一種水稻果皮顏色基因Pb的分子標記及其應用
【專利摘要】本發明提供了一種水稻果皮顏色基因Pb的分子標記和應用，屬于植物生物技術領域。本發明的分子標記通過一條正向引物和兩條反向引物PCR擴增得到，前述引物的核苷酸序列分別如SEQ ID NO.1?3所示。利用該水稻果皮顏色基因Pb的分子標記，只需通過簡單的PCR即可完成對水稻果皮顏色基因Pb的基因分型，預測水稻果皮顏色。本發明具有操作簡便、分型快速、費用低廉等優勢，更適合在大規模分子標記輔助選擇中運用。
【專利說明】
-種水稻果皮顏色基因 Pb的分子標巧及其應用
技術領域
[0001 ]本發明屬于植物生物技術領域，具體地說，設及一種水稻果皮顏色基因 Pb的分子 標記及其應用。
【背景技術】
[0002] 水稻是我國最重要的糧食作物之一，全國有超過一半的人口 W稻米為主食。隨著 社會經濟的發展，人們對膳食營養品質的要求逐漸提高，稻米營養品質也受到越來越多的 重視。紫米是一種具有較高營養價值的有色稻米。相較于一般白米不含有花色素巧，紫米果 皮內積累了包括矢車菊素-3-葡萄糖巧和巧藥素-3-葡萄糖巧在內的大量花色素巧，使其糖 米呈紫色或黑色。花色素巧屬于類黃酬物質，具有較強的抗氧化作用，能夠有效清除活性氧 自由基、徑自由基和DPPH(1，1-二苯基-2-Ξ硝基苯阱）自由基。與白米相比，紫米還含有豐 富的膳食成分，包括人體必需氨基酸、植物脂肪、纖維素和鐵、巧、鋒等礦物質，尤其含有一 般稻米缺乏的維生素 C和胡蘿素等。研究表明紫米具有抗癌和抑制腫瘤活性，減輕糖尿病并 發癥，減輕支氣管病和屯、血管病病癥，改善缺鐵性貧血，抗過敏，消炎等功效。
[0003] 紫米的果皮顏色性狀是由Pb和化兩個基因共同調控的。當同時帶有Pb和化時，果 皮為紫色；當帶有Pb不帶有化時，果皮為棟色；當不帶有Pb時，不論化是否存在果皮均為白 色（Rahman Μ Μ,Lee Κ Ε, Lee Ε S，et al.The genetic constitutions of complementary genes Pp and Pb determine the purple color variation in pericarps with cysnidin-S-O-glucoside depositions in black rice.J Plant Biol， 2013,56(1):24-31)。巧定位于第 1染色體化u J，Anderson B，Wessler S R.Isolation and characrerization of rice R genes：Evidence for distinct evolutionary paths in rice and maize .Genetics，1996，142(3): 1021-1031;)。饑定位于第4染色體兩個InDel標 記RID3與RID4之間約25化范圍內，并被推測與前人報道的Ra為同一個基因。進一步研究表 明Ra第7外顯子內一個化p(GT)片段的缺失是造成紫色果皮的原因（王彩霞，舒慶堯.水稻紫 色種皮基因化的精細定位與候選基因分析.科學通報，2007，52(21): 2517-2523)。
[0004] DNA分子標記是指能反映生物個體或種群間基因組遺傳差異的特異DNA片段。對于 基因組中核巧酸序列已知的小片段插入缺失類型的遺傳差異一般可使用特異引物PCR標記 進行檢測，例如STS(sequnce-tagged site)標記，引物擴增受阻突變體系PCR標記，CAPS (Cleaved Amplified Polymorphism Sequences)標記，dCAPS(Derived Cleaved Amplified化lymo;rphic Sequences)標記等。STS標記是根據遺傳差異兩側已知的核巧酸 序列設計PCR引物進行擴增獲得DNA分子標記，然后電泳分析遺傳標記多態性的方法。引物 擴增受阻突變體系PC財示記是針對已知的變異位點設計一條或一對外引物和兩條內引物， 其中外引物在突變位點一側或雙側，內引物3'末端堿基必須剛好落在變異位點上或離變異 位點數個堿基的位置上。通過內引物3'末端堿基與野生型和突變體基因組同源配對程度的 不同選擇性擴增野生型和突變型基因惟峰，艾君濤，楊利國.一種SNP檢測新方法：四引物 擴增受阻突變體系PCR技術.生命的化學，2004,24(6):514-516;王忠華，Redus MARC，賈育 林.水稻抗稻攝病基因？1-*曰共顯性分子標記的建立.中國水稻科學，2005，19(6):483- 488) dCAPS標記是首先擴增出包含遺傳差異位點的PCR產物，然后用限制性內切酶酶切PCR 產物，再電泳檢測酶切片段的多態性。CAPS標記的設計依賴于在遺傳差異位點剛好存在限 制性內切酶位點，如果遺傳差異位點內不存在限制性酶切位點則可W通過PCR引入酶切位 點然后按CAI^標記的方法檢測，運就是dCAI^標記。
[0005] 通過對與目標基因緊密連鎖或共分離的分子標記進行檢測，可W在雜交后代中準 確地對不同個體的基因型進行鑒定，并進一步預測目標基因所控制的性狀W幫助后代選 擇，運就是分子標記輔助選擇。紫色果皮屬于顯性性狀，傳統育種只能在水稻灌漿后才能對 該性狀進行選擇，并且只能通過后代分離情況才能區分純雜合基因型，選擇效率低下。根據 Ra/Pb第7外顯子內GT片段的缺失，研究者開發出了 CAPS標記CAPSRa和CAPSPb用于對紫色種 皮性狀的標記輔助選擇。CAPSRa標記可W分別從GT缺失基因型和野生型材料中擴增出 858bp和860bp的片段。其中858bp片段可被BamH I酶切為653bp和203bp的兩條片段，而 860bp片段不能被BamH I酶切。CAPS饑標記可W從GT缺失基因型和野生型材料中分別擴增 出1198bp和1200bp的片段。其中1198bp片段可被BamH I酶切為669bp和529bp的兩條片段， 而1200bp片段不能被BamH I酶切。
[0006] 雖然CAPSRa和CAPS化標記極大提高了紫米品種的選擇效率，但是CAPS標記操作繁 瑣、檢測費時、成本較高的缺點并不利于該類標記在育種中大規模應用。因此在紫米品種選 育過程中，迫切需要一種操作簡單、快速、準確且高通量的鑒定果皮顏色的分子標記方法。

【發明內容】

[0007] 本發明的目的在于克服現有技術存在的缺點與不足，提供一種水稻果皮顏色基因 化的分子標記。
[0008] 本發明的第二個目的是提供利用上述分子標記鑒定水稻果皮顏色基因 Pb基因型 的方法及其應用。
[0009] 本發明的第Ξ個目的是提供利用上述分子標記鑒定水稻果皮顏色或同時鑒定水 稻果皮顏色基因化基因型和水稻果皮顏色的方法及其應用。
[0010] 本發明提供的一種水稻果皮顏色基因饑的分子標記，其通過核巧酸序列如SEQ ID NO. 1-3所示的引物擴增得到。
[0011] 本發明提供了上述分子標記在鑒定水稻果皮顏色基因化基因型中的應用。
[0012] 本發明提供了上述分子標記在鑒定水稻果皮顏色中的應用。
[0013 ]本發明提供了上述分子標記在水稻育種中的應用。
[0014] 本發明提供了用于檢測水稻果皮顏色基因化的特異性引物組合，含有核巧酸序列 如沈Q ID NO. 1-3所示的引物。
[0015] 其中，569 10^.1所示的正向引物口6。:46〔64〔64〔64〔4〇：64〔6,569 10^.2所示 的反向引物化31:4了6(：(：了6〔4州64646641'此4，和56〇10^.3所示的反向引物化尺2: GTTGATGCCTGCACCGAGAGGACAT 〇
[0016] 本發明上述引物組合是針對Pb第7外顯子內GT片段的缺失設計、篩選后獲得。饑F 在GT缺失位點上游，可W分別與化R1和PbR2配對擴增，擴增產物大小分別為173bp和179bp。 PbRl和PbR2的3 '端離GT缺失位點分別為5個堿基和2個堿基，其中化R1只能與GT缺失基因型 完全配對，PbR2只能與野生型基因型完全配對。
[0017] 本發明提供了前述特異性引物組合在鑒定水稻果皮顏色基因化基因型中的應用。
[0018] 本發明提供了前述特異性引物組合在鑒定水稻果皮顏色中的應用。
[0019] 本發明提供了前述特異性引物組合在水稻種質資源改良中的應用。
[0020] 進一步地，本發明提供了檢測水稻果皮顏色基因 Pb基因型的方法，首先對待測樣 本提取基因組〇魁后，利用56〇10^.1所示的正向引物、569 10^).2和56〇10^).3所示 的反向引物進行PCR，對PCR擴增產物大小進行分析，
[0021] 若擴增產物只出現173bp條帶，則表明待測樣品的Pb為GT缺失基因型；若只出現 179bp條帶，則表明待測樣品的Pb為野生型基因型；若同時出現173bp和179bp條帶，則表明 待測樣品的化為雜合基因型。
[0022] 17369條帶的參考序列如569 10^.4所示，17抓9條帶的參考序列如569 10^.5 所示。本領域技術人員應當理解，由于水稻品種的差異，設計引物時預測的PCR產物序列只 能作為參考序列，而從不同品種中擴增出來的產物的序列可能和參考序列完全一致，也可 能與參考序列有部分堿基差異，但運種差異通常不會影響標記的使用。
[0023] 本發明還提供了一種檢測水稻果皮顏色的方法，對待測樣本提取基因組DNA后，利 用SEQ ID N0.1所示的正向引物、SEQ ID N0.2和SEQ ID ^).3所示的反向引物進行口0?，對 PCR擴增產物大小進行分析，
[0024] 若擴增產物只出現173bp條帶，則表明待測樣品的果皮顏色為紫色或棟色;若只出 現179bp條帶，則表明待測樣品的果皮顏色為白色;若同時出現173bp和179bp條帶，則表明 待測樣品的果皮顏色為紫色或棟色。
[00巧]進一步地，上述PCR的反應體系為：2X化q master mix 4yL，10yM的正向、兩個反 向引物各 1.化L，10 % DMS0 0. ，模板DNA50-1 OOng，補d地2〇至 10化；
[0026] PCR反應條件為：94°(：，4111111;94°(：，2〇3,65°(：，2〇3,72°(：，3〇3，共32個循環；72°(：， 5min，16°C，lOmin。
[0027] 在本發明的一個實施例中，是通過將PCR擴增產物進行PAGE膠電泳進行判斷，PAGE 膠電泳條件為:6%PAGE 膠，U = 2000V，I = 200mA，P = 85W，電泳化。
[0028] 含有本發明所述的特異性引物組合的試劑盒也屬于本發明的保護范圍。
[0029] 本發明提供了上述含有SEQ ID NO. 1-3所示引物的試劑盒在紫色水稻選育中的應 用。
[0030] 本發明提供了上述含有SEQ ID NO. 1-3所示引物的試劑盒在水稻種質資源改良中 的應用。
[0031] 與現有技術相比，本發明具有W下有益效果:本發明基于引物擴增受阻突變體系 PCR原理，設計開發了一種擴增片段短，特異性強的水稻果皮顏色基因 Pb的分子標記。利用 該標記，不需要經過酶切，只需通過簡單的PCR即可完成對Pb的基因分型，預測水稻果皮顏 色。本發明具有操作簡便、分型快速、成本低廉等優勢，更適合在大規模分子標記輔助選擇 中運用。
【附圖說明】
[0032] 圖1是本發明分子標記的引物設計示意圖。擴增分子標記的引物組合包括正向引 物(〉)PbF，反向引物(OPbRl和化R2。其中化F可W分別與野生型化基因序列(饑-W)和GT缺 失型化基因序列(饑-M)完全匹配，饑R1只能與饑-M完全匹配，PbR2只能與化-W完全匹配。GT 缺失位點用方框標出。
[0033] 圖2是用本發明分子標記檢測15個水稻品種/品系的PAGE膠電泳圖。泳道1-15分別 為黑寶懦，中海香1號，湘晚釉12號，70489,71647,70363,71536,廣紅2號，wl0，wl2，wl3,補 血懦，K13135,光葉188，F13108-4ePCR片段大小標記在左側。
[0034] 圖3是用本發明分子標記檢測黑寶懦/中海香1號的F2代單株的PAGE膠電泳圖。泳 道1-18為不同的F2單株，PCR片段大小標記在左側。
【具體實施方式】
[0035] W下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。在不背離本發明精神 和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發明的范圍。
[0036] 若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段； 若未特別指明，實施例中所用試劑均為市售。
[0037] 實施例1水稻化基因分子標記的引物設計及擴增片段分析 [003引1、引物設計
[0039] 通過對水稻果皮顏色基因化在紫色和白色果皮品種中等位基因的序列比對，分析 得到了紫色和白色果皮品種在Pb第7外顯子中的GT缺失位點。根據GT缺失位點上下游的序 列設計引物組合：
[0040] PbF:AGCGACGACGACACCGACG，（沈Q ID N0.1)
[0041 ] PbRl:ATGCCTGCACCGAGAGGATCCA，（WQIDN0.2WP
[0042] PbR2:GTTGATGCCTGCACCGAGAGGACAT(沈Q ID ^.3)(見圖1)。
[0043] 2、擴增片段分析
[0044] 用上述引物組合對水稻果皮顏色基因饑進行擴增，紫色果皮材料（帶有GT缺失基 因型Pb)將能擴出一條173bp條帶，或者同時擴出一條173bp和一條179bp條帶。白色果皮材 料(帶有野生基因型饑)將能擴出一條179bp條帶。173bp和179bp條帶的核巧酸序列分別如 沈Q ID NO.4和沈Q ID NO.5所示
[0045] 實施例2用本發明分子標記鑒定水稻品種/品系的化基因型
[0046] 1、水稻果皮顏色鑒定方法
[0047] 用糖米機脫去穎殼，肉眼觀察并記錄糖米果皮顏色。
[004引 2、水稻基因組DNA的提取
[0049] 用黑寶懦、中海香1號、湘晚釉12號、70489、71647、70363、71536、廣紅2號、wlO、 wl2、wl3、補血懦、K13135、光葉188、F13108-4等15個水稻品種/品系為材料，采用CTAB法提 取水稻基因組DNA，具體步驟如下：取3cm長的水稻葉片，在8(Κ)化抽提緩沖液[1.5% (w/v) CTAB，1.05mol/L 化Cl，75mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，15mmol/L 邸TA(pH 8.0)]中磨碎，收 集到一個1.5mL離屯、管中。65°C水浴30min，間或顛倒混勻。加入8(Κ)化氯仿:異戊醇(體積比 24:1)，顛倒混勻15min。1200〇1'/111；[]1室溫離屯、1〇111；[]1。吸上清45化1^，轉移到一個新的1.5血離 屯、管中，加入2倍體積95%乙醇，混勻后-20°C沉淀30min。120001·/min離屯、15min。倒掉95% 乙醇，用75 %乙醇洗沉淀。倒掉75 %乙醇，干燥后加1(Κ)化滅菌dd出0溶解DNA。
[0化0] 3、PCR擴增
[0化1 ] 利用實施例1篩選得到的特異性引物組合(饑F，饑R1，PbR2)對本實施例所述15個 水稻品種/品系的DNA進行PCR擴增，反應體系為：2XTaq master mix(Sinobio)4化，1 ΟμΜ PbF、PbRl、PbR2 引物各 1. ，10 % DMSO 0. ，模板DM 50-1 OOng，補d地2〇至 10化。
[0052]反應程序為：94°C，4min; 94°C，20s，65°C，20s，72°C，30s，共32個循環；72°C，5min， 16°C，10min。
[0053] 4、PCR產物檢測
[0054] 擴增產物經6 % PAGE膠電泳檢測，電泳條件為:U= 2000V，I = 200mA，P = 85W，電泳 化。電泳完成后用0.1 % AgN〇3染色，觀片燈上觀察拍照。
[0055] 5、結果與分析
[0化6] 果皮顏色鑒定表明水稻品種/品系黑寶懦、70489、71647、70363、71536、wl2、wl3、 補血懦、K13135的果皮為紫色，湘晚釉12號、廣紅2號、wl0、F13108-4的果皮為紅色，中海香1 號、光葉188的果皮顏色為白色。用本發明實施例1的分子標記的引物組合擴增運些品種/品 系，發現所有紫色果皮品種都只擴增出了一條173bp的帶，而所有紅色和白色果皮的品種/ 品系都只擴增出了一條179bp的帶(見圖2)。果皮顏色鑒定的結果與用本發明實施例1的分 子標記鑒定的饑基因型的結果相符合，驗證了本發明分子標記鑒定水稻紫色果皮基因的準 確性和可靠性。
[0057]實施例3本發明分子標記的應用
[005引1、水稻材料水稻品種黑寶懦與中海香1號的F2代61個單株。
[0059] 2、水稻基因組DNA的提取在苗期提取葉片基因組DNA，具體方法同實施例2。
[0060] 3、PCR擴增和產物判斷標準參見實施例2。
[0061 ] 4、水稻果皮顏色鑒定方法參見實施例2。
[0062] 5、結果與分析用本發明實施例1的分子標記(特異性引物組合饑F，饑Rl，PbR2通過 PCR擴增得到)在苗期檢測黑寶懦與中海香1號的61個F2后代單株中Pb的基因型，發現有12 個單株只擴增出了 179bp條帶，有16個單株只擴增出了 173bp條帶，有33個單株同時擴增出 了 173bp和179bp條帶，結果見圖3。收種后對所述F2單株的果皮顏色進行鑒定，發現擴出 179bp條帶的單株只結白色果皮的種子，而剩余能擴增出173bp條帶的單株只結紫色或棟色 果皮的種子。說明本發明分子標記能有效跟蹤果皮顏色基因 Pb并能準確預測水稻果皮顏 色。
[0063] W上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人 員來說，在不脫離本發明技術原理的前提下，還可W做出若干改進和潤飾，運些改進和潤飾 也應視為本發明的保護范圍。
【主權項】
1. 一種水稻果皮顏色基因 Pb的分子標記，其特征在于，通過核苷酸序列如SEQ ID NO. 1-3所示的引物擴增得到。2. 權利要求1所述的分子標記在鑒定水稻果皮顏色基因 Pb基因型中的應用。3. 權利要求1所述的分子標記在水稻育種中的應用。4. 用于檢測水稻果皮顏色基因 Pb的特異性引物組合，其特征在于，含有核苷酸序列如 SEQ ID NO. 1-3所示的引物。5. 權利要求4所述的特異性引物組合在鑒定水稻果皮顏色基因 Pb基因型中的應用。6. 權利要求4所述的特異性引物組合在水稻種質資源改良中的應用。7. 檢測水稻果皮顏色基因 Pb基因型的方法，其特征在于，對待測樣本提取基因組DNA 后，利用SEQ ID NO.1所示的正向引物、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的反向引物進行 PCR，對PCR擴增產物大小進行分析，根據PCR產物大小確定Pb的基因型。8. -種檢測水稻果皮顏色的方法，其特征在于，對待測樣本提取基因組DNA后，利用SEQ ID N0.1所示的正向引物、SEQ ID N0.2和SEQ ID勵.3所示的反向引物進行?〇?，對?0財廣增 產物大小進行分析，根據PCR產物大小推測水稻果皮顏色。9. 如權利要求7或8所述的方法，其特征在于，PCR的反應體系為:2XTaq master mix 4 yL，ΙΟμΜ的正向、兩個反向引物各 1 · 5yL，10 %DMS0 0 · 5yL，模板DNA 50-100ng，補ddH20至 10 yL； PCR反應條件為：94°C，4min; 94°C，20s，65°C，20s，72°C，30s，共32個循環；72°C，5min， 16°C，10min〇10. 含有權利要求4所述的特異性引物組合的試劑盒。
【文檔編號】C12N15/11GK106011258SQ201610481722
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年6月22日
【發明人】黃培勁, 龍湍, 唐杰, 李佳林, 吳永忠
【申請人】海南波蓮水稻基因科技有限公司