水稻抗褐飛虱基因及其應用
【專利摘要】本發明公開了一種水稻抗褐飛虱基因及其應用。本發明通過對褐飛虱具有穩定抗性的水稻品種BG1222和感蟲水稻品種TN1的研究找到一種水稻抗褐飛虱基因，記名為BGIOSGA015836，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。抗蟲品種與感蟲品種相比，BGIOSGA015836的基因表達量存在顯著差異：無論是否受到褐飛虱吸食，BG1222中的BGIOSGA015836的表達量都遠高于TN1的表達量。雜交F2后代驗證結果表明BGIOSGA015836的表達量與水稻抗蟲性成正相關，其表達量越高抗蟲性越強。
【專利說明】
水稻抗褐飛風基因及其應用
技術領域
[0001 ]本發明屬于植物基因工程領域，具體涉及一種水稻抗褐飛虱基因 BGI0SGA015836,同時還涉及該基因在水稻及水稻種子抗褐飛虱中的應用。
【背景技術】
[0002] 隨著人類進入后基因組時代，全面開展功能基因組研究已成為生命科學研究的前 沿領域。由于水稻的轉基因技術相對容易，并且與其它禾本科作物基因組具有共線性，因而 被視做模式植物。目前，水稻基因組精細遺傳圖和物理圖譜已完成，進一步對水稻功能基因 進行研究，對社會經濟發展和生物學研究具有重大意義。
[0003] 目前世界上有超過一半的人以水稻為主食。糧食安全問題，是全世界人民面臨的 挑戰。20世紀50、60年代的矮化育種和70年代的雜交水稻培育兩次科技革命使水稻產量大 幅度提高。但近幾十年來水稻受到大面積的病蟲危害，使水稻生產受到威脅。褐飛虱是我國 水稻生產中的主要害蟲，其成蟲和若蟲以口針刺吸水稻汁液，引起黃葉或枯死，導致減產或 絕收。據中國農業年鑒記載，褐飛虱蟲害在1966、1969、1973、1977、1983和2003年全國性 大發生，1987、1991、2005、2006和2007年全國性特大發生，危害面積達到水稻總面積的 50%以上，給我國水稻生產造成了嚴重的損失。且褐飛虱的危害多發生在水稻成熟灌漿期， 此時大量使用殺蟲劑，對稻谷的污染也是非常嚴重的問題。
[0004] 利用抗褐飛虱基因培育抗蟲水稻品種是褐飛虱綜合防治中最為經濟有效的方法。 國際水稻研究所（IRRI)的研究結果和東南亞的水稻生產實踐證明，即使是只有中等抗性 水平的水稻品種，也足以將褐飛虱的群體控制在造成危害的水平以下，不至于對水稻造成 實際的危害和產量損失。因此，挖掘水稻抗褐飛虱基因并在水稻育種項目中應用是防治水 稻褐飛虱的根本措施。
[0005] 自20世紀60年代始，褐飛虱的抗性遺傳和育種研究就已經開始進行，但是隨著新 生物型(或新致害型）的產生，抗蟲品種面臨著使用壽命縮短，抗性喪失的風險。例如國際水 稻研究所于1973年推出具有Bphl基因的品種IR26,經過2-3年后即出現能致害的生物型2; 1977-1978年推出具Bph2抗性基因的品種IR36和IR42,結果1982年相繼在一些國家出現了 褐飛虱新的生物型，不得不在1983年又培育出相應的新抗性品種IR56和IR64。在2006年Seo 對韓國幾種攜帶不同抗飛虱基因的水稻品種進行測試，其中Cheongcheongbyeo(含Bphl基 因），ASD7與M63(含Bph2基因）的水稻的抗蟲性都有所下降，但是Gayabyeo(同時含有Bphl與 Bph2基因）的水稻還是具有很好的抗蟲性（Seo et al.，2009)。？仏33(同時含有Bph2與 Bph3基因）的致害水平較低，受害等級為2.5,品種表現抗蟲(張揚等，2011)。
[0006] 因此，繼續深入篩選與研究抗源材料、尋找新的抗性基因，并對其相關基因進行定 位與克隆，研發新的具有高抗性基因材料的水稻品種，具有非常重大的意義。
[0007] 本發明的目的在于提供一種水稻抗褐飛虱基因BGI0SGA015836及其應用。
[0008]本發明所采取的技術方案是： 水稻抗褐飛虱基因BGI0SGA015836編碼蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示。
[0009] 水稻抗褐飛虱基因 BGI0SGA015836的cDNA序列。
[0010] 優選的，其核苷酸序列如SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:3所示。
[0011] 水稻抗褐飛虱基因 BGI0SGA015836,其核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示，或該序 列經替換、缺失或增加一個或多個核苷酸，且編碼相同氨基酸序列的核苷酸序列。
[0012] 其中抗蟲品種BG1222中的BGI0SGA015836基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0:4所 示(包括外顯子和內含子），感蟲品種TN1中的BGI0SGA015836基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0:5所示(包括外顯子和內含子）。兩者編碼相同的氨基酸序列。
[0013] 所述基因BGI0SGA015836在水稻育種中的應用。
[0014] 所述基因BGI0SGA015836在提高水稻抗褐飛虱抗性中的應用。
[0015] -種提高水稻抗褐飛虱性能的方法，是通過分子育種方法或基因工程的方法，提 高BGI0SGA015836基因的表達量從而提高水稻抗褐飛虱性狀。
[0016] 本發明的有益效果是： 本發明通過對褐飛虱具有穩定抗性的水稻品種BG1222和感蟲水稻品種TN1的研究找到 一種水稻抗褐飛虱基因，記名為BGI0SGA015836。抗蟲品種與感蟲品種相比BGI0SGA015836 的基因表達量存在顯著差異。
[0017] 在抗蟲品種BG1222中BGI0SGA015836的表達量比感蟲水稻品種TN1的表達量高十 倍以上。無論是否受到褐飛虱吸食，BG1222中的BGI0SGA015836的表達量都遠高于TN1的表 達量。
[0018] 雜交F2后代驗證表明BGI0SGA015836的表達量與水稻抗蟲性成正相關(表達量越 高抗蟲性越強）。后代中抗蟲性越強，其抗性分數值(Grade)越小，相對應BGI0SGA015836的 表達量越高。
【附圖說明】
[0019] 圖1為受到褐飛虱吸食后的水稻品種BG1222和TN1的BGI0SGA015836表達量時間序 列變化； 圖2為雜交F2后代中BGI0SGA015836的表達量與水稻抗蟲性分數值的關系。
【具體實施方式】
[0020] 下面結合具體實施例對本發明作進一步的說明，但并不局限于此。
[0021] 褐飛虱是危害水稻生產的主要害蟲，近年來由于褐飛虱生物型發生變異及產生抗 藥性等原因，褐飛虱災害發生日趨嚴重。生產實踐證明，利用抗性品種是最經濟、安全而有 效的措施。按照"標準苗盤鑒定法"對BG1222進行了多年的苗期抗蟲級別檢測，發現其對褐 飛虱具有穩定高抗性，且BG1222對白葉枯病也具有較高的抗性，因此在育種上具有較高的 利用價值。但是BG1222對褐飛虱有哪些關鍵的基因與抗蟲性表現相關聯，國內外至今未見 文獻涉及。
[0022] TN1是國際公認不含任何抗蟲基因的感蟲水稻品種。
[0023] 本發明通過對褐飛虱具有穩定抗性的水稻品種BG1222和感蟲水稻品種TN1的研究 找到水稻抗褐飛虱基因BGI0SGA015836。抗蟲品種與感蟲品種相比，BGI0SGA015836的基因 表達量存在顯著差異。在抗蟲品種BG1222中，BGI0SGA015836的表達量比感蟲水稻品種TN1 的表達量高十倍以上。無論是否受到褐飛虱吸食，BG1222中的BGI0SGA015836的表達量都遠 高于TN1的表達量。
[0024] 通過具有穩定高抗性的水稻品種BG1222與感蟲品種TN1以及雜交?2后代的研究實 驗表明，BGI0SGA015836的表達量與水稻抗蟲性成正相關(表達量越高抗蟲性越強）后代 中抗蟲性越強，其抗性分數值(Grade)越小，相對應BGI0SGA015836的表達量越高。
[0025] 實施例1抗蟲品種與感蟲品種相比BGI0SGA015836的基因表達量存在顯著差異 一.水稻基因RNA提取 1) 樣本分為組織以及細胞:細胞直接收集;液氮研磨組織樣本，加入500yl含4%P-巰基 乙醇的CTAB提取液，65度水浴30min; 2) 然后加入等體積的氯仿/異戊醇(24:1)，混勻后10,000g離心10min; 3) 加入等體積的異丙醇，-20度放置lh，12,000g離心10min，棄上清； 4) 加入lOOOul Trizol重懸沉淀，然后加入200yl氯仿，用手劇烈振蕩15秒，室溫靜置 5min； 5) 4°C下，10，000g離心3min，溶液分為三層，RNA溶解在水相中，轉移水相至另一個新 的RNase free EP管； 6) 加入0.5倍體積異丙醇，渦旋充分混勻； 7) 4°C下，12，000g離心10min，離心后管底出現RNA沉淀，去上清； 8) 加入lml 75%乙醇，用手輕輕顛倒，12,000g離心5min，去上清； 9) 室溫晾干或真空干燥，加入60yl DEPC水溶解沉淀。
[0026] 二.去基因組 使用RNase-free的DNase I，按以下體系配置反應液：
37 °C 消化 30min，65 °C 滅活 10min。
[0027]然后按以下步驟操作： 1) 加入等體積的苯酚，上下顛倒混勻后10，〇〇〇rpm，離心5min，取上清； 2) 加入等體積的氯仿，上下顛倒混勾后10,000rpm，離心10min，取上清； 3 )加入等體積異丙醇，輕柔地充分混勻，-20 °C靜置15min; 4) 4°C下，10,000g離心10min，收集RNA沉淀，去上清； 5) 用75%乙醇洗滌兩次，超凈臺風干； 6) 加入10yl DEPC水溶解沉淀。
[0028]三.純度檢測及電泳檢測 純度檢測:取2yl RNA樣品60倍稀釋，在微量分光光度計k2800(北京凱奧)上測定0D值， OD260/OD280的比值大于1 ? 8，說明制備的RNA較純，無蛋白質污染。
[0029] 四.逆轉錄 1)在PCR管中加入模板RNA、引物混合物，總量12yl。反應體系如下：
70°C保溫lOmin后迅速在冰上冷卻2min。
[0030] 2)在該PCR管中加入下列試劑
將上述20yl反應溶液42°C保溫60min;72°C保溫15mn;-20°C保存備用。
[0031] 五?定量 利用下列引物對進行BGIOSGAO15836的基因表達量的分析，其堿基序列如下所示： RE-f：CCAACAGCTCTGCGCTCATC(SEQ ID N0：6), RE-r：ACTCCAGCCAAAAGAAACCCA(SEQ ID N0：7)〇 [0032] 1)反應體系：cDNA稀釋3倍
[0033] 2)反應條件：使用ViiA7 software 95 °C 30S； 95°C 3S，60°C 34S(收集熒光信號）；45個循環。
[0034]融解曲線分析:溫度60°C_95°C，每分鐘讀1次。
[0035] 結果見圖1。
[0036]圖1中橫坐標為水稻受到褐飛虱吸食的小時數，縱坐標為BGI0SGA015836的相對表 達量：以在〇小時(h)，TNl中基因BGI0SGA015836的表達量標準化為數值1，其它時間與材料 的基因表達量都是基于此，由于表達量的差異值有幾十倍之多，所以將表達量數值取以10 為底的對數最終得到相對表達量。
[0037]從圖1可以看出受到褐飛虱吸食的情況下，植株受到外來刺激，BGI0SGA015836的 表達量會提高，說明該基因在BG1222和TN1中既具有組成型(沒有受到外界刺激也有表達差 異）表達差異，也具有誘導型（受到外界刺激引起表達差異）表達差異。在不同時間點， BGI0SGA015836基因在BG1222的表達量都會顯著高于TN1的表達量。
[0038] 圖1結果表明在抗蟲品種BG1222中BGI0SGA015836的表達量比感蟲水稻品種TN1的 表達量高十倍以上。無論是否受到褐飛虱吸食，BG1222中的BGI0SGA015836的表達量都遠高 于TN1的表達量。
[0039] 實施例2 BGI0SGA015836的基因的克隆，以及多肽分析 分別對抗蟲品種BG1222以及感蟲品種TN1的BGI0SGA015836基因進行克隆，進行分析。 [0040] 其中抗蟲品種BG1222中的BGI0SGA015836基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0:4所 示(包括外顯子和內含子），感蟲品種TN1中的BGI0SGA015836基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 5所不(包括外顯子和內含子）。
[0041 ] 其中抗蟲品種BG1222中BGI0SGA015836基因的cDNA序列如SEQ ID N0:2所示；而 感蟲品種TN1中BGI0SGA015836基因的cDNA序列如SEQ ID N0:3所示。上述cDNA有5處堿基 有所不同，但是編碼得到的水稻抗褐飛虱的多肽序列是相同的，其氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示。
[0042] 實施例3抗蟲品種與感蟲品種進行雜交F2代 通過BG1222與TN1的雜交建立?2后代群體，其中？2后代群體的樣本n=512。從中選取了 60個不同抗性分數值的個體檢測，并對不同抗性級別表型的F2后代個體分別檢測其 BGI0SGA015836的表達量，以確定BGI0SGA015836的表達量與水稻抗蟲表型的相關性。
[0043] 結果見圖2。
[0044] 圖2結果表明：雜交F2后代驗證表明BGI0SGA015836的表達量與水稻抗蟲性成正相 關（表達量越高抗蟲性越強）。后代中抗蟲性越強，其抗性分數值越小，相對應 86的表達量越高。抗性分數值(6瓜(16)分為0，1，3,5,7,9;分數值越小代表其抗 蟲性越強。
[0045]上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的 限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。
【主權項】
1. 水稻抗褐飛虱基因 BGI0SGA015836編碼蛋白，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO :1所示。2. 水稻抗褐飛虱基因 BGI0SGA015836的cDNA序列。3. 根據權利要求2所述的cDNA序列，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID N0:2或 SEQ ID NO:3 所示。4. 水稻抗褐飛虱基因 BGI0SGA015836,其核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示，或該序列 經替換、缺失或增加一個或多個核苷酸，且編碼相同氨基酸序列的核苷酸序列。5. 權利要求4所述基因 BGI0SGA015836在水稻育種中的應用。6. 權利要求4所述基因 BGI0SGA015836在提高水稻抗褐飛虱抗性中的應用。7. -種提高水稻抗褐飛虱性能的方法，其特征在于:通過分子育種方法或基因工程的 方法，提高BGI0SGA015836基因的表達量從而提高水稻抗褐飛虱性狀。
【文檔編號】C12N15/82GK105820222SQ201610289474
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2016年5月3日
【發明人】李怡峰, 肖漢祥, 張振飛, 李燕芳, 張揚
【申請人】廣東省農業科學院植物保護研究所