本發明屬于(yu)生物基(ji)因工程(cheng)，具體涉及一種象(xiang)耳(er)豆根結線蟲效應基(ji)因mecdup，相關(guan)蛋白及其應用。

背景技術：

1、根(gen)結(jie)線(xian)(xian)蟲(chong)(chong)(chong)(chong)是一類非常(chang)重(zhong)要(yao)的(de)植(zhi)(zhi)(zhi)物(wu)(wu)(wu)寄生(sheng)(sheng)性線(xian)(xian)蟲(chong)(chong)(chong)(chong)，在世界各地都有分布，是生(sheng)(sheng)產上危(wei)害最嚴重(zhong)的(de)植(zhi)(zhi)(zhi)物(wu)(wu)(wu)病原線(xian)(xian)蟲(chong)(chong)(chong)(chong)。根(gen)結(jie)線(xian)(xian)蟲(chong)(chong)(chong)(chong)在植(zhi)(zhi)(zhi)物(wu)(wu)(wu)根(gen)內固著寄生(sheng)(sheng)，寄主可(ke)達(da)數(shu)千種(zhong)，其危(wei)害造(zao)成的(de)農林作物(wu)(wu)(wu)損(sun)失幾乎占所(suo)有植(zhi)(zhi)(zhi)物(wu)(wu)(wu)線(xian)(xian)蟲(chong)(chong)(chong)(chong)造(zao)成損(sun)失的(de)一半，據(ju)統(tong)計根(gen)結(jie)線(xian)(xian)蟲(chong)(chong)(chong)(chong)每(mei)年造(zao)成的(de)全(quan)球農業損(sun)失可(ke)達(da)1730億美元。象耳豆根(gen)結(jie)線(xian)(xian)蟲(chong)(chong)(chong)(chong)(meloidogyne?enterolobii)是根(gen)結(jie)線(xian)(xian)蟲(chong)(chong)(chong)(chong)屬中嚴重(zhong)危(wei)害農作物(wu)(wu)(wu)的(de)一種(zhong)根(gen)結(jie)線(xian)(xian)蟲(chong)(chong)(chong)(chong)，近年來，隨著全(quan)球氣候(hou)變化導致土壤溫度升(sheng)高，此外農業生(sheng)(sheng)產的(de)技(ji)術提高使(shi)得機械(xie)化種(zhong)植(zhi)(zhi)(zhi)廣(guang)泛投入(ru)使(shi)用，為象耳豆根(gen)結(jie)線(xian)(xian)蟲(chong)(chong)(chong)(chong)的(de)繁殖(zhi)、侵(qin)染(ran)植(zhi)(zhi)(zhi)物(wu)(wu)(wu)提供了便(bian)利，導致象耳豆根(gen)結(jie)線(xian)(xian)蟲(chong)(chong)(chong)(chong)的(de)發生(sheng)(sheng)持續增(zeng)高，農作物(wu)(wu)(wu)產量下降，防控難度逐步增(zeng)大。

2、rna干(gan)(gan)擾(rao)(rna?interference,rnai)技(ji)術(shu)最早是在(zai)秀麗隱桿線蟲(chong)中發現并成功應用(yong)，這項技(ji)術(shu)能夠使(shi)得某(mou)一(yi)個(ge)指(zhi)定(ding)的(de)(de)(de)(de)基(ji)因沉(chen)默。目(mu)前這個(ge)方(fang)(fang)法已經廣(guang)泛地使(shi)用(yong)在(zai)許多種(zhong)不同的(de)(de)(de)(de)植物寄生性線蟲(chong)效應蛋白基(ji)因的(de)(de)(de)(de)功能研究(jiu)方(fang)(fang)面(mian)。rnai技(ji)術(shu)通過dsrna的(de)(de)(de)(de)特異性降解靶(ba)mrna，干(gan)(gan)擾(rao)或抑制(zhi)該目(mu)的(de)(de)(de)(de)基(ji)因的(de)(de)(de)(de)功能，從而達(da)到(dao)干(gan)(gan)擾(rao)該種(zhong)生物生長、發育和繁殖，甚至達(da)到(dao)致(zhi)死的(de)(de)(de)(de)效果(guo)。rnai技(ji)術(shu)相較于(yu)(yu)其(qi)他(ta)防治方(fang)(fang)法，其(qi)最大的(de)(de)(de)(de)優(you)點是能夠定(ding)向(xiang)作(zuo)用(yong)于(yu)(yu)特定(ding)的(de)(de)(de)(de)某(mou)種(zhong)或某(mou)類(lei)害蟲(chong)，但(dan)不影響其(qi)他(ta)生物。

3、針對(dui)線(xian)蟲(chong)(chong)效(xiao)應(ying)(ying)子(zi)(zi)(zi)蛋白(bai)，利用(yong)rnai將(jiang)dsrna轉化到(dao)寄(ji)主植物中，形成轉基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)植株，當(dang)線(xian)蟲(chong)(chong)寄(ji)生(sheng)到(dao)植物后(hou)，植物可源源不(bu)斷地提供dsrna，達到(dao)沉默根(gen)結(jie)線(xian)蟲(chong)(chong)效(xiao)應(ying)(ying)子(zi)(zi)(zi)蛋白(bai)表達從而達到(dao)防治根(gen)結(jie)線(xian)蟲(chong)(chong)的目的，該基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)沉默方法持續(xu)時間更(geng)長，沉默效(xiao)果更(geng)穩定。如2006年，把南方根(gen)結(jie)線(xian)蟲(chong)(chong)的剪接因(yin)(yin)(yin)(yin)子(zi)(zi)(zi)和整合酶的dsrna發夾結(jie)構(gou)轉化到(dao)煙(yan)草中形成轉基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)煙(yan)草，在接種南方根(gen)結(jie)線(xian)蟲(chong)(chong)后(hou)，轉基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)煙(yan)草與與對(dui)照相(xiang)比，線(xian)蟲(chong)(chong)數量減少了(le)90％以上(yadavet?al.,2006)。此后(hou)利用(yong)此技術(shu)體(ti)系構(gou)建抗病轉基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)植物的有效(xiao)性被不(bu)斷驗證。該技術(shu)的核心在于(yu)效(xiao)應(ying)(ying)蛋白(bai)的發現(xian)。

4、本(ben)團隊前期研究(jiu)獲得了多(duo)個擬禾本(ben)科(ke)根結線(xian)蟲效(xiao)(xiao)應子(zi)，包括在擬禾本(ben)科(ke)根結線(xian)蟲亞腹食道腺(xian)表達的效(xiao)(xiao)應蛋白mggpp，以及(ji)在背食道腺(xian)表達的效(xiao)(xiao)應蛋白mgmo237；我們研究(jiu)顯示，在mggpp基(ji)因(yin)沉默轉基(ji)因(yin)水稻以及(ji)mgmo237基(ji)因(yin)沉默轉基(ji)因(yin)水稻中，線(xian)蟲侵(qin)染(ran)力(li)均顯著下降，而相反地，mggpp過表達水稻以及(ji)mgmo237過表達水稻，都(dou)更容(rong)易受到擬禾本(ben)科(ke)根結線(xian)蟲的侵(qin)染(ran)。

5、因此，探索象耳(er)豆根結線蟲的(de)效(xiao)應基因，進(jin)而(er)利用rnai技術構建抗象耳(er)豆根結線蟲植物，是(shi)防控(kong)象耳(er)豆根結線蟲病(bing)害的(de)有力(li)途徑。

技術實現思路

1、本發明研究獲(huo)得一種象(xiang)耳(er)豆根(gen)結線(xian)蟲效(xiao)應(ying)基(ji)因mecdup，核苷(gan)酸(suan)序列如seq?id?no：1所示，編碼蛋白mecdup的(de)氨(an)基(ji)酸(suan)序列如seq?id?no：2所示。沉默該(gai)基(ji)因能夠顯著降低(di)象(xiang)耳(er)豆根(gen)結線(xian)蟲侵染辣椒的(de)能力，植(zhi)物過表達該(gai)基(ji)因可抑(yi)制由flg22介(jie)導的(de)植(zhi)物防衛反應(ying)，ros迸發和胼(pian)胝質沉積(ji)都受(shou)到(dao)抑(yi)制，效(xiao)應(ying)基(ji)因mecdup可作為(wei)培育(yu)抗線(xian)蟲植(zhi)物品種的(de)靶(ba)基(ji)因。

2、本發明的(de)首要(yao)目的(de)是提供一種象耳豆根(gen)結線(xian)蟲(chong)效應基因mecdup。

3、本發明(ming)的另一目的是提(ti)供一種象耳豆根結線蟲效應蛋白mecdup。

4、本發明的再一目的是提供(gong)所述(shu)象耳豆根結線(xian)蟲效應(ying)基(ji)因mecdup及效應(ying)蛋白mecdup的應(ying)用。

5、本發明(ming)通過以下技(ji)術(shu)方案(an)實現上述發明(ming)目的：

6、本發明研究獲得(de)一種(zhong)象耳豆(dou)根結(jie)線(xian)(xian)(xian)蟲(chong)(chong)效(xiao)應基因(yin)(yin)(yin)mecdup，核苷酸(suan)(suan)序列(lie)如seq?id?no：1所(suo)示，編碼蛋白mecdup的(de)氨基酸(suan)(suan)序列(lie)如seq?id?no：2所(suo)示。該(gai)基因(yin)(yin)(yin)特異的(de)在根結(jie)線(xian)(xian)(xian)蟲(chong)(chong)背食道腺中表(biao)達，線(xian)(xian)(xian)蟲(chong)(chong)侵(qin)染(ran)煙草葉片(pian)后，mecdup蛋白定(ding)位在植物細胞核。通過體外(wai)rnai方(fang)法沉默象耳豆(dou)根結(jie)線(xian)(xian)(xian)蟲(chong)(chong)的(de)mecdup基因(yin)(yin)(yin)后接種(zhong)在辣椒(jiao)上，結(jie)果(guo)顯示該(gai)基因(yin)(yin)(yin)的(de)沉默能夠(gou)顯著降低象耳豆(dou)根結(jie)線(xian)(xian)(xian)蟲(chong)(chong)侵(qin)染(ran)辣椒(jiao)的(de)能力。植物過表(biao)達該(gai)基因(yin)(yin)(yin)可抑(yi)制由(you)flg22介導的(de)植物防衛反應，ros迸(beng)發和胼(pian)胝(zhi)質沉積都受到抑(yi)制。因(yin)(yin)(yin)此，mecdup是(shi)象耳豆(dou)根結(jie)線(xian)(xian)(xian)蟲(chong)(chong)的(de)效(xiao)應蛋白，mecdup及其編碼基因(yin)(yin)(yin)mecdup可作為培育抗線(xian)(xian)(xian)蟲(chong)(chong)植物品種(zhong)的(de)靶基因(yin)(yin)(yin)，在象耳豆(dou)根結(jie)線(xian)(xian)(xian)蟲(chong)(chong)的(de)防控方(fang)面具有重要意(yi)義。

7、因此，本(ben)發明要求保護如下應用方案：

8、一種象耳豆根結線蟲效應基因mecdup，核(he)苷酸序列如seq?id?no：1所示。

9、一種象耳豆(dou)根結(jie)線蟲效應(ying)蛋白mecdup，氨(an)基酸序(xu)列(lie)如(ru)seq?id?no：2所(suo)示(shi)。

10、在(zai)(zai)嚴格(ge)條件(jian)(jian)下與(yu)上(shang)述(shu)(shu)象耳豆(dou)(dou)根結(jie)(jie)線(xian)蟲(chong)(chong)效應基(ji)因mecdup雜交且(qie)(qie)編碼與(yu)象耳豆(dou)(dou)根結(jie)(jie)線(xian)蟲(chong)(chong)寄生相(xiang)關蛋(dan)白的dna分(fen)子(zi)，或者(zhe)與(yu)上(shang)述(shu)(shu)象耳豆(dou)(dou)根結(jie)(jie)線(xian)蟲(chong)(chong)效應基(ji)因mecdup有90％以內(nei)同(tong)源性(xing)且(qie)(qie)編碼象耳豆(dou)(dou)根結(jie)(jie)線(xian)蟲(chong)(chong)寄生相(xiang)關蛋(dan)白的dna分(fen)子(zi)，也應在(zai)(zai)本(ben)發明(ming)的保護范圍內(nei)。所述(shu)(shu)嚴格(ge)條件(jian)(jian)為：可在(zai)(zai)0.1×ssc、0.1×0.1％sds的溶液中，65℃條件(jian)(jian)下雜交并洗膜。

11、一種重組表達載體，由空載體的多克隆位點插入所述象耳(er)豆根結(jie)線蟲效應基因mecdup。

12、一種重組基因表達盒，含(han)有(you)所述象耳(er)豆根結線蟲效應基因mecdup或其片段。

13、所述(shu)(shu)效應(ying)(ying)基因mecdup或所述(shu)(shu)效應(ying)(ying)蛋白(bai)mecdup在降低根(gen)結(jie)線(xian)蟲對植物的侵(qin)染中的應(ying)(ying)用(yong)。

14、所(suo)述效應(ying)基因mecdup或所(suo)述效應(ying)蛋白mecdup在(zai)防治根結線(xian)蟲病害中的應(ying)用(yong)。

15、所述效應(ying)(ying)基因mecdup在構建(jian)抗根結(jie)線蟲病植物中的應(ying)(ying)用。

16、所述(shu)效應基因mecdup在構建防衛反應提高(gao)的植物中(zhong)的應用(yong)。

17、所述效應基(ji)因(yin)mecdup作為沉默靶基(ji)因(yin)在構建抗根(gen)結(jie)線蟲病(bing)植物(wu)中的應用。

18、所述效(xiao)應基因mecdup作(zuo)為沉默靶基因在構(gou)建防衛反應提高的植物中(zhong)的應用。

19、所述(shu)效應基(ji)因mecdup作為沉默(mo)靶基(ji)因在構(gou)建in?plantarani植物表達載體中的應用。

20、一種用于構(gou)建(jian)防衛反應提高、抗根結(jie)線蟲病植(zhi)物(wu)的in?plantarani植(zhi)物(wu)表(biao)達載體，是(shi)以所述(shu)效應基因mecdup為沉默靶(ba)基因的植(zhi)物(wu)表(biao)達載體。

21、所述in?plantarani植物(wu)表達載體(ti)在構建抗根結線蟲病植物(wu)中的應用。

22、所(suo)述in?plantarani植(zhi)物表(biao)達載體在構建防衛反應(ying)提高(gao)的(de)植(zhi)物中的(de)應(ying)用

23、一種防(fang)衛(wei)反應(ying)提高(gao)、抗(kang)根結線蟲的(de)植(zhi)物的(de)構建(jian)方法(fa)，利(li)用(yong)農桿(gan)菌介導的(de)遺傳(chuan)轉化法(fa)，將所(suo)述(shu)in?plantarani植(zhi)物表達載體轉化植(zhi)物，得(de)到(dao)mecdup-rnai轉基因植(zhi)物，其防(fang)衛(wei)反應(ying)得(de)到(dao)提高(gao)，具(ju)有抗(kang)根結線蟲能力(li)。

24、優選地，上述(shu)所述(shu)根結線蟲為象耳豆根結線蟲。

25、作為可實施方(fang)(fang)案，可將含(han)有象耳豆(dou)根結(jie)線(xian)蟲效(xiao)應基因mecdup重組(zu)表達載體利用(yong)膿桿(gan)菌導入到目的植(zhi)(zhi)(zhi)物(wu)(wu)(wu)中，或(huo)者(zhe)通(tong)過ti質粒、ri質粒、植(zhi)(zhi)(zhi)物(wu)(wu)(wu)病毒載體、直接dna轉(zhuan)化(hua)、顯微注(zhu)射、電導入或(huo)基因槍等(deng)常規生物(wu)(wu)(wu)學方(fang)(fang)法轉(zhuan)化(hua)植(zhi)(zhi)(zhi)物(wu)(wu)(wu)細(xi)胞或(huo)組(zu)織(zhi)，并將轉(zhuan)化(hua)的植(zhi)(zhi)(zhi)物(wu)(wu)(wu)組(zu)織(zhi)培育成植(zhi)(zhi)(zhi)株(zhu)，得到抗線(xian)蟲的轉(zhuan)基因植(zhi)(zhi)(zhi)物(wu)(wu)(wu)。

26、本發明(ming)的技術方案(an)具(ju)有(you)以(yi)下有(you)益(yi)效果(guo)：

27、本(ben)發明提(ti)供(gong)了一(yi)種(zhong)象(xiang)耳(er)豆(dou)根(gen)結(jie)(jie)(jie)線(xian)(xian)蟲效應基(ji)因(yin)mecdup及其編(bian)碼蛋白(bai)mecdup，其特異的(de)(de)在根(gen)結(jie)(jie)(jie)線(xian)(xian)蟲背食道腺中表達(da)，線(xian)(xian)蟲侵染煙草(cao)葉片后，mecdup蛋白(bai)定位在植物(wu)(wu)(wu)細胞核。通過(guo)體外rnai方法沉(chen)默象(xiang)耳(er)豆(dou)根(gen)結(jie)(jie)(jie)線(xian)(xian)蟲的(de)(de)mecdup基(ji)因(yin)后接(jie)種(zhong)在辣(la)椒(jiao)上(shang)，結(jie)(jie)(jie)果顯(xian)示該基(ji)因(yin)的(de)(de)沉(chen)默能(neng)夠顯(xian)著降低象(xiang)耳(er)豆(dou)根(gen)結(jie)(jie)(jie)線(xian)(xian)蟲侵染辣(la)椒(jiao)的(de)(de)能(neng)力。植物(wu)(wu)(wu)過(guo)表達(da)該基(ji)因(yin)可抑制(zhi)(zhi)由flg22介導的(de)(de)植物(wu)(wu)(wu)防衛反應，ros迸發和胼胝質(zhi)沉(chen)積(ji)都受到抑制(zhi)(zhi)。因(yin)此，mecdup是(shi)象(xiang)耳(er)豆(dou)根(gen)結(jie)(jie)(jie)線(xian)(xian)蟲的(de)(de)效應蛋白(bai)，mecdup及其編(bian)碼基(ji)因(yin)mecdup可作為培(pei)育抗(kang)線(xian)(xian)蟲植物(wu)(wu)(wu)品種(zhong)的(de)(de)靶基(ji)因(yin)，為培(pei)育廣譜抗(kang)蟲性的(de)(de)植物(wu)(wu)(wu)新(xin)(xin)品種(zhong)提(ti)供(gong)了新(xin)(xin)靶點，是(shi)一(yi)種(zhong)綠(lv)色安(an)全有效的(de)(de)防治根(gen)結(jie)(jie)(jie)線(xian)(xian)蟲的(de)(de)途徑。