加入各孔，37°C反應1-1. 5h;
[0031] 8再洗滌
[0032] 具體同步驟4;
[0033] 9 顯色
[0034] 用商品化TMB顯色液作為底物，顯色液分加至ELISA各孔中；然后將ELISA板置于 37°C反應約lOmin;
[0035] 10 終止：
[0036] 取出ELISA板，每孔加終止液（2mol/L硫酸溶液）終止反應，立即到酶標儀上讀數 (波長為450nm)，根據cutoff值判斷對結節病鑒別效力程度。
[0037] 本發明的一個實施例中，ICAM-1 的cutoff值為 57740pg/ml，Leptin的cutoff值 為 1193. 186pg/ml。
[0038] 本發明實驗研究結果表明，通過蛋白芯片技術發現差異表達蛋白，經ELISA及免 疫組化鑒定的1印tin及ICAM-1兩種因子經過統計學模型的建立，為兩者的鑒別診斷提供 有意義的輔助。該模型并不僅限于所述的差異蛋白1印tin及ICAM-1，還可以用于驗證存在 差異表達的所有可能的差異蛋白，分別分析不同聯合組合的鑒別效力。
[0039] 本發明的優點在于：
[0040] 本發明進行了免疫組化實驗，驗證了所述的差異蛋白Leptin、ICAM-1在結節病肺 組織及縱膈淋巴結中表達陽性率明顯高于結核病組，兩者表達有明顯差異；并進行了兩種 差異蛋白-細胞因子的血清濃度數據的統計學分析處理以及平行試驗與序列實驗的靈敏 度及特異度分析處理，結果顯示，所述的相關結節病與結核病的血清學差異蛋白，尤其是差 異蛋白1印tin及ICAM-1聯合用于檢測結節病與結核病的血清后，特異度為73. 1%，敏感度 為 86. 5%。
【附圖說明】
[0041] 圖1為單因素方差分析及事后比較檢驗（PostHocTests)分析組間差異因子，
[0042] 其中顯示，結節病分別與結核病和健康對照組間Leptin、ICAM-1差異均有顯 著意義；結核病與健康組間兩種因子均無統計學差異（P> 〇. 05);血小板衍生生長因子 BB(H)GF-BB)在三組間均無差異。
[0043] 圖2為免疫組化驗證活檢組織中差異蛋白的表達，
[0044] 其中顯示，Leptin在結節病肺組織中呈強陽性表達，彌漫性分布在肉芽腫及周圍， 而結核病肺組織中肉芽腫為非特異性染色；Leptin在結節病淋巴結肉芽腫中央較濃聚，表 達呈強陽性，而其在結核病淋巴結肉芽腫中央有弱陽性表達，兩者表達有明顯差異。
[0045] 圖3為免疫組化驗證活檢組織中差異蛋白的表達，
[0046] 其中顯示，ICAM-1在結節病肺組織及淋巴結中強陽性表達，呈彌漫性和簇狀分布， 結核病肺組織中肉芽腫周圍為非特異性染色或者弱陽性表達。
[0047] 圖4為R0C曲線模型，
[0048]其中分別顯示了BMI、1印tin、ICAM-l三者單獨檢測結節病和結核的R0C曲線與運 用logstic回歸聯合形成聯合因子檢測結節病和結核病的R0C曲線。
【具體實施方式】
[0049] 實施例1
[0050] 1)蛋白芯片血清差異蛋白分析
[0051] 收集結節病以及健康獻血者的外周血血清各3例，首先用蛋白芯片技術 (RayBiotechHumanCytokineAntibodyArrayGSeries1000)初篩比較 3 例結節病患 者及3例健康人血清中120種重要的炎癥細胞因子水平，根據結果及文獻報道定制了包括 30種重要分子的蛋白芯片（RayBiotechQAH-⑶ST);運用生物芯片系統分析所述細胞因子 在結節病（20例）及對照組（結核病組20例、正常對照組20例）外周血血清中的含量；
[0052] 所用試劑盒為廣州RayBiotech公司定制的抗體芯片，掃描儀為美國Axon公司 Genepix熒光掃描儀；實驗步驟按其說明書進行，采用Genepix熒光掃描儀Cy3通道掃描信 號，QAH-CUST-G數據分析軟件進行數據分析；
[0053] 蛋白芯片血清差異蛋白分析結果如表1所示，篩選出結節病與結核病組之間3個 差異蛋白分別為 ICAM-1，L印tin，PDGF-BB，P < 0· 05。
[0054] 表1蛋白芯片篩選結果
[0055]
[005υ」

[0057] *a、SA結節病，TB結核病，HC健康對照
[0058] *b、p < 0· 05, /表示未檢測到濃度。
[0059] 2)用ELISA驗證蛋白芯片初篩出血清中的差異蛋白
[0060] 將蛋白芯片的初篩結果擴大樣本量運用ELISA驗證，ICAM-1、L印tin、TOGF-BB ELISA試劑盒購自上海欣奧盛公司（NeobioscienceTechnologyCompanyLimited),實驗 所用酶標儀為BioTekInstruments公司ELX808,操作步驟按試劑盒說明書進行；在450nm 波長下測定吸光度值，計算各樣品濃度；
[0061] 相關分析結果顯示，leptin在血清中含量與BMI成正相關（p< 0· 0001)，r= 0.549 (Pearson相關系數），顯示兩者顯著相關；回歸分析顯示BMI與1印tin含量存在直 線回歸關系（P< 〇. 001)，即1印tin隨著BMI的增加而升高；這與1印tin表達與體重有關 的報道一致，為了排除體重對1印tin的影響，以BMI為協變量，做結節病組與結核病組對 leptin血清濃度影響的協方差分析，經校正后的結節病和結核病組leptin血清濃度