專利名稱：從復雜混合物中鑒定出單一活性實體的方法
技術領域：
本發明涉及為獲得活性實體的篩選混合物的方法。
背景技術：
常規的蛋白質組學設法產生有機體全部蛋白質組的詳盡特征圖，以及通過該信息的分析來鑒定潛在的診斷和治療實體。目前，用于分離蛋白質混合物的優勢技術是二維凝膠電泳和多維液相色譜法，都和質譜分析法偶聯。顯示該方法能力的實例是分離和鑒定了酵母中1,484個蛋白質(Washburn等，Nat.Biotechnol.，9(3)242-2471(2001))。蛋白質分離和鑒定的定量方法是同位素編碼的親和標記物(ICAT)，由Aebersold和同事發展起來的(Smolka等，Anal.Biochem.，297(1)25-312(2001))。ICAT包括應用同位素地正常或重試劑來對蛋白質進行位點特異性的共價標記，以定量蛋白質表達的水平。還有另一個分離和鑒定蛋白質方法的實例是酵母雙雜交篩選試驗的整體形式，由Uetz等(Uetz等，Nature，403(6770)623-627(2000))和Ito等(Ito等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，98(8)4569-4574(2001))發展起來的，其鑒定了釀酒酵母(Saccharmycescerevisiae)中超過4,000個蛋白質-蛋白質相互作用。盡管這些方法用于分離和鑒定蛋白質是作用強大的，但是它們沒有鑒定分級分離蛋白質的細胞功能。
在組合產生的固定在珠子上的配體庫上已經分離了復雜蛋白質混合物。本領域公知的組合和綜合化學技術可以產生上百萬的配體的庫，(Lam等，Nature，35482-84(1991)和國際(PCT)專利申請WO92/00091)其中每個都具有結合分子的能力。例如，線性六聚體配體的庫由18個天然氨基酸構成，含有34×106個不同的結構。當氨基酸類似物和異構體也包括在內時，潛在結構的數量實際上是無限的。基本上每個珠子在其表面具有單個結構的上百萬的拷貝，不同的珠子含有不同的序列。此外，庫中珠子的總數量可以是巨大的。
在將實體分子暴露于組合庫之后，實體將通過親和性的相互作用結合至庫里的特異性配體。在平衡狀態中，實體在支持物，例如承載親和性配體的珠子上的濃度，將依賴于親和常數與配體和實體的濃度。在公開的篩選方法中，當使用純化的、放射性標記的初始實體時，結合的實體及其配體的檢測可以是直接的(Mondorf等，J.PeptideResearch，52526-536(1998))。其他方法包括通過對抗實體的抗體來檢測(Buettner等，International Journal of Peptide & ProteinResearch，4770-83(1996)；Furka等，International JournalPeptide Protein Research，37(6)487-493(1991)；以及Lam等，(1991)見上文)。可以使用固定在粘合劑上的珠子和扣除篩選方法結合來檢測多實體的配體。這稱作QuASAR方法(國際(PCT)專利申請WO 01/40265)并用于檢測結合病毒和朊病毒蛋白質的配體。
在使用基于珠子的庫的相關但不同的方法中，實體蛋白質在其正常的生理環境中與結合至珠子的肽配體庫一起溫育。在分級分離后，將珠子固定并排列在低熔點瓊脂糖薄凝膠上以生成配體的粗略“陣列”。將蛋白質結合性膜(硝化纖維素或PVDF)放置在膠上，在各種條件下將蛋白質從珠子上洗脫，并通過溶劑擴散通過凝膠的單向毛細管轉移將蛋白質捕獲到與其在凝膠中相同的相應位置上(與DNA的Southern轉移相似)。由于所有存在于初始混合物中的蛋白質存在于膜上，初始混合物是和固定在珠子上的配體結合的，膜自身可以剝離和再次被不同的已知蛋白質標記。
在前述的方法中，其中使用了固定在珠子上的組合產生的配體庫，基于它們和配體的結合簡單分離和鑒定了實體蛋白質，而不是基于實體蛋白質的生化或生物學功能。因此，本領域存在這樣的需要從復雜混合物中分離和鑒定蛋白質的方法，該方法基于所鑒定蛋白的化學的、物理的、生物學的，和/或生化功能而不僅僅基于它們結合庫中配體的能力。
本發明提供了這樣的方法。本發明的這個與其他目的和優點，以及其他的創造性特征，將從本文中提供的本發明的描述中表現出來。
發明概述本發明提供了用于獲得活性實體的篩選混合物的方法。在第一個方法中包括(i)提供大量配體，其中每個配體連接至支持物以形成大量配體-支持物復合體，(ii)在使至少一個實體與至少一個配體-支持物復合體結合的條件下，將配體-支持物復合體和含有大量實體的混合物接觸，由此形成至少一個實體-配體-支持物復合體，(iii)將至少一個實體-配體-支持物復合體與未結合的實體分離，(iv)測定至少一個分離的實體-配體-支持物復合體中的至少一個實體的活性，(v)檢測活性，以及(vi)選擇至少一個具有實體的實體-配體-支持物復合體，其展示檢測到的活性。
在第二個方法中包括(i)提供大量配體，其中每個配體連接至支持物以形成大量配體-支持物復合體，(ii)在使至少一個實體與至少一個配體-支持物復合體結合的條件下，將配體-支持物復合體和含有大量實體的混合物接觸，由此形成至少一個實體-配體-支持物復合體，(iii)將至少一個實體-配體-支持物復合體與未結合的實體分離，(iv)將至少一個實體-配體-支持物復合體和將配體-支持物復合體分離入集合體，(v)從至少一個分離的實體-配體-支持物復合體離解出至少一個實體，(vi)從集合體中移除配體-支持物復合體或步驟(v)中的至少一個離解的實體，(vii)將步驟(v)中至少一個離解的實體進行活性試驗，(viii)檢測活性，以及(ix)選擇至少一個展示檢測到的活性的實體。
在第三個方法中包括(i)提供大量配體，其中每個配體連接至支持物以形成大量配體-支持物復合體，(ii)在使至少一個實體與至少一個配體-支持物復合體結合的條件下，將配體-支持物復合體和含有大量實體的混合物接觸，由此形成至少一個實體-配體-支持物復合體，(iii)將至少一個實體-配體-支持物復合體與未結合的實體分離，(iv)將至少一個實體-配體-支持物復合體和將配體-支持物復合體分離入集合體，(v)給每個集合體中加入半固體或粘性材料，其中至少一個分離實體-配體-支持物復合體的實體從復合物中離解出來，并擴散進材料中，由此形成實體的濃度梯度，其中實體的濃度隨著從離解出實體的配體-支持物復合體距離的增加而逐漸降低，(vi)將步驟(v)中至少一個分離的實體進行活性試驗，(vii)檢測活性，以及(viii)選擇至少一個展示檢測到的活性的實體。
發明詳述本發明提供了篩選混合物用于獲得活性實體的方法。在第一個方法中包括(i)提供大量配體，其中每個配體連接至支持物以形成大量配體-支持物復合體，(ii)在使至少一個實體與至少一個配體-支持物復合體結合的條件下，將配體-支持物復合體和含有大量實體的混合物接觸，由此形成至少一個實體-配體-支持物復合體，(iii)將至少一個實體-配體-支持物復合體與未結合的實體分離，(iv)測定至少一個分離的實體-配體-支持物復合體中的至少一個實體的活性，(v)檢測活性，以及(vi)選擇至少一個具有實體的實體-配體-支持物復合體，其展示檢測到的活性。
此處所用的術語“混合物”指任何含有多于一種實體的集合，其中此處所用的術語“實體”指任何生物學的、化學的，或生化實體或目標物，如化合物，分子，病毒，或細胞。優選地，混合物是不同實體的集合，每個具有不同的化學特性，例如，分子式、化學結構、核苷酸序列或氨基酸序列，或每個具有不同的物理特性，例如，光譜信號或構象。更優選地，混合物是含有多種不同實體的集合。本領域普通技術人員理解的是混合物可以含有各具有不同化學或物理特性的實體的一個或多個拷貝。
組成混合物的實體可以從天然或合成的產品中分離，以及可以是天然的有機物質或無機物質(例如，合成的無機化合物或合成的有機化合物)。例如，實體可以是藥物或藥物候選物(如小分子藥物候選物)、肥料成分、殺蟲劑成分或其衍生物、類似物，或對映體。此外，實體對于任何原核生物或真核生物可以是內源或外源的，例如，細菌、真菌、酵母、植物或哺乳動物。適用于本發明的實體包括，但不限制于，細胞(例如干細胞或培養中的細胞)、蛋白質、肽、藥物、抗體、合成分子、有機化合物、蛋白質復合物(例如凝血因子XIII和血纖蛋白原或凝血因子VIII和Von Willebrand因子)、細菌、病毒、真菌、酵母、朊病毒、氨基酸、核酸、碳水化合物、脂類，上述物質的任何同種型，以及上述物質的任何組合。優選地，實體是蛋白質。合適的蛋白質實體包括，例如，受體、抗體、免疫原、酶(例如蛋白酶)，以及酶底物。更優選地，蛋白質是源自血漿的蛋白質。最優選地，源自血漿的蛋白質是免疫球蛋白，例如，IgG、IgM、IgA、IgE。免疫球蛋白可以來自患病狀態的有機體，(以及任選地在健康被試者血漿中未發現的)或作為制劑例如藥物施用的結果而生產。或者，優選的實體是細胞。更優選地，細胞是干細胞。
本發明方法的實體可以從任何來源獲得，即，含有實體的混合物可以是任何復合混合物，如土壤、空氣、水、食物的提取物，評估環境污染的棉拭，中間或末期化學反應混合物，等等。含有實體的混合物可以是化學或合成混合物，以及可以在壓力、溫度等等極端條件下存在于組合庫中和/或存在于有機溶劑中。優選地，混合物是生物流體、環境提取物，或含有化合物的組合物。
“生物流體”意味著得自原核生物或真核生物有機體的任何水溶液。生物流體可以直接從原核生物或真核生物有機體獲得，如血液、淋巴、淚液、唾液、汗液，以及尿液。或者，生物流體可以通過培養有機體的細胞獲得，如發酵液和細胞培養基。在本發明方法中適用的生物流體包括，但不限制于，血液、血漿、混合血漿、血漿組分的中間物質、血清、細胞勻漿、組織勻漿、條件培養基、發酵液、腦脊液、尿液、唾液、乳汁、導管液、淚液、汗液、淋巴、精液、臍帶液，以及羊水。優選地，生物流體是含有抗體和抗-獨特型抗體的源自血漿的級分。此處所用的“抗-獨特型抗體”指具有對于另一個抗體的抗原決定區有特異性的表位的抗體。以及優選生物流體是從受疾病折磨的宿主獲得的。此處所用的術語“宿主”指任何真核生物或原核生物，例如，細菌、病毒、酵母、真菌、鳥類、爬行動物，以及哺乳動物。折磨宿主的疾病，可以是任何疾病包括任何狀況、病癥、感染，等等。例如，疾病可以是癌癥、糖尿病、自身免疫病、骨質疏松癥、傷口愈合、肝臟再生，或肺病。或者，疾病可以是寄生蟲、病毒，或細菌感染。
此處所用的術語“環境提取物”指從環境取得的任何樣品。環境可以是天然環境，如天然產生的水體。或者，環境可以是人造環境，如建筑。在這方面，環境提取物可以是土壤，土壤提取物，來自天然產生的水體的提取物，冰、空氣、灰、巖石、或永凍層的樣本，或來自建筑的棉拭。天然產生的水體可以是，例如，海洋、湖泊、海、河流、木本沼澤、池塘、三角洲，或海灣。環境提取物可以替換的是來自水處理中心的提取物。建筑可以是任何人造的建筑。優選地，建筑至少受到一種或多種毒劑的污染，如薩林、索曼、神經毒劑、爆炸化學物、殺蟲劑、病原體、VX，以及發皰劑。
包括化合物的組合物可以包括天然或合成的化合物。例如，組合物可以是反應產物的化學或合成混合物。或者，組合物可以在氣壓、溫度等等的極端條件下存在于組合庫中和/或存在于有機溶劑中。
此處所用的術語“配體”指任何結合實體的生物學、化學，或生化試劑，如化合物、分子，或細胞。配體可以從天然或合成制得的材料中分離。配體對于原核生物或真核生物可以是內源的或外源的，例如，細菌、真菌、酵母、植物，或哺乳動物。用于本發明方法的合適配體包括，但不限制于，細胞、細菌、病毒、酵母、蛋白質、肽、氨基酸、核酸、碳水化合物、脂類、藥物、合成的無機化合物、合成的有機化合物、抗體制劑(如，抗體片段、化學修飾的抗體，等等)、糖類，上述物質的任何同種型，以及上述物質的任何組合。
有機分子包括，例如，一般用作藥物治療試劑的合成有機化合物。通過組合合成方法，或，更具體地，通過設計來獲得特異性分子的戰略性合成來任選地大量生產這樣的分子。同樣地，有機分子還包括天然產物和類似物，從它們的天然環境提取或經設計合成得到。此處所用的術語“有機”并不限制于僅僅含有碳和氫的分子，而是用于包括生物來源的大分子的更寬范圍。
優選地，配體是肽。此處所用的術語“肽”指包括至少一個肽鍵的實體，以及可以包括D和/或L氨基酸。理想地，配體是基本上由約2至約10個氨基酸(例如，約2，3，4，5，6，7，8，9或10個氨基酸)組成的肽。理想地，肽配體是通過組合方法產生的，即，通常用于生產組合庫的技術，例如，本領域公知的分裂、偶聯、重組方法或其他方法(參見，如，Furka等，Int.J.Peptide Protein Res.，37487-493(1991)；Lam等，Nature，35482-84(1991)；國際專利申請WO 92/00091；以及美國專利5,010,175,5,133,866，和5,498,538)。肽庫的表達也在Devlin等，Science，249404-406(1990)中有描述。在肽庫中，隨著進行的偶聯反應數量，肽的大小，以及所用的性質不同的氨基酸的數量的增加，不同序列的離散肽數量顯著地增加。例如，19個氨基酸隨機合成五肽產物就高達2,476,099(195)個各自序列不同的肽(Lam等，見上文)。組合方法使配體庫直接在支持物上產生。一般地，配體在支持物介質的顆粒上合成以致在每個顆粒(如珠子)上合成單個配體的多個拷貝，盡管這在本發明的內容中不需要。
在本發明的方法中，每個配體連至支持物，因此獲得配體-支持物復合體的構造。此處所用的術語“支持物”指任何支持基質，如那些本領域公知的可以用于固定配體的固體支持物。合適的支持物包括，但不限制于，膜、濾紙、篩網，或含有纖維素、丙烯酸類樹脂、聚丙烯酰胺或多羥基甲基丙烯酸聚合物、聚苯乙烯、葡聚糖、瓊脂糖、多糖、親水的乙烯基聚合物，上述任何的聚合衍生物，以及上述任何的組合的顆粒，以及可以直接連接配體或在其上配體可以合成的任何有孔的或無孔基質。優選地，支持物是惰性的以致和實體和/或固定的配體的化學反應最小化。在這方面，支持物理想地包括聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸脂、瓊脂糖、聚丙烯酰胺、葡聚糖、纖維素、多糖、硝化纖維素、硅、苯乙烯、金屬、聚乙烯涂敷的聚苯乙烯、聚二氟乙烯、尼龍，或上述任何的組合。尤其優選的支持物材料是聚乙烯涂敷的聚苯乙烯和聚甲基丙烯酸脂。各種樹脂是可商業購得的，以及優選地，支持物是樹脂珠子，如色譜分析的樹脂珠子。
許多展示可能配體的固體支持物是可商業購得的。或者，本發明方法的配體可以使用標準方法間接附著在或直接固定在支持物上(參見，例如，Harlow和Lane，Antibodies，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，NY(1988)；Biancala等，Letters in Peptide Science 7(291)297(2000)；MacBeath等，Science 2891760-1763(2000)；Cass等編輯，Proceedings of theThirteenth American Peptide Symposium；Leiden，Escom，975-979(1994)；美國專利5,576,220；Cook等，Tetrahedron Letters356777-6780(1994)；以及Fodor等，Science 251(4995)767-773(1991))。一實施方案中，配體在支持物表面合成，在制備肽庫中特別有用。配體可以化學地結合至支持物或可以通過下述銜接物結合，如β丙氨酸、甘氨酸、含有甘氨酸-絲氨酸的聚合物、分子式-(CH2)-的短鏈烴、聚乙二醇、ε氨基己酸、以及包括-O(CH2)n的銜接物連接，其中n為1-30。如果需要，配體可以通過一種或數種不同的可裂的銜接物連接，例如，對光不穩定或對酸不穩定部分，使配體群體選擇性分離用于分析。配體可以用作，例如，用于蛋白質和對映體分離(例如，濃縮、分離、檢測、表征、定量，或鑒定樣品中的實體)的親和性純化介質，用作診斷治療工具、催化劑和化學反應增強劑，以及用作蛋白質的選擇性穩定劑。
一旦配體-支持物復合體形成，就在使至少一個實體結合至少一個配體-支持物復合體的條件下將其和含有大量實體的混合物接觸，由此形成至少一個實體-配體-支持物復合體。這樣的條件，如本領域普通技術人員公知的，依賴于混合物(實體)和配體本身，以及其他因素，如pH、溫度、接觸時間、鹽濃度，等等。使至少一個實體結合至少一個配體-支持物復合體的合適條件的確定是在普通技術范圍內的。在本發明的優選實施方案中，形成多個實體-配體-支持物復合體。
在至少一個實體-配體-支持物復合體形成后，至少一個實體-配體-支持物復合體和配體-支持物復合體與未結合的實體分離。此處所用的術語“未結合的實體”指未結合或松散地結合任何一個配體-支持物復合體的混合物的實體。將至少一個實體-配體-支持物復合體與未結合的實體分離的方法是本領域公知的，包括例如，離心、連續稀釋、過濾、透析，以及在色譜分析的形式下洗滌。
本發明的方法可以任選地包括子集合體形成(sub-pooling)步驟，其中至少一個實體-配體-支持物復合體和配體-支持物復合體分離成數個集合體或亞群體(sub-population)。優選地，子集合體形成步驟達到在每個集合體中平均約10-500個實體-配體-支持物復合體和配體-支持物復合體。更優選地，每個集合體中的復合體平均數量是20-100個。最期望地，將復合體子集合體形成，以致每個集合體中存在50個復合體。
進一步，本發明方法可以任選地在子集合體形成步驟之后包括洗脫步驟，其中多個實體-配體-支持物復合體的實體從復合體離解，且隨后將配體-支持物復合體從集合體中移除。
在這方面，本發明提供用于獲得活性實體的篩選混合物的第二個方法。該方法包括(i)提供大量配體，其中每個配體連接至支持物以形成大量配體-支持物復合體，(ii)在使至少一個實體與至少一個配體-支持物復合體結合的條件下，將配體-支持物復合體和含有大量實體的混合物接觸，由此形成至少一個實體-配體-支持物復合體，(iii)將至少一個實體-配體-支持物復合體與未結合的實體分離，(iv)將至少一個實體-配體-支持物復合體和將配體-支持物復合體分離入集合體，(v)從至少一個分離的實體-配體-支持物復合體離解出至少一個實體，(vi)從集合體中移除配體-支持物復合體或步驟(v)中的至少一個離解的實體，(vii)將步驟(v)中至少一個離解的實體進行活性試驗，(viii)檢測活性，以及(ix)選擇至少一個展示檢測到的活性的實體。
本發明方法的一個有益效果是檢測從配體-支持物復合體離解而成為未結合狀態的活性的實體。因此，其不受配體和/或支持物的抑制且和活性試驗中所用的酶底物或細胞的相互作用和對后者施加作用是自由的。本領域普通技術人員公知實體從配體-支持物復合體的離解程度不需要100％或完全離解，因為有可能僅僅部分實體從配體-支持物復合體離解就可以檢測其活性。
或者，方法可以任選地進一步在子集合體形成步驟后包括一個步驟，其中將半固體或粘性物質加入每個集合體中，其中至少一個實體-配體-支持物復合體的實體從復合體離解并擴散至材料中，由此形成實體的濃度梯度，其中實體的濃度隨著從離解出實體的配體-支持物復合體距離的增加而逐漸降低。適用于本發明的半固體材料包括，例如，瓊脂糖、明膠、甘油、聚乙二醇、丙烯酰胺，以及血纖蛋白密封膠。優選地，半固體材料是0.5％w/v的瓊脂糖。
在這方面，本發明提供篩選混合物以獲得活性實體的第三個方法。該方法包括(i)提供大量配體，其中每個配體連接至支持物以形成大量配體-支持物復合體，(ii)在使至少一個實體與至少一個配體-支持物復合體結合的條件下，將配體-支持物復合體和含有大量實體的混合物接觸，由此形成至少一個實體-配體-支持物復合體，(iii)將至少一個實體-配體-支持物復合體與未結合的實體分離，(iv)將至少一個實體-配體-支持物復合體和將配體-支持物復合體分離入集合體，(v)給每個集合體中加入半固體或粘性材料，其中至少一個分離實體-配體-支持物復合體的實體從復合物中離解出來，并擴散進材料中，由此形成實體的濃度梯度，其中實體的濃度隨著從離解出實體的配體-支持物復合體距離的增加而逐漸降低，(vi)將步驟(v)中至少一個分離的實體進行活性試驗，(vii)檢測活性，以及(viii)選擇至少一個展示檢測到的活性的實體。
該方法提供的優勢還包括實體是處于游離的、未結合的狀態，且在活性試驗中與所用的酶底物或細胞的相互作用或對后者的作用不受配體-支持物復合體抑制。此外，該方法提供了能夠以劑量依賴性的方式來檢測實體活性的優勢。
在本發明的方法中，通過對至少一個實體-配體-支持物復合體進行活性試驗來篩選混合物以獲得活性實體。此處所用的術語“活性實體”指任何顯示試驗活性或偶然發現結果的混合物的實體。在這方面，所給混合物的大多數實體具有作為活性實體的可能，這依賴于方法中試驗的特別活性。為了此處的目的，活性實體在結合配體-支持物復合體的意義上也是有活性的。試驗活性可以是任何生物學的、物理的、化學的，或生化活性，前提是活性產生可檢測的信號，如底物的酶修飾。可以使用化學活性，如，與實體的化學組成直接相關的活性。換句話說，可以通過特異性化學亞單位或部分或化學結構的存在來鑒定實體。檢測方法中有用的物理特性包括，例如，光譜信號，其可以分別通過熒光或質譜分析來檢測。檢測的方法不需要單獨檢測實體的活性，但是可以選擇地鑒定多于一個實體的活性或實體復合體的活性，例如，和其它生物實體如輔因子或酶復合的實體。
優選地，活性可以是酶活性或酶活性的抑制作用。例如，本發明的方法可以包括進行酶活性試驗來在生物學活性基礎上表征實體。在通過實體對使底物酶修飾以形成產物的條件下，酶底物可以應用至至少一個實體-配體-支持物復合體。然后檢測產物，因此鑒定實體的存在。或者，為了鑒定抑制所給酶活性的活性實體可以檢測產物形成的缺失。酶活性試驗進一步，例如，Haugland，見上文中。
或者活性可以是對細胞、細胞群體、組織，或整個有機體的作用。在這些實例中的任一個中，進行基于細胞的試驗，其中至少一個實體-配體-支持物復合體和細胞接觸，實體在該細胞上施加一些可觀察到的生物作用。純粹地通過例證的方式，優選實體可以是抗菌劑。本發明方法的配體結合抗菌劑的可能活性位點，因此從混合物(例如，潛在的治療劑庫)中分離抗菌實體。細菌菌苔應用于實體，且通過殺菌活性區域來檢測抗菌實體。當活性是對細胞或細胞群體的作用時，作用可以是，例如，細胞遷移、細胞增殖、細胞死亡、細胞分化、細胞周期進入、細胞周期停滯、細胞凋亡、細胞裂解、生長停滯、細胞存活、細胞內信號通路的改變、抗原表達、基因上調、基因下調，或對試劑反應表型的改變。
在本發明的優選實施方案中，細胞、細胞群體、組織或整個有機體是患病的或來自于患病源。患病的細胞群體、組織或整個有機體可以是任何疾病、病癥、感染，等等引起疾病的。優選地，疾病是癌癥、糖尿病、自身免疫病、骨質疏松癥，或肺病。或者，患病的細胞群體、組織，或整個有機體是受到寄生蟲、病毒，或細菌的感染。患病的細胞群體、組織，或整個有機體也可以是受傷的、燒傷的、結疤的，或正在愈合的狀態的。患病的細胞也可以是原生動物、線蟲，枯氐錐蟲(T.cruzi)，以及利什曼原蟲。
用于檢測試驗活性的精確技術依賴于活性本身。例如，如果活性是細胞生長，那么活性的檢測可以簡單地包括使用血細胞計數器、目測，或放射性同位素吸收來細胞計數。如果活性是顏色標記產物的產生，那么檢測可以包括通過紫外可見光譜學(UV-VIS)來檢測顏色。來決定合適的技術用于檢測試驗活性對本領域普通技術人員來說是公知的。
一旦檢測到活性，則選擇至少一個具有顯示檢測活性的實體的實體-配體-支持物復合體。此處所用的術語“選擇”以及從其中衍生的詞指實體-配體-支持物復合體的鑒定，或其所在的集合體的鑒定。在后一種情況中，試驗可以僅僅用選擇的集合體的成分進行重復，直至選出了單一的實體-配體-支持物復合體。
本發明方法的優勢是基于生物學、物理、生化，或化學活性鑒定和/或表征活性實體的能力，而無需實體分子特性的現有知識。因此，實體可以展示生物學活性而不需要在實施本發明方法之前經過處理(例如，熱失活)。也不需要去除量較大量的蛋白質如白蛋白或活性實體如免疫球蛋白。同樣地，在試驗介質中可以提高或減弱實體影響更特異性細胞功能(例如，特別蛋白質或其他細胞成分的產生)的能力，因此提供了實體有價值的特征。進一步，實體可以是證明了可以抵抗細胞毒性試劑的細胞。因此，本發明提供了用于鑒定有特異性生物學活性的新活性實體或未知活性實體(即，在實施本發明方法之前未被鑒定的蛋白質)的方法。本發明也提供了已知蛋白質的新的或未知的生物活性的鑒定。
可以完成活性實體鑒定的方法中的方式可以包括鑒定結合顯示試驗活性的實體的配體的化學特性。鑒定配體化學特性的合適方法是本領域公知的，包括，例如，質譜分析、Edman降解測序，等等。一旦鑒定出配體對于特定的實體具有特異性，那些配體可以重新合成并使用例如色譜分離以用于捕獲、分離、檢測，和/或表征實體。為此，本發明方法進一步包括提供鑒定的配體的多個拷貝，并將鑒定的配體的每個拷貝連接至支持物，因此獲得多個配體-支持物復合體。在使配體-支持物復合體可以結合實體多個拷貝的條件下，將多個配體-支持物復合體和含有實體多個拷貝的組合物接觸，由此形成多個實體-配體-支持物復合體。將實體從實體-配體-支持物復合體離解，以及如果需要，接受另一輪的篩選和/或表征。用于分離和純化實體的含有實體多個拷貝的組合物可以和初始用于鑒定作為活性實體的實體的混合物相同。例如，如果血漿是和配體-支持物復合體初始接觸的混合物，那么相同來源的血漿在隨后的步驟中可以用于分離和純化實體。
在活性實體分離和純化后，方法可以進一步包括檢測實體化學或物理特性或至少進一步表征實體的步驟，如通過進行實體的質譜分析。此處所用的術語“表征”以及此后相關的詞語指任何有區別的實體性質或性狀的鑒定，而不需要說明所述實體的精確的化學特性，例如，分子式、化學結構、構象、核苷酸序列或氨基酸序列。
此外，鑒定的配體也可用于診斷試驗來固定或選擇性地轉移實體，并用作為假的或合成受體(參見，例如，Still，Acc.Chem.Res.，29155-163(1996))。此外，配體自身可以用作治療試劑、催化劑，等等。
實施例下列的實施例將進一步說明本發明，但是，當然，不應解釋為以任何形式限制其范圍。
為了方便，下列縮寫是在此實施例中所使用的DEPFMU，6，8-二氟-4-methylumbelliferyl；ICAT，同位素編碼的親和標記物；UV-VIS，紫外可見；SAP，鏈霉抗生物素-堿性磷酸酶；FITC，異硫氰酸熒光素；ATCC，美國模式培養物保藏所；IL-2，白細胞介素-2；PNPP，對硝基磷酸苯酯；PPV，豬細小病毒(porcine parvovirus)；PVDF，聚偏二氟乙烯；AP，堿性磷酸酶；以及PI，碘化丙錠。
實施例1
該實施例證明了利用本發明方法為獲得細胞毒性因子篩選混合物。
在分級分離到珠子上以后檢測了細胞毒性因子誘導細胞死亡的能力。在該試驗中，使結合抗小鼠TNF-α抗體(pharmingen)的珠子分純化的小鼠TNF-α(Pharmingen，San Diego，CA)。對照珠子沒有與TNF-α溫育。此外，對照包括向培養基中加入溶解的TNF-α并使不具抗體的珠子與TNF-α溫育來確保沒有由于不良的洗滌而導致的未結合TNF-α的遺留。也測量了普通珠子的作用。將指定數量的細胞放入24孔平板的各孔中，大約100個珠子加入有WEHI164細胞(ATCC)的每個孔中。與珠子溫育48小時以后，通過血細胞計數器計數和錐蟲藍排除來觀察顯示的細胞死亡％以顯示死亡細胞數目(表1)。
表1 TNF-α珠子的細胞毒性試驗
該實施例證明了從這些高親和性配體洗脫了足夠量的蛋白質，并導致了在易感細胞培養物中可檢測的細胞死亡。這些數據支持以下論點在對于生物功能帶有限定終點的多重試驗中可以檢測到活性因子。
實施例2該實施例證明了利用本發明方法為獲得支持細胞生長的因子篩選細胞因子摻入的血漿。
該試驗中所用的細胞是NK-92細胞(從ATCC獲得，Manassas，VA)。NK-92細胞系是人細胞毒性T-細胞系，其為了生長需要外源的白細胞介素-2(IL-2)。含有血清或健康人血漿的普通細胞培養基不具有支持NK-92生長的IL-2。因此，NK-92細胞通常維持在補充了5ng/ml重組小鼠IL-2的培養基中。
作為帶有IL-2特異性配體珠子的模型，300μg大鼠抗人IL-2抗體(Pharmingen，San Diego，CA)交聯上400μl G蛋白質瓊脂糖珠子(Pierce，Rockford，IL)。使珠子分其中摻入了天然的、分泌的細胞因子混合物的血漿混合物溫育過夜。混合物含有數種細胞因子且源自于人單核細胞和白細胞，這些細胞已經用植物凝集素和環丙沙星誘導來分泌細胞因子。隨后將來自這些誘導的細胞培養基集合。在摻料血漿中IL-2的濃度約為4ng/ml。珠子用～50柱體積的PBS+0.1％Tween-20洗滌(Sigma Aldrich，St.Louis，MO)。還包括與4ng/ml純重組人IL-2溫育的珠子。對照是帶有抗體的珠，沒有與IL-2溫育的作為負對照，培養物中加入了溶解的IL-2的作為正對照。
以每個孔1×105個細胞將NK-92細胞放入24孔平板中，使其在沒有加入IL-2的培養基中生長24小時來耗盡內在的IL-2儲存。每個孔中加入大約100個珠子。培養物生長96小時。從每個培養物中收集細胞并通過在血細胞計數器中計數活細胞來測定細胞數量，通過錐蟲藍排除法來排除死細胞。在從配體向細胞提供IL-2的孔中，其中IL-2是重組蛋白質或從分泌的混合物純化的，細胞數量相對于負對照顯示出8至12倍增加。因此，這些數據證明了蛋白質從高度復雜的混合物中分級分離到高集和性配體上，蛋白質以足夠的速率和濃度從配體擴散至培養基，且通過它支持依賴性細胞生長的能力來檢測它的存在。
這些結果顯示了足夠的蛋白質從高親和性配體擴散出來，并在相關的基于細胞的試驗中檢測到其活性。這些結果可以外推來預言通過其對培養物細胞的活性和鑒定的結合該蛋白質的配體可以鑒定支持生長的未知蛋白質，大量生產，并通過親和性色譜純化活性蛋白質，鑒定并表征。
實施例3該實施例證明了利用本發明方法來鑒定生長因子。
為了獲得支持NK-92細胞存活的蛋白質已經使用六聚體肽配體庫篩選了復雜細胞因子混合物。源自分離的淋巴細胞和單核細胞的天然、分泌的細胞因子混合物(ImmunoRx，Inc，Farmington，NY)用作起始材料。該混合物含有許多細胞因子，它們響應于生物學誘導而釋放且不存在于正常血清或培養基中。該試驗的終點如實施例2中所描述的同時是生物學的和熒光的。通過半胱氨酸衍生物在ToyoPearl605-M環氧珠子的主鏈上合成的六聚體庫的11,000珠子(由PeptidesInternational合成，Louisville，KY)與細胞因子混合物溫育。未結合和弱結合的蛋白質通過用PBS(150mM NaCl，pH 7.4)洗滌來去除。20-50個珠子與40μl NK-92細胞溫育，細胞已經以2.4×104個細胞/ml放置在384孔的微量滴定板上的孔中。平板在37℃保持48小時。在20個孔中大約觀察到30塊生長細胞。在一些情況中細胞的大塊生長與珠子的關聯比較緊密。數個直接鄰近的珠子在其附近沒有細胞生長，通過碘化丙錠(PI)吸收來顯示死亡細胞顯著的小塊。收集這些珠子中(以及少許其他的來自支持生長的相同的孔)的一個，通過修飾抗體檢測在“珠子印跡(bead blot)”試驗中來驗證珠子上IL-2的存在。簡言之，珠子排列在瓊脂糖中，蛋白質從珠子轉移下來通過在洗脫緩沖液中毛細管轉移至PVDF膜上，膜用抗-IL-2抗體標記來檢測IL-2。回收十一個珠子，包括三個可能是陽性的，洗滌，與同樣的起始材料再溫育，并用相同的細胞系各自培養。三個可能陽性的珠子中的兩個在去褶合(deconvolation)試驗中證實了它們的活性。將另外的珠子測序以及結合的配體鑒定為序列GVASED(SEQ ID NO9)。合成具有該配體的樹脂并發現其結合IL-2。全部的起始材料將在樹脂上分級分離，并將結合的蛋白質分析來鑒定可以在樹脂上純化并有助于活性的另外的蛋白質。
該類型功能性篩選實驗的數個方面可以外推至其他用于生物學活性的篩選。盡管IL-2存在于起始材料中是已知的，還有大量其他的細胞因子以不同水平存在于珠子上，且在試驗中可能有助于細胞存活。已經測試NK-92細胞對于IL-1和數個其他已知的細胞因子的響應性缺失；然而，它們可以對其他，如存在于起始材料中還未發現的細胞因子有反應。最重要的，在該類型試驗中可以無疑地完成篩選保護性對抗細胞毒性試劑和毒藥的因子，其中細胞生長和PI排除是終點。
實施例4該實施例證明了利用本發明方法為了獲得堿性磷酸酶活性篩選摻料血漿。
將鏈霉抗生物素堿性磷酸酶(500ng)(SAP-Sigma-Aldrich)摻入1ml集合的人血漿中。摻料血漿與ToyoPearl AF-Amino-650M珠子(Tosoh BioSciences，Montgomerzville，PA)溫育，該珠子具有或不具有配體HPQFLS(SEQ ID NO1)(由Peptides International合成，Louisville，KY)，該配體是已知結合鏈霉抗生物素的序列。珠子用與摻料或未摻料血漿在室溫下溫育1小時，之后用具有0.1％Tween-20，pH7.2的HEPES緩沖液洗滌。帶有配體的珠子也與鹽水單獨溫育作為對照。珠子以每孔6個HPQFLS珠子分配到384-孔平板的孔中，也中具有120μl含有250mM NaCl和0.05％Tween吐溫20-緩沖液的HEPES緩沖液。珠子在室溫下溫育30小時。
從孔中回收液體并用對硝基磷酸苯酯(PNPP)(Sigma-Aldrich)(即，有顏色的磷酸酶底物)測試堿性磷酸酶活性的存在。只在那些有來自已經暴露于AP-摻料血漿的配體珠子的緩沖液的孔中顯現黃顏色；在對照孔中觀察到的是無色的。為了證實蛋白質的確從珠子上洗脫了，FITC-標記物鏈霉抗生物素(Piene)也與上述HPQFLS(SEQ IDNO1)珠子溫育。珠子然后與120μl的20mM檸檬酸鹽140mM的NaCl緩沖液溫育21小時。收集緩沖液，在熒光計中測量熒光。超過基線的增加為11.6％。另外3天的洗脫后，熒光超過基線增加22.7％。
這些結果證明了酶活性的蛋白質在高親和性的配體上分級分離并從配體洗脫，溶液中蛋白質的存在基于其生化活性而檢測得到。
實施例5該實施例證明了利用本發明方法為了獲得黑素瘤特異性抗體篩選血漿。
用于該試驗的細胞系是人惡性黑素瘤細胞系SK-MEL 28。組合庫在來自Tosoh BioScience的ToyoPearl 650-M環氧樹脂上合成。該庫設計來帶有配體，配體通過半胱氨酸衍生物的巰基基團連接至樹脂。作為IgG，IgA和IgM抗體源的起始材料是已經進一步分級分離去除了血纖蛋白原的血漿級分I+II+III漿狀糊。珠子與漿狀糊溫育并洗滌，且50-150個珠子與40μl SK-MEL 28細胞溫育，細胞已經以1×104細胞/ml放置在384孔平板的孔中。培養基含有碘化丙錠(PI)即只有死細胞吸收的紅色熒光染料。以1小時間隔在160小時內以單個細胞分辨率獲取每個孔的圖像。分析圖像的PI隨時間的吸收，將PI吸收累積增加超過群體平均值2個標準偏差的孔選擇作為特定目標。將這些孔中的珠子收集、清洗、用新鮮的等份起始材料再裝載，以相同細胞濃度與每個孔1-2個珠子溫育，并用和原始試驗同樣的方式成像。將死亡增加超過群體平均值2個標準偏差的孔中的珠子收集并將結合的配體測序。
有珠子的或在特異性珠子鄰近的孔中死亡增加顯示了結合配體的細胞毒性抗體。通過將孔中的珠子稀釋至每個孔單個珠子和重復試驗來去褶合任何陽性。這證明了結果并顯示了結合蛋白質的特異性珠子，將其結合的配體測序。如果在孔中鑒定單個珠子而無去褶合，則收集珠子并將結合的配體測序。
實施例6該實施例顯示了為了獲得免疫接種哺乳動物的抗體利用本發明方法篩選抗體混合物。
從高達60,000個供體的集合體制得源自人血漿的靜脈內免疫球蛋白(IgG)，且該免疫球蛋白包括大量各種不同親和性的抗體，其中一些結合細胞表面受體。通過用膜制劑來免疫接種小鼠也可以產生直接對抗細胞表面受體的抗體群體。在方法中抗體可以用作篩選起始材料來鑒定它們受體的表位如“珠子印跡”受體結合抗體可以用于PON1的增量調節。使用來自正常和免疫接種小鼠的純化的IgG制劑來鑒定在不同篩選中的抗體特異的表位。一個組的小鼠用卵清蛋白免疫接種；未免疫的小鼠用作對照。使用G蛋白瓊脂糖(Pierce)上的親和性色譜分析從混合血清中純化來自每組的IgG制劑，且兩個群體用Alexa488(綠色)或Alexa 568(紅色)染料(Molecular Probes，EugeneOR)不同標記。然后混合兩個IgG且與組合六聚體配體庫溫育。將珠子充分洗滌并在熒光顯微鏡下觀察。熒光珠子的多數同時具有紅色和綠色信號，顯示它們結合了存在于兩個群體中抗體。只有紅色的熒光珠子是只存在于免疫接種群體里抗體的指示。將這些收集并測序。數個顯示了和卵清蛋白非常強的序列同源性，如，ILRVIR(SEQ ID NO2)和卵清蛋白序列RTINKVVRF(SEQ ID NO3)同源，IFDKVQG(SEQID NO4)和RFDKLPGFG(SEQ ID NO5)同源，以及PPFRIHG(SEQID NO6)和MPFRVITE(SEQ ID NO7)同源。數個保留的解碼(decoded)的序列和確信由免疫接種過程中使用的弗氏輔劑引起的細菌序列具有高度同源性。
實施例7該實施例證明了利用本發明方法通過測量對氧磷酶活性鑒定結合庫的酶。
為了獲得從血漿純化對氧磷酶的能力通過測量酶的活性來篩選連接HDL的配體。對氧磷酶涉及對抗動脈粥樣硬化斑積累的保護，以及一些神經毒藥(薩林)和殺蟲劑的解毒。5μl配體2’-萘基-丙氨酸WLHAN(SEQ ID NO8)與100μl的在PBS中1∶10稀釋的兔血清于37℃溫育1小時。將珠子離心移去上清液，并將上清液保存在eppendorf管中。將樹脂珠子沉淀在等體積的對氧磷酶試驗緩沖劑中重懸浮。使用敏感的、特異的、熒光的底物來測量上清液的對氧磷酶活性。將100μM的DEPFMU(6，8-二氟-4-甲基umbelliferyl)和10μl上清液、10μl珠子懸浮液，或10μl血清于標準微量滴定板中37℃混合20分鐘。使用商業的熒光計測量355nm發射和460nm激發熒光來定量DEPFMU的水解。和DEPFMU活性的標準曲線相比較來定量水解。在具有樹脂的孔中檢測到了30％的起始活性，而在血清中剩余了低于4％的起始對氧磷酶活性。這些數據顯示了通過結合到珠子上的酶的活性可以檢測結合酶的配體，以及使用該試驗來篩選活性可以從復雜混合中發現酶本身。
實施例8該實施例證明了利用本發明方法為了獲得結合病毒的配體篩選庫，基于篩選病毒關聯的細胞毒性。
使用本發明的方法鑒定結合豬細小病毒(PPV)的配體。該試驗是傳統噬斑試驗的改變，其中通過培養物中易感哺乳動物細胞的溶解形成的病毒噬斑來測量感染性。作為結合病毒的配體模型，將2μl多克隆的豬抗PPV抗體根據制造商的規程(Pierce)連接至A蛋白瓊脂糖珠子上。通過連續離心使珠子與從PK13純化得到的8對數(log)的PPV溫育。這些珠子和低熔點的瓊脂糖混合并涂布在70％的PK13細胞匯合培養物的表面。在37℃ 5％CO2下培養5天后，活細胞用中性紅染色劑染色。圍繞結合病毒的珠子細胞死亡的面積是明顯的。這些結果證明了活性實體(病毒)從珠子受控制的擴散鑒定了活性珠子。
在此引用的所有參考文獻，包括出版物、專利申請，以及專利在此引入作為參考，其程度與每一參考文獻單獨且特定引入作為參考及在此處整體提出的程度相同。
在描述本發明文中使用的術語“a”和“an”和“the”和相似的指示(尤其是在下列權利要求的內容中)解釋為同時覆蓋了單數和復數，除非在此另外指出或清楚地通過內容反駁。術語“包括”“具有”、“包含”和“包括”是作為開放的術語來解釋的(即，意思為“包括，但不限制于，”)除非另外注解。在此值范圍的列舉僅僅作為涉及各自的各個分開的落入范圍內值的簡寫方法，除非在此另外指出，以及每個分開的值與其在此處單獨引用一樣整合入說明書中。在此描述的所有方法可以以任何適合的順序進行，除非在此另外指出或清楚地通過內容反駁。任何一個和所有實施例的用途，或在此所提供的示例性語言(如，“例如”)，僅僅是為了更好地說明本發明而不是對本發明范圍的限制，除非另外請求保護。說明書中沒有語言應解秋表示任何非請求保護的元素對本發明的實踐是必須的。
在此描述了本發明的優選實施方案，包括發明者已知的實施本發明的最佳方式。基于閱讀前面的描述對本領域技術人員來說那些優選實施方案的改變是顯而易見的。發明者期待技術人員來使用這樣適當的改變，發明者打算期望本發明除了在此特別描述的應用。因此，本發明包括所有由適用法律批準的所附權利要求敘述的主題的改變和等價方案。此外，所有可能改變的上述元素的任何組合都包括于本發明中，除非在此另外指出或通過內容清楚地反駁。
序列表<110>The American National Red Cross et al.
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<220>
<223>合成的<400>9Gly Val Ala Ser Glu Asp1 權利要求
1.一種為獲得活性實體篩選混合物的方法，該方法包括(i)提供大量配體，其中每個配體連接至支持物以形成大量的配體-支持物復合體，(ii)在使至少一個實體與至少一個配體-支持物復合體結合的條件下，將配體-支持物復合體和含有大量實體的混合物接觸，由此形成至少一個實體-配體-支持物復合體，(iii)將至少一個實體-配體-支持物復合體與未結合的實體分離，(iv)測定至少一個分離的實體-配體-支持物復合體中的至少一個實體的活性，(v)檢測所述活性，以及(vi)選擇具有展示檢測到的活性的實體的至少一個實體-配體-支持物復合體，由此從混合物中篩選活性實體。
2.權利要求1的方法，其中配體選自細胞、細菌、病毒、酵母、蛋白質、肽、氨基酸、核酸、碳水化合物、脂類、藥物、合成的無機化合物、合成的有機化合物，上述物質的異構體，以及上述物質的任何組合。
3.權利要求2的方法，其中配體是肽，且肽是通過組合方法產生的。
4.權利要求1的方法，其中支持物包括的材料選自聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸脂、瓊脂糖、聚丙烯酰胺、葡聚糖、纖維素、多糖、硝化纖維素、硅、苯乙烯、聚乙烯涂敷的聚苯乙烯、金屬、聚二氟乙烯、尼龍，以及上述材料的任何組合。
5.權利要求1的方法，其中混合物是生物流體，環境提取物，或包括化合物的組合物。
6.權利要求5的方法，其中生物流體選自血液、血漿、混合血漿、血漿組分的中間物質、血清、細胞勻漿、組織勻漿、條件培養基、發酵液、腦脊液、尿液、唾液、乳汁、導管液、淚液、汗液、淋巴、精液、臍帶液，以及羊水。
7.權利要求5的方法，其中生物流體是包括抗體和抗-獨特型抗體的源自血漿的組分。
8.權利要求5的方法，其中生物流體是從患病的宿主上獲得的。
9.權利要求5的方法，其中環境提取物選自土壤提取物，來自天然水體的提取物，來自冰、空氣、灰、巖石，或永凍層的樣本，以及來自建筑物的擦拭物。
10.權利要求5的方法，其中含有化合物的組合物包括天然或合成的化合物。
11.權利要求1的方法，其中實體選自蛋白質、肽、藥物、抗體、細胞、合成分子、有機化合物、蛋白質復合物、細菌、病毒，以及真菌。
12.權利要求1的方法，其中活性是生物學、物理、化學，或生化活性。
13.權利要求12的方法，其中活性是酶活性或酶活性的抑制作用。
14.權利要求12的方法，其中活性是對細胞、細胞群體、組織，或整個有機體的作用。
15.權利要求14的方法，其中活性是對細胞或細胞群體的作用，所述作用選自細胞遷移、細胞增殖、細胞死亡、細胞分化、細胞周期進入、細胞周期停滯、細胞凋亡、細胞裂解、生長停滯、細胞存活、細胞內信號通路的改變、抗原表達、基因上調、基因下調，以及對試劑反應的表型改變。
16.權利要求14的方法，其中細胞、細胞群體、組織，或整個有機體是患病的。
17.權利要求16的方法，其中患病的細胞、細胞群體、組織，或整個有機體是患有癌癥、糖尿病、自身免疫病、骨質疏松癥，或肺病，或受到寄生蟲、病毒，或細菌感染，受傷的、燒傷的、結疤的，或正在愈合的狀態。
18.權利要求1的方法，其中多個實體-配體-支持物復合體是在步驟(ii)中形成的。
19.權利要求1的方法，其中在步驟(iii)之后和步驟(iv)之前進一步包括子集合體形成步驟，其中至少一個分離的實體-配體-支持物復合體和配體-支持物復合體分入幾個集合體。
20.權利要求1的方法，其進一步包括(vii)測定至少一個結合了至少一個顯示檢測活性的實體的配體的化學特性。
21.權利要求20的方法，其進一步包括(viii)提供步驟(vii)中鑒定的至少一個配體的多個拷貝，(ix)將每個拷貝連接至支持物，因此獲得多個配體-支持物復合體，(x)在使配體-支持物復合體與至少一個顯示檢測活性實體的多個拷貝結合的條件下，將配體-支持物復合體和含有至少一個顯示檢測活性的實體的多個拷貝的組合物接觸，由此形成多個實體-配體-支持物復合體，以及(xi)將實體從實體-配體-支持物復合體離解，因此從組合物回收實體。
22.權利要求21的方法，其中步驟(x)中的組合物與步驟(ii)中的混合物相同。
23.權利要求21的方法，其進一步包括(xii)檢測顯示檢測活性的實體的化學或物理特性。
24.權利要求19的方法，其在子集合體形成步驟之后和步驟(iv)之前，進一步包括洗脫步驟，其中多個實體-配體-支持物復合體的實體從復合體離解，且隨后將配體-支持物復合體從集合體中去除。
25.權利要求19的方法，該方法在子集合體形成步驟之后和步驟(iv)之前，包括一個步驟，其中將半固體或黏性材料加入每個集合體中，其中至少一個實體-配體-支持物復合體的實體從復合體離解并擴散入材料中，由此形成實體的濃度梯度，其中實體的濃度隨著從離解出實體的配體-支持物復合體距離的增加而逐漸降低。
26.一種為了獲得活性實體篩選混合物的方法，該方法包括(i)提供大量配體，其中每個配體連接至支持物上以形成大量配體-支持物復合體，(ii)在使至少一個實體與至少一個配體-支持物復合體結合的條件下，將配體-支持物復合體和含有大量實體的混合物接觸，由此形成至少一個實體-配體-支持物復合體，(iii)將至少一個實體-配體-支持物復合體和配體-支持物復合物與未結合的實體分離，(iv)將至少一個實體-配體-支持物復合體和將配體-支持物復合體分離入集合體，(v)從至少一個分離的實體-配體-支持物復合體離解出至少一個實體，(vi)從集合體中去除配體-支持物復合體或步驟(v)中的至少一個離解的實體，(vii)將步驟(v)中至少一個離解的實體進行活性試驗，(viii)檢測活性，以及(ix)選擇至少一個展示檢測到的活性的實體，由此從混合物中篩選活性實體。
27，一種為了獲得活性實體篩選混合物的方法，該方法包括(i)提供大量配體，其中每個配體連接至支持物上以形成大量配體-支持物復合體，(ii)在使至少一個實體與至少一個配體-支持物復合體結合的條件下，將配體-支持物復合體和含有大量實體的混合物接觸，由此形成至少一個實體-配體-支持物復合體，(iii)將至少一個實體-配體-支持物復合體和配體-支持物復合體與未結合的實體分離，(iv)將至少一個實體-配體-支持物復合體和配體-支持物復合體分離入集合體，(v)給每個集合體加入半固體或粘性材料，其中至少一個分離的實體-配體-支持物復合體的實體從復合物中離解并擴散入材料中，由此形成實體的濃度梯度，其中實體的濃度隨著從離解出實體的配體-支持物復合體距離的增加而逐漸降低。(vi)將步驟(v)中至少一個離解的實體進行活性試驗，(vii)檢測活性，以及(viii)選擇至少一個展示檢測到的活性的實體，由此從混合物中篩選活性實體。
全文摘要
一種為獲得活性實體篩選混合物的方法，該方法包括提供大量配體，其中每個配體連接至支持物以形成大量的配體－支持物復合體，在使至少一個實體與至少一個配體－支持物復合體結合的條件下，將配體－支持物復合體和含有大量實體的混合物接觸，由此形成至少一個實體－配體－支持物復合體，將至少一個實體－配體－支持物復合體與未結合的實體分離，將至少一個實體－配體－支持物復合體的至少一個實體進行活性試驗，檢測活性，以及選擇具有展示檢測到的活性的實體的至少一個實體－配體－支持物復合體，由此從混合物中篩選活性實體；以及相關的方法。
文檔編號G01N33/554GK1671859SQ03816492
公開日2005年9月21日 申請日期2003年6月20日 優先權日2002年7月11日
發明者D·J·哈蒙德, J·T·拉思羅普, J·薩卡, L·喬治烏 申請人:美國紅十字會