本發(fa)明涉及(ji)生物，具體涉及(ji)一種(zhong)表達豬瘟(wen)病毒重組e2蛋白的重組偽狂(kuang)犬病毒株及(ji)應用。

背景技術：

1、e2蛋白位于豬瘟病毒(csfv)囊(nang)膜表面，參與病毒感(gan)染，負責與細胞上的受(shou)體(ti)結合，是csfv的主要保護抗(kang)原(yuan)，并能誘(you)導產生中(zhong)和抗(kang)體(ti)。

2、偽狂犬病毒(du)(du)(prv)具有150kb的基因(yin)組，可以利(li)用細菌人工染色(se)體(bac)技(ji)術進(jin)行反向(xiang)遺傳(chuan)操作。將毒(du)(du)力基因(yin)(tk、ge和(he)gi)敲除，成為免疫(yi)原(yuan)(yuan)性較好的弱毒(du)(du)株。此外(wai)，prv基因(yin)組中含有許(xu)多(duo)非(fei)必(bi)需基因(yin)，如us4、us7、us8、us9，外(wai)源基因(yin)可以插入到這些基因(yin)中而不影響病毒(du)(du)的體外(wai)和(he)/或體內(nei)復制潛力，使其成為表達(da)其他豬病外(wai)源抗原(yuan)(yuan)的合適載體([1]cong?x，lei?jl，xia?sl，et?al.2016.pathogenicity?and?immunogenicity?of?a?ge/gi/tk?gene-deleted?pseudorabies?virus?variant?in?susceptible?animals.vet?microbiol，182：170-177.[2]qiu?hj，tian?zj，tong?gz，et?al.2005.protective?immunity?induced?by?arecombinant?pseudorabies?virus?expressing?the?gp5?of?porcine?reproductive?andrespiratory?syndrome?virus?in?piglets.vet?immunol?immunopathol，106：309-319.)。免疫(yi)后可感染宿主(zhu)細胞，prv的基因(yin)組可在細胞內(nei)表達(da)外(wai)源蛋(dan)白(bai)，病毒(du)(du)感染后期細胞裂解，外(wai)源蛋(dan)白(bai)釋放出細胞，誘導體液免疫(yi)，產生(sheng)針(zhen)對外(wai)源蛋(dan)白(bai)的抗體。

3、現有(you)(you)的(de)prv疫苗(miao)，即(ji)bartha-k61疫苗(miao)，對prv變異(yi)株僅(jin)提供50％的(de)保護作(zuo)用。目前(qian)用于預防豬瘟的(de)c株對流行(xing)的(de)csfv?2.1d亞基因型(xing)效果(guo)欠佳。因此，研制針對偽狂犬病毒和(he)豬瘟病毒流行(xing)株的(de)疫苗(miao)是極其(qi)迫切的(de)。目前(qian)已有(you)(you)許多以prv為(wei)活載體(ti)表達豬瘟病毒e2基因的(de)報道，但目前(qian)尚無有(you)(you)效的(de)能廣(guang)泛應(ying)用于畜(chu)牧業的(de)案例(li)。

技術實現思路

1、基(ji)于現有技(ji)術中的不足，本研究(jiu)開展了(le)以prv?ge/tk雙基(ji)因缺失減毒株(zhu)為活載體，表達(da)csfv流行毒株(zhu)csfv?2.1d?e2基(ji)因，獲得了(le)一株(zhu)能誘導豬(zhu)體產生與(yu)經(jing)典csfv疫苗(miao)株(zhu)c株(zhu)相當(dang)的抗(kang)體水平的二聯(lian)苗(miao)候選株(zhu)rprv-deltk/ge-gc-e2。

2、本發明的具(ju)體(ti)的技術方案如下：

3、本發明(ming)提供了一種表達豬瘟病(bing)(bing)(bing)毒重組(zu)e2蛋白的(de)重組(zu)偽狂犬(quan)病(bing)(bing)(bing)毒株(zhu)(zhu)，以偽狂犬(quan)病(bing)(bing)(bing)毒基因組(zu)作為所述重組(zu)偽狂犬(quan)病(bing)(bing)(bing)毒株(zhu)(zhu)的(de)骨架，以去除跨(kua)膜(mo)區的(de)豬瘟病(bing)(bing)(bing)毒e2基因作為導入基因；

4、在偽狂犬(quan)病(bing)毒(du)基因組gc信號肽序列(lie)(lie)與gc基因序列(lie)(lie)之間插(cha)入去除跨膜區的豬瘟病(bing)毒(du)e2基因序列(lie)(lie)。

5、所述豬瘟病毒(du)(du)e2基因(yin)為來自豬瘟病毒(du)(du)新型2.1d亞基因(yin)型毒(du)(du)株的e2基因(yin)。

6、優選的，所(suo)述偽狂(kuang)犬病毒(du)為偽狂(kuang)犬病毒(du)株(zhu)prv?zj2013株(zhu)，所(suo)述偽狂(kuang)犬病毒(du)株(zhu)prvzj2013毒(du)株(zhu)敲除了(le)tk基(ji)(ji)(ji)因和(he)ge基(ji)(ji)(ji)因；所(suo)述tk基(ji)(ji)(ji)因核(he)苷(gan)酸(suan)序列(lie)如(ru)seq?id?no.4所(suo)示(shi)，ge基(ji)(ji)(ji)因核(he)苷(gan)酸(suan)序列(lie)如(ru)seq?id?no.5所(suo)示(shi)。

7、更(geng)為(wei)優選的(de)(de)，所(suo)(suo)述去除跨膜(mo)區的(de)(de)豬(zhu)瘟病(bing)毒e2基因(yin)的(de)(de)序(xu)列(lie)如(ru)seq?id?no.1所(suo)(suo)示(shi)；gc信號肽序(xu)列(lie)如(ru)seq?id?no.2所(suo)(suo)示(shi)的(de)(de)1-60bp序(xu)列(lie)，gc基因(yin)序(xu)列(lie)如(ru)seq?id?no.2所(suo)(suo)示(shi)的(de)(de)1108-2484bp序(xu)列(lie)。

8、本發明(ming)還提(ti)供了所述重組偽狂犬病毒株的制備方法，包括以下步驟(zou)：

9、(1)將含(han)有去除(chu)跨(kua)膜區的(de)豬瘟(wen)病毒e2基因(yin)(yin)(yin)序列(lie)的(de)重(zhong)組載體插入到(dao)tk基因(yin)(yin)(yin)和ge基因(yin)(yin)(yin)雙基因(yin)(yin)(yin)缺失毒株(zhu)rprv-deltk/ge的(de)gc信號肽序列(lie)與gc基因(yin)(yin)(yin)序列(lie)之(zhi)間(jian)，獲得rprv-deltk/ge-gc-e2；

10、(2)將步驟(1)獲得(de)的rprv-deltk/ge-gc-e2轉(zhuan)染(ran)到(dao)bhk-21細胞，得(de)到(dao)所述(shu)重組偽狂犬病(bing)毒株(zhu)。

11、優選(xuan)的(de)，所述(shu)tk基(ji)因核苷(gan)酸(suan)序列(lie)(lie)如(ru)(ru)seq?id?no.4所示，ge基(ji)因核苷(gan)酸(suan)序列(lie)(lie)如(ru)(ru)seq?idno.5所示；所述(shu)去除跨(kua)膜區(qu)的(de)豬瘟病毒e2基(ji)因的(de)序列(lie)(lie)如(ru)(ru)seq?id?no.1所示。

12、具體的，重(zhong)組(zu)載體還包括(kuo)homoa同源(yuan)臂、限制性核酸內切酶i-scei、kan基因序列。重(zhong)組(zu)用片段p1序列組(zu)成：en-homoa-iscei-kan-homoa-ec，其中enec組(zu)成e2，homa用于第二步重(zhong)組(zu)去(qu)除iscei-kan序列。

13、本發(fa)明(ming)還(huan)提供了(le)所述的(de)重組偽(wei)狂(kuang)犬病毒株在制備預防(fang)或治療偽(wei)狂(kuang)犬病及豬瘟的(de)疫苗中的(de)應用。

14、本發明還提(ti)供了(le)一種(zhong)預防(fang)或(huo)治(zhi)療豬瘟和偽(wei)(wei)狂犬病(bing)的二聯疫(yi)苗(miao)，包含(han)所述重(zhong)組(zu)偽(wei)(wei)狂犬病(bing)毒株活病(bing)毒或(huo)者滅活后的病(bing)毒。

15、本發明的有益效(xiao)果：

16、本研究以tk/ge雙基因(yin)缺失prv減(jian)毒株(zhu)(zhu)(zhu)作為病毒載體(ti)，將去除跨膜(mo)區的(de)外源csfve2基因(yin)插入到prv?gc信(xin)號肽序列之(zhi)后，構建了位(wei)于(yu)gc?n端且與(yu)prv?gc融合表達的(de)重(zhong)組(zu)病毒rprv-deltk/ge-gc-e2；經western?blotting分析和間接免疫(yi)(yi)熒(ying)光檢測證(zheng)明gc-e2蛋(dan)白(bai)成功表達。重(zhong)組(zu)病毒免疫(yi)(yi)小鼠可產生針(zhen)對e2的(de)特異性抗體(ti)；免疫(yi)(yi)仔豬(zhu)后，可產生與(yu)經典csfv弱毒疫(yi)(yi)苗株(zhu)(zhu)(zhu)c株(zhu)(zhu)(zhu)相當的(de)抗體(ti)水平。本研究所獲(huo)得的(de)rprv-deltk/ge-gc-e2是一種極(ji)具有前(qian)景的(de)二聯活疫(yi)(yi)苗候選株(zhu)(zhu)(zhu)。

技術特征：

1.一種表達豬瘟病(bing)毒重組(zu)(zu)e2蛋白的重組(zu)(zu)偽(wei)狂犬(quan)(quan)病(bing)毒株(zhu)，其特征在于(yu)，以偽(wei)狂犬(quan)(quan)病(bing)毒基因組(zu)(zu)作為(wei)所述重組(zu)(zu)偽(wei)狂犬(quan)(quan)病(bing)毒株(zhu)的骨(gu)架(jia)，以去除跨膜(mo)區的豬瘟病(bing)毒e2基因作為(wei)導入基因；

2.如權利要求(qiu)1所(suo)述的重組(zu)偽狂犬病毒株，其特征(zheng)在于，

3.如(ru)權利要求1所(suo)述(shu)(shu)的重(zhong)組(zu)偽狂犬(quan)病(bing)毒(du)株，其特征(zheng)在于，所(suo)述(shu)(shu)偽狂犬(quan)病(bing)毒(du)為偽狂犬(quan)病(bing)毒(du)株prv?zj2013株，所(suo)述(shu)(shu)偽狂犬(quan)病(bing)毒(du)株prv?zj2013毒(du)株敲(qiao)除了tk基(ji)(ji)因(yin)(yin)和ge基(ji)(ji)因(yin)(yin)；所(suo)述(shu)(shu)tk基(ji)(ji)因(yin)(yin)核苷酸(suan)序(xu)列如(ru)seq?id?no.4所(suo)示，ge基(ji)(ji)因(yin)(yin)核苷酸(suan)序(xu)列如(ru)seq?id?no.5所(suo)示。

4.如權利要求2所述的重(zhong)組偽狂(kuang)犬病(bing)毒(du)株，其(qi)特(te)征在于(yu)，所述去除(chu)跨膜區的豬瘟病(bing)毒(du)e2基(ji)因(yin)的序列如seq?id?no.1所示；

5.如(ru)權(quan)利要求1-4任一(yi)所述重組偽(wei)狂犬(quan)病毒株的(de)制(zhi)備方法(fa)，其特征(zheng)在于(yu)，包括(kuo)以下步驟：

6.如權利(li)要求5所(suo)述(shu)(shu)偽(wei)狂犬病毒(du)株(zhu)的制(zhi)備方法，其(qi)特(te)征在于，所(suo)述(shu)(shu)tk基(ji)(ji)(ji)因核(he)苷酸序列(lie)如seq?id?no.4所(suo)示(shi)，ge基(ji)(ji)(ji)因核(he)苷酸序列(lie)如seq?id?no.5所(suo)示(shi)；所(suo)述(shu)(shu)去除(chu)跨(kua)膜區的豬瘟病毒(du)e2基(ji)(ji)(ji)因的序列(lie)如seq?id?no.1所(suo)示(shi)。

7.如(ru)權(quan)利要求6所述偽狂犬病毒株的制備方法，其特征在于，重組載體還(huan)包括homoa同源臂、限制性核酸內切酶i-scei、kan基因序列。

8.權(quan)利要求(qiu)1-4任一所(suo)述(shu)的(de)重組偽(wei)狂犬(quan)病(bing)毒株在(zai)制備預防(fang)或治(zhi)療偽(wei)狂犬(quan)病(bing)及豬(zhu)瘟的(de)疫苗(miao)中的(de)應用。

9.一(yi)種預防或治療豬瘟和偽(wei)狂犬(quan)病(bing)的二聯疫苗，其特(te)征(zheng)在于，包(bao)含權利(li)要求1-4任(ren)一(yi)所述重組偽(wei)狂犬(quan)病(bing)毒株(zhu)活病(bing)毒或者滅活后(hou)的病(bing)毒。

技術總結
本發明公開了一種表達豬瘟病毒重組E2蛋白的重組偽狂犬病毒株及應用，涉及生物技術領域。本研究以TK/gE雙基因缺失PRV減毒株作為病毒載體，將去除跨膜區的外源CSFV?E2基因插入到PRV?gC信號肽序列之后，構建了位于gC?N端且與PRV?gC融合表達的重組病毒rPRV?delTK/gE?gC?E2；經Western?blotting分析和間接免疫熒光檢測證明gC?E2蛋白成功表達。重組病毒免疫小鼠可產生針對E2的特異性抗體；免疫仔豬后，可產生與經典CSFV弱毒疫苗株C株相當的抗體水平。本研究所獲得的rPRV?delTK/gE?gC?E2是一種極具有前景的二聯活疫苗候選株。

技術研發人員：張存,云濤,孫陽陽,陳柳,朱寅初,華炯鋼,葉偉成,倪征
受保護的技術使用者：浙江省農業科學院
技術研發日：
技術公布日：2024/9/19