本(ben)發明涉及(ji)(ji)威(wei)尼斯鐮(lian)刀菌(jun)(jun)基因工程(cheng)領域，涉及(ji)(ji)產(chan)甜菜(cai)紅素(su)威(wei)尼斯鐮(lian)刀菌(jun)(jun)表達載體的構建及(ji)(ji)產(chan)甜菜(cai)紅素(su)威(wei)尼斯鐮(lian)刀菌(jun)(jun)株的創建，具(ju)體涉及(ji)(ji)同時(shi)提高鐮(lian)刀菌(jun)(jun)菌(jun)(jun)絲體蛋白和甜菜(cai)紅素(su)產(chan)量(liang)的方法。

背景技術：

1、由威尼斯鐮刀菌發酵生產的(de)(de)菌絲(si)體(ti)蛋(dan)白(bai)安全性好且能夠(gou)提(ti)(ti)供均衡的(de)(de)營養，具有(you)替(ti)代動植物來源(yuan)膳(shan)食蛋(dan)白(bai)的(de)(de)潛質。然而(er)，天(tian)然菌株(zhu)生產菌絲(si)體(ti)蛋(dan)白(bai)的(de)(de)高(gao)成(cheng)本(ben)(ben)成(cheng)為限(xian)制其發展的(de)(de)關(guan)鍵因素(su)。而(er)打破當前這種(zhong)限(xian)制因素(su)的(de)(de)方式主要有(you)兩種(zhong)，一(yi)種(zhong)是通過對(dui)菌株(zhu)進行改造以提(ti)(ti)高(gao)菌絲(si)體(ti)蛋(dan)白(bai)的(de)(de)合(he)(he)成(cheng)效(xiao)率直接(jie)降低成(cheng)本(ben)(ben)；另一(yi)種(zhong)則是在菌株(zhu)中合(he)(he)成(cheng)具有(you)附(fu)加(jia)價值的(de)(de)產品以提(ti)(ti)高(gao)總體(ti)的(de)(de)經(jing)濟效(xiao)益。

2、甜菜(cai)(cai)紅(hong)素(su)是一(yi)種從紅(hong)甜菜(cai)(cai)根中(zhong)提(ti)取的(de)(de)天(tian)然紅(hong)色(se)食(shi)用(yong)(yong)色(se)素(su)，對人體(ti)具有(you)抗(kang)氧化、抗(kang)炎(yan)、降血脂和抗(kang)腫瘤等功效。然而，考慮(lv)到甜菜(cai)(cai)根中(zhong)甜菜(cai)(cai)紅(hong)素(su)的(de)(de)含量較(jiao)低，提(ti)取過程中(zhong)產品的(de)(de)回收率相對較(jiao)低，以及(ji)(ji)全球市場需求的(de)(de)不斷增(zeng)長，迫切(qie)需要一(yi)種新(xin)的(de)(de)甜菜(cai)(cai)紅(hong)素(su)供應(ying)模(mo)式。當前，從土(tu)地利用(yong)(yong)、生(sheng)產周期(qi)和可持續大規(gui)模(mo)生(sheng)產的(de)(de)角度來看，微生(sheng)物發酵(jiao)生(sheng)產甜菜(cai)(cai)紅(hong)素(su)的(de)(de)優(you)勢(shi)最為明顯。因此，創建高(gao)產甜菜(cai)(cai)紅(hong)素(su)的(de)(de)威(wei)(wei)尼(ni)斯鐮(lian)(lian)刀(dao)菌菌株不僅(jin)可以提(ti)高(gao)菌株生(sheng)產菌絲體(ti)蛋(dan)白(bai)時(shi)的(de)(de)總(zong)體(ti)經濟(ji)效益以及(ji)(ji)緩(huan)解甜菜(cai)(cai)紅(hong)素(su)供應(ying)不足(zu)的(de)(de)現狀，還可以擴大威(wei)(wei)尼(ni)斯鐮(lian)(lian)刀(dao)菌在未來食(shi)品領(ling)域(yu)的(de)(de)應(ying)用(yong)(yong)范圍(wei)。

技術實現思路

1、本發明的一個目的是解(jie)決至少(shao)上述問題(ti)和/或缺(que)陷，并提(ti)供至少(shao)后面將說明的優點。

2、針對現有技術的(de)需(xu)求，本(ben)發明的(de)目的(de)在于提供產甜菜紅素的(de)威尼斯鐮刀菌(jun)表達(da)載體和(he)菌(jun)株。

3、本發(fa)明還有一(yi)個目的(de)是(shi)提(ti)供同時提(ti)高鐮(lian)刀菌菌絲體蛋(dan)白和甜菜(cai)紅素(su)產量(liang)的(de)方法。

4、為此(ci)，本(ben)發明提供如下的(de)技術方(fang)案(an)：

5、同時提高鐮刀(dao)菌(jun)菌(jun)絲(si)體蛋白和甜菜紅素產(chan)量的方(fang)法，包括如下(xia)步(bu)驟：

6、將負載有細胞色素(su)(su)p450酶(mei)(mei)基(ji)因(yin)片(pian)段(duan)(duan)、多(duo)(duo)巴(ba)4，5-雙加氧酶(mei)(mei)基(ji)因(yin)片(pian)段(duan)(duan)和(he)葡糖基(ji)轉移酶(mei)(mei)基(ji)因(yin)片(pian)段(duan)(duan)的超量表達(da)載體轉化入鐮刀(dao)(dao)菌(jun)體內，得(de)到新的鐮刀(dao)(dao)菌(jun)，其(qi)中，細胞色素(su)(su)p450酶(mei)(mei)基(ji)因(yin)片(pian)段(duan)(duan)、多(duo)(duo)巴(ba)4，5-雙加氧酶(mei)(mei)基(ji)因(yin)片(pian)段(duan)(duan)和(he)葡糖基(ji)轉移酶(mei)(mei)基(ji)因(yin)片(pian)段(duan)(duan)被構建為連鎖基(ji)因(yin)；

7、將所述新的鐮(lian)刀(dao)菌(jun)接種(zhong)于液體培養(yang)基中進行培養(yang)，分別獲(huo)取(qu)發酵液和菌(jun)體，并從(cong)(cong)所述發酵液中收獲(huo)甜(tian)菜紅素，從(cong)(cong)所述菌(jun)體中收獲(huo)菌(jun)絲體蛋白。

8、優選的(de)是，所述的(de)同(tong)時提高鐮刀菌菌絲(si)體蛋白和(he)甜(tian)菜紅素(su)產量的(de)方法中，將細胞(bao)色素(su)p450酶基(ji)因片(pian)(pian)段、多巴4，5-雙加氧酶基(ji)因片(pian)(pian)段和(he)葡(pu)糖基(ji)轉(zhuan)移酶基(ji)因片(pian)(pian)段通過2a肽(tai)串聯在一起的(de)開放閱讀框命名為(wei)ruby基(ji)因。

9、優(you)選的是，所述(shu)的同(tong)時提高鐮(lian)刀菌菌絲體蛋白(bai)和甜菜紅素(su)產量的方法中(zhong)，得到所述(shu)新的鐮(lian)刀菌的方法包括如下步驟：

10、以(yi)包含ruby基因的表(biao)達載(zai)體(ti)addgene?id:160908為模板，以(yi)seq?id?no:1和2所(suo)示(shi)的一組引物(wu)對為引物(wu)，擴增出ruby片段，隨后通過同源重組將上述片段與線性化(hua)pk2-pgpda-ttef1載(zai)體(ti)連接(jie)，獲得表(biao)達載(zai)體(ti)pk2-pgpda-ruby-ttef1，

11、以表達載(zai)體pk2-pgpda-ruby-ttef1為模板，以seq?id?no:3和4所示的一(yi)組引(yin)物(wu)對為引(yin)物(wu)，擴增得到用于(yu)crispr/cas9介導的基(ji)因同(tong)源定向重組插入的供體dna片段pgpda-ruby-ttef1；

12、將(jiang)seq?id?no:13所(suo)示的(de)5srrna啟(qi)動子(zi)序列(lie)片段(duan)和如seq?id?no:15所(suo)示的(de)sgrnagfp片段(duan)通(tong)過融合pcr進行(xing)兩輪擴增，融合獲得(de)(de)5srrna-sgrnagfp，并通(tong)過同源重組酶(mei)將(jiang)融合后的(de)片段(duan)插入到骨架載(zai)體pfc322-cas9上(shang)，獲得(de)(de)介導ruby定點整(zheng)合威尼斯(si)鐮刀菌基(ji)因(yin)組的(de)crispr/cas9表達載(zai)體；

13、通過原(yuan)生質體(ti)(ti)轉(zhuan)化(hua)方法，將所(suo)述介(jie)導ruby定點整合威尼(ni)斯鐮(lian)刀(dao)(dao)菌基因(yin)組的(de)crispr/cas9表達載體(ti)(ti)和供(gong)體(ti)(ti)dna片段pgpda-ruby-ttef1依次加(jia)入威尼(ni)斯鐮(lian)刀(dao)(dao)菌原(yuan)生質體(ti)(ti)懸浮(fu)液中，培養，篩選得到超量表達甜菜紅素合成基因(yin)ruby的(de)陽性(xing)轉(zhuan)化(hua)子，得到所(suo)述新的(de)鐮(lian)刀(dao)(dao)菌。

14、優選(xuan)的(de)(de)(de)是，所述(shu)的(de)(de)(de)同時(shi)提高鐮刀菌(jun)菌(jun)絲體(ti)蛋白(bai)和甜菜紅素產量(liang)的(de)(de)(de)方(fang)法中(zhong)，進行原(yuan)生質(zhi)體(ti)轉化時(shi)，所述(shu)介(jie)導ruby定點整(zheng)合(he)威尼(ni)斯鐮刀菌(jun)基因組的(de)(de)(de)crispr/cas9表達載體(ti)和供體(ti)dna片(pian)段pgpda-ruby-ttef1的(de)(de)(de)加入量(liang)均為(wei)800ng/μl。

15、優選(xuan)的(de)(de)是(shi)，所(suo)(suo)述(shu)的(de)(de)同時(shi)提(ti)高鐮刀菌菌絲體蛋白和甜菜紅素產量的(de)(de)方法中(zhong)，以(yi)如(ru)seqid?no:5和6所(suo)(suo)示(shi)(shi)的(de)(de)一組引物(wu)對(dui)從威(wei)尼斯鐮刀菌的(de)(de)dna基(ji)因組中(zhong)通過pcr擴(kuo)(kuo)(kuo)出(chu)內源所(suo)(suo)述(shu)5srrna啟(qi)動子片(pian)段(duan)，以(yi)如(ru)seq?id?no:7和8所(suo)(suo)示(shi)(shi)的(de)(de)一組引物(wu)對(dui)在如(ru)seq?id?no:14所(suo)(suo)示(shi)(shi)的(de)(de)grnascaffold片(pian)段(duan)為模板擴(kuo)(kuo)(kuo)出(chu)sgrnagfp序列，隨后(hou)通過融合(he)pcr進行(xing)兩(liang)輪擴(kuo)(kuo)(kuo)增，將5srrna啟(qi)動子片(pian)段(duan)與sgrnagfp片(pian)段(duan)進行(xing)融合(he)。

16、優選的是，所(suo)述的同時提高(gao)鐮刀菌菌絲體蛋白和甜菜紅素產量的方法中，所(suo)述液體培養基包含如下(xia)組(zu)分：葡萄糖(tang)40g/l，酵母(mu)粉(fen)0.5g/l，硫(liu)酸(suan)(suan)銨12g/l，硫(liu)酸(suan)(suan)鎂1.5g/l，氯化鉀0.7g/l，硫(liu)酸(suan)(suan)鈉(na)0.5g/l，磷(lin)酸(suan)(suan)二氫鉀2g/l和碳酸(suan)(suan)鈣0.5/l?g。

17、優選的(de)是，所(suo)述的(de)同時提高(gao)鐮刀菌菌絲(si)體蛋白和甜菜紅素(su)產量(liang)的(de)方法(fa)中，將所(suo)述新的(de)鐮刀菌接種于液體培養基中進行培養的(de)方法(fa)包括：

18、將所(suo)述新的(de)鐮刀菌(jun)接種在cmc-na固體培養(yang)基(ji)上培養(yang)進行產孢，隨后(hou)制(zhi)備(bei)孢懸液(ye)，取(qu)所(suo)述孢懸液(ye)接種于cmc-na液(ye)體培養(yang)基(ji)中進行搖床培養(yang)若干(gan)天(tian)，再(zai)收集得到發酵液(ye)。

19、本(ben)發明至少包括以下有益效果：

20、本發明通過在威尼斯鐮(lian)刀菌(jun)(jun)中定向過表達(da)甜菜(cai)(cai)紅(hong)素(su)合成基(ji)因ruby，獲得高效合成甜菜(cai)(cai)紅(hong)素(su)的(de)威尼斯鐮(lian)刀菌(jun)(jun)菌(jun)(jun)株(zhu)，達(da)到菌(jun)(jun)株(zhu)菌(jun)(jun)絲(si)體蛋白生產(chan)時(shi)提高綜合經(jing)濟效益的(de)目的(de)。

21、本(ben)發明(ming)(ming)的(de)其它(ta)優點、目(mu)標和特征將部(bu)(bu)分通過下面的(de)說明(ming)(ming)體現(xian)，部(bu)(bu)分還將通過對本(ben)發明(ming)(ming)的(de)研(yan)究和實踐而為(wei)本(ben)領域的(de)技術人員所理解(jie)。

技術特征：

1.同時提(ti)高鐮刀(dao)菌菌絲體(ti)蛋白和甜(tian)菜紅(hong)素產量(liang)的方法，其(qi)特(te)征在于，包括(kuo)如(ru)下步(bu)驟：

2.如權利要求1所述的(de)同時提高(gao)鐮刀菌菌絲體蛋(dan)白(bai)和(he)甜菜(cai)紅素產(chan)量的(de)方法，其(qi)特征(zheng)在(zai)于(yu)，將細胞(bao)色素p450酶基(ji)因片段、多巴4，5-雙加氧酶基(ji)因片段和(he)葡糖基(ji)轉移酶基(ji)因片段通過(guo)2a肽(tai)串聯(lian)在(zai)一(yi)起的(de)開放(fang)閱讀框(kuang)命(ming)名為ruby基(ji)因。

3.如權(quan)利要求2所述的(de)同時提(ti)高鐮(lian)刀菌(jun)菌(jun)絲體蛋白和(he)甜菜紅素產量的(de)方法(fa)，其特征在(zai)于，得到(dao)所述新的(de)鐮(lian)刀菌(jun)的(de)方法(fa)包括如下步驟：

4.如權利(li)要(yao)求3所(suo)述的同時提高鐮刀(dao)菌(jun)菌(jun)絲體(ti)(ti)蛋白和(he)(he)甜菜(cai)紅素產量(liang)的方法(fa)，其(qi)特征在(zai)于(yu)，進行原(yuan)生(sheng)質體(ti)(ti)轉(zhuan)化時，所(suo)述介導ruby定點(dian)整合威尼斯鐮刀(dao)菌(jun)基(ji)因組(zu)的crispr/cas9表達載體(ti)(ti)和(he)(he)供體(ti)(ti)dna片段(duan)pgpda-ruby-ttef1的加入量(liang)均為800ng/μl。

5.如權利要求3所述的(de)(de)(de)同時提高鐮刀菌(jun)菌(jun)絲體蛋白和(he)甜菜紅素產(chan)量的(de)(de)(de)方法，其特征在于，以如seq?id?no:5和(he)6所示(shi)的(de)(de)(de)一組(zu)引(yin)物對從威尼(ni)斯鐮刀菌(jun)的(de)(de)(de)dna基因(yin)組(zu)中通(tong)過pcr擴出內(nei)源所述5srrna啟動子片段，以如seq?id?no:7和(he)8所示(shi)的(de)(de)(de)一組(zu)引(yin)物對在如seq?id?no:14所示(shi)的(de)(de)(de)grna?scaffold片段為模板(ban)擴出sgrnagfp序列，隨后通(tong)過融合(he)pcr進(jin)行兩(liang)輪擴增，將5srrna啟動子片段與sgrnagfp片段進(jin)行融合(he)。

6.如權利(li)要求1所(suo)述的同時提高鐮刀菌(jun)菌(jun)絲體蛋(dan)白和甜菜(cai)紅素(su)產(chan)量的方法，其特征在于，所(suo)述液體培(pei)養基(ji)包(bao)含如下組分：葡(pu)萄糖40g/l，酵母粉0.5g/l，硫(liu)(liu)酸(suan)銨12g/l，硫(liu)(liu)酸(suan)鎂1.5g/l，氯化(hua)鉀0.7g/l，硫(liu)(liu)酸(suan)鈉0.5g/l，磷酸(suan)二(er)氫(qing)鉀2g/l和碳酸(suan)鈣(gai)0.5/l?g。

7.如(ru)權利要求1所(suo)述(shu)的同時提高鐮刀菌菌絲(si)體蛋白和甜菜紅素(su)產量的方法，其特征在于(yu)，將所(suo)述(shu)新的鐮刀菌接種于(yu)液體培養基(ji)中(zhong)進行培養的方法包括：

技術總結
本發明公開了一種同時提高鐮刀菌菌絲體蛋白和甜菜紅素產量的方法，包括如下步驟：將負載有細胞色素P450酶基因片段、多巴4，5?雙加氧酶基因片段和葡糖基轉移酶基因片段的超量表達載體轉化入鐮刀菌體內，得到新的鐮刀菌，其中，細胞色素P450酶基因片段、多巴4，5?雙加氧酶基因片段和葡糖基轉移酶基因片段被構建為連鎖基因；將新的鐮刀菌接種于液體培養基中進行培養，分別獲取發酵液和菌體，并從發酵液中收獲甜菜紅素，從菌體中收獲菌絲體蛋白。本發明通過在威尼斯鐮刀菌中定向過表達甜菜紅素合成基因RUBY，獲得高效合成甜菜紅素的威尼斯鐮刀菌菌株，達到菌株菌絲體蛋白生產時提高綜合經濟效益的目的。

技術研發人員：李德茂,童勝,王欽宏,洪如如,陳吳西,柴夢丹
受保護的技術使用者：中國科學院天津工業生物技術研究所
技術研發日：
技術公布日：2024/9/19