本發明涉及基因工程，具體涉及cd36基因過表達的山羊乳腺上皮(pi)細胞的構建方(fang)法(fa)及應用。

背景技術：

1、cd36是一(yi)種多功(gong)能(neng)糖蛋(dan)白，廣泛分布于血(xue)小(xiao)板、單(dan)核(he)吞噬細(xi)胞(bao)、脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)肪細(xi)胞(bao)、肝細(xi)胞(bao)、肌細(xi)胞(bao)和(he)一(yi)些(xie)上(shang)皮細(xi)胞(bao)中(zhong)(zhong)，可(ke)作為多種配體(ti)的(de)受體(ti)，包括脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)相關(guan)配體(ti)(如長鏈脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)肪酸、氧化(hua)低(di)密度(du)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)蛋(dan)白和(he)氧化(hua)磷脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi))，以(yi)及蛋(dan)白質(zhi)(zhi)相關(guan)配體(ti)(如血(xue)栓反(fan)應蛋(dan)白、淀粉樣蛋(dan)白、膠原i和(he)iv)。因此在(zai)(zai)(zai)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)攝取(qu)、免(mian)(mian)疫調節(jie)、炎癥和(he)血(xue)管生成中(zhong)(zhong)起關(guan)鍵作用。研究(jiu)發(fa)現(xian)，cd36不僅可(ke)以(yi)在(zai)(zai)(zai)病原體(ti)誘導的(de)信號(hao)傳導中(zhong)(zhong)激活(huo)細(xi)胞(bao)因子的(de)分泌，而且在(zai)(zai)(zai)細(xi)菌吞噬和(he)清除中(zhong)(zhong)發(fa)揮重(zhong)要作用。另外(wai)，缺(que)乏吞噬能(neng)力的(de)細(xi)胞(bao)在(zai)(zai)(zai)轉(zhuan)染(ran)(ran)cd36后會獲得或增(zeng)強吞噬功(gong)能(neng)。可(ke)見(jian)cd36是機體(ti)內的(de)重(zhong)要中(zhong)(zhong)心分子，參與(yu)免(mian)(mian)疫反(fan)應的(de)多個階(jie)段。cd36可(ke)單(dan)獨激活(huo)細(xi)胞(bao)或與(yu)其他受體(ti)聯合(he)識別危險(xian)信號(hao)，從而消除潛在(zai)(zai)(zai)的(de)自身或非(fei)自身威脅。目(mu)前，對cd36基因的(de)研究(jiu)多集(ji)中(zhong)(zhong)在(zai)(zai)(zai)吞噬性細(xi)胞(bao)中(zhong)(zhong)，對其在(zai)(zai)(zai)非(fei)吞噬細(xi)胞(bao)中(zhong)(zhong)的(de)功(gong)能(neng)也多集(ji)中(zhong)(zhong)在(zai)(zai)(zai)其介(jie)導脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)攝取(qu)方面，因此，研究(jiu)cd36在(zai)(zai)(zai)乳腺上(shang)皮細(xi)胞(bao)感染(ran)(ran)中(zhong)(zhong)的(de)作用具有重(zhong)要意(yi)義(yi)。

技術實現思路

1、針對現(xian)有技術(shu)中存在的(de)(de)(de)不足，本發(fa)明目的(de)(de)(de)是提(ti)供cd36基因(yin)(yin)過表(biao)達(da)的(de)(de)(de)山羊(yang)乳腺(xian)(xian)上(shang)皮細胞的(de)(de)(de)構建(jian)方法及應用，以山羊(yang)原代乳腺(xian)(xian)上(shang)皮細胞為(wei)材料，采用crispr/cas9基因(yin)(yin)編(bian)輯技術(shu)，將編(bian)碼cd36基因(yin)(yin)的(de)(de)(de)啟(qi)動子替換為(wei)內(nei)源性(xing)強啟(qi)動子，以達(da)到高表(biao)達(da)的(de)(de)(de)目的(de)(de)(de)。獲(huo)得陽性(xing)克(ke)隆細胞系(xi)后，通過定量(liang)和蛋白免疫印跡評(ping)(ping)價重(zhong)組效率，通過lps誘導的(de)(de)(de)炎癥(zheng)反應評(ping)(ping)價cd36基因(yin)(yin)在乳腺(xian)(xian)炎模型(xing)中的(de)(de)(de)功能，獲(huo)得穩定過表(biao)達(da)山羊(yang)cd36基因(yin)(yin)和抗炎的(de)(de)(de)乳腺(xian)(xian)上(shang)皮細胞。

2、為解決上述技(ji)(ji)術問題，本發明提供的技(ji)(ji)術方案是：

3、cd36基因過表達的山羊(yang)乳腺上皮細胞的構建方法，

4、利用基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)編輯技術，將編碼(ma)cd36基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)的啟動子替換為內源(yuan)性強表(biao)達b-actin基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)的啟動子，將cd36基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)過(guo)表(biao)達，獲得穩(wen)定(ding)過(guo)表(biao)達山羊cd36基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)的原代(dai)乳腺上皮細胞；

5、具體(ti)包括如(ru)下步驟：

6、s1.修(xiu)復片(pian)段b-actin啟(qi)動(dong)子的擴增：以(yi)山羊的基因(yin)組dna為模版，通過pcr擴增b-actin啟(qi)動(dong)子并純化；所(suo)述b-actin啟(qi)動(dong)子的核苷酸序列如seq?id?no.1所(suo)示；

7、s2.cd36基因(yin)左同(tong)源(yuan)(yuan)臂、右同(tong)源(yuan)(yuan)臂的(de)(de)擴增：以山(shan)羊(yang)cd36的(de)(de)基因(yin)組dna為模(mo)版，將cd36基因(yin)5’utr前后(hou)各1kb作(zuo)為左、右同(tong)源(yuan)(yuan)臂，進行(xing)pcr擴增并(bing)純化；所述cd36基因(yin)左同(tong)源(yuan)(yuan)臂的(de)(de)核苷(gan)酸(suan)序(xu)列如(ru)seq?id?no.2所示；cd36基因(yin)右同(tong)源(yuan)(yuan)臂的(de)(de)核苷(gan)酸(suan)序(xu)列如(ru)seq?id?no.3所示；

8、s3.donor線(xian)(xian)性骨架制備(bei)：將pz-tomato質粒(li)經sal?i內切酶(mei)和hind?iii內切酶(mei)雙酶(mei)切，純化，獲(huo)得donor線(xian)(xian)性骨架；

9、s4.構建pz-tomato-cd36質(zhi)(zhi)粒：將(jiang)s1獲(huo)得的b-actin啟(qi)動子(zi)、s2獲(huo)得的cd36基因左(zuo)同(tong)(tong)源(yuan)(yuan)(yuan)臂(bei)、右同(tong)(tong)源(yuan)(yuan)(yuan)臂(bei)片(pian)段進行酶切，連(lian)接(jie)(jie)，獲(huo)得同(tong)(tong)源(yuan)(yuan)(yuan)臂(bei)片(pian)段：左(zuo)同(tong)(tong)源(yuan)(yuan)(yuan)臂(bei)-啟(qi)動子(zi)-右同(tong)(tong)源(yuan)(yuan)(yuan)臂(bei)；將(jiang)所述同(tong)(tong)源(yuan)(yuan)(yuan)臂(bei)片(pian)段與(yu)s3獲(huo)得的donor線性骨架(jia)連(lian)接(jie)(jie)，構建pz-tomato-cd36質(zhi)(zhi)粒；

10、s5.構(gou)建px459-cd36質粒：確定(ding)cd36基(ji)因啟動子的pam位點，構(gou)建雙鏈grna片段；px459載(zai)體(ti)bbsi酶切(qie)后，將(jiang)雙鏈grna片段連接(jie)px459質粒載(zai)體(ti)，獲得px459-cd36質粒；轉入(ru)大腸桿菌(jun)感受態細胞，篩(shai)選、驗(yan)證陽性單(dan)克隆；

11、s6.將s5獲得(de)的px459-cd36質(zhi)(zhi)粒和s4獲得(de)的pz-tomato-cd36質(zhi)(zhi)粒按照質(zhi)(zhi)量比1:1電轉入山羊乳(ru)腺上皮細胞，抗性篩選，得(de)到穩(wen)定過表達山羊cd36基因的乳(ru)腺上皮細胞。

12、優選的，

13、所述grna的序列如seq?id?no.10，seq?id?no.11所示。

14、優選的，

15、所述s1中修復片(pian)段b-actin啟動子的(de)擴增采(cai)用(yong)的(de)引物的(de)序(xu)列如(ru)seq?id?no.4，seqid?no.5所示。

16、優選的，

17、所述s2中cd36基因的左同(tong)源(yuan)臂擴(kuo)增(zeng)采(cai)用(yong)的引物的序列(lie)如seq?id?no.6，seq?idno.7所示；cd36基因的右同(tong)源(yuan)臂擴(kuo)增(zeng)采(cai)用(yong)的引物的序列(lie)如seq?id?no.8，seq?id?no.9所示。

18、優選的，

19、所述s5中cd36-sgrna質粒的驗證引物序列(lie)如(ru)seq?id?no.11，seq?idno.12所示(shi)。

20、優選的，

21、所(suo)述(shu)s4中(zhong)同源臂片(pian)(pian)段(duan)與(yu)donor線(xian)(xian)性(xing)骨架(jia)通過gibson連接，所(suo)述(shu)同源臂片(pian)(pian)段(duan)和donor線(xian)(xian)性(xing)骨架(jia)質量比為2:1。

22、上述的方法(fa)構建的cd36基因過表達的山羊乳(ru)腺上皮細胞。

23、上述(shu)的cd36基因過表達(da)的山羊乳腺(xian)上皮細胞在構建(jian)炎癥反(fan)應動物模型中的應用。

24、優選的，

25、構建(jian)炎癥反應動物(wu)模型的步驟為(wei)：

26、將野生(sheng)型(xing)山羊乳腺上(shang)皮(pi)細(xi)胞(bao)、基因(yin)過表達(da)乳腺上(shang)皮(pi)細(xi)胞(bao)復蘇后，待細(xi)胞(bao)匯合度(du)達(da)70％～80％時，加(jia)10μg/ml?lps處理12h，提取細(xi)胞(bao)總mrna，通過實(shi)時熒光定量(liang)pcr檢測(ce)炎癥因(yin)子(zi)基因(yin)的表達(da)量(liang)。

27、優選的，

28、所述(shu)炎癥因子pcr檢測(ce)引物(wu)序(xu)列(lie)如seq?id?no.13～seq?id?no.24所示。

29、本發明的有益效果是：

30、本發明(ming)利用(yong)crispr/cas9基(ji)因編輯技術，以山(shan)羊(yang)原(yuan)代(dai)乳(ru)(ru)腺(xian)上(shang)皮(pi)細(xi)胞為材料，將編碼cd36基(ji)因的啟(qi)(qi)動子(zi)(zi)替換為內源性強表達(da)b-actin基(ji)因的啟(qi)(qi)動子(zi)(zi)，將cd36基(ji)因過(guo)表達(da)獲得了穩定過(guo)表達(da)山(shan)羊(yang)cd36基(ji)因的原(yuan)代(dai)乳(ru)(ru)腺(xian)上(shang)皮(pi)細(xi)胞。本方法(fa)提(ti)供了一種(zhong)構建cd36過(guo)表達(da)的方法(fa)，利用(yong)該方法(fa)得到的cd36基(ji)因過(guo)表達(da)的山(shan)羊(yang)乳(ru)(ru)腺(xian)上(shang)皮(pi)細(xi)胞，可有(you)效保護乳(ru)(ru)腺(xian)上(shang)皮(pi)細(xi)胞免受lps誘導(dao)的炎(yan)癥反應，為乳(ru)(ru)腺(xian)炎(yan)基(ji)因治(zhi)療領域提(ti)供理論支持。

技術特征：

1.cd36基因過表達的(de)山羊乳腺上皮(pi)細胞的(de)構建方法，其特征在于，

2.根據(ju)權利要求1所述的(de)cd36基因過表達的(de)山羊乳腺上皮(pi)細胞的(de)構建方法，其特征在(zai)于，

3.根據權利要求1所述的(de)(de)cd36基因過表達(da)的(de)(de)山羊乳腺上皮細胞(bao)的(de)(de)構(gou)建(jian)方(fang)法(fa)，其(qi)特征在于，

4.根據權利(li)要求1所述的cd36基(ji)因(yin)過表(biao)達的山羊乳腺上(shang)皮(pi)細(xi)胞的構建方法(fa)，其特征在于，

5.根據權利要求(qiu)1所述的(de)cd36基(ji)因過表達(da)的(de)山羊乳(ru)腺上皮細胞(bao)的(de)構建方法(fa)，其特征在于(yu)，

6.根據權利(li)要求1所述的(de)(de)cd36基(ji)因過表達的(de)(de)山羊乳(ru)腺上皮細胞的(de)(de)構建方(fang)法，其(qi)特征在于，

7.權利要求(qiu)1-6任一項所(suo)述(shu)的方法構建(jian)的cd36基(ji)因過表達的山羊(yang)乳腺(xian)上(shang)皮細胞(bao)。

8.根(gen)據權利要求1-6任一項所述(shu)的(de)cd36基因過(guo)表達(da)的(de)山羊乳腺上皮細(xi)胞在構建(jian)炎癥(zheng)反應動物模(mo)型中的(de)應用。

9.根(gen)據權利要(yao)求8所述的(de)應用，其特(te)征在(zai)于(yu)，

10.根(gen)據權利要求9所述的(de)應用，其特征(zheng)在于，

技術總結
本發明提供Cd36基因過表達的山羊乳腺上皮細胞的構建方法及應用，靶向山羊乳腺上皮細胞Cd36基因的gRNA，構建Cd36基因過表達山羊乳腺上皮細胞。該方法包括：利用基因編輯技術，將編碼Cd36基因的啟動子替換為內源性強表達b?actin基因的啟動子。本發明設計了特異靶向Cd36基因的gRNA，利用Cas9蛋白向Cd36基因的5’UTR前插入內源性強啟動子，從而達到對乳腺上皮細胞進行基因過表達的目的。利用本發明方法得到的Cd36基因過表達的山羊乳腺上皮細胞，可有效保護乳腺上皮細胞免受LPS誘導的炎癥反應。本方法提供了一種構建Cd36過表達的方法，為乳腺炎基因治療領域提供理論支持。

技術研發人員：邢怡明,白伊麗娜
受保護的技術使用者：中國農業大學
技術研發日：
技術公布日：2024/9/19