本發明涉及一種檢(jian)測(ce)技(ji)術，尤其是結合(he)分枝桿菌的檢(jian)測(ce)，屬于(yu)微(wei)生物檢(jian)驗。

背景技術：

1、結核(he)分枝桿菌(mycobacterium?tuberculosis)是引起結核(he)病(bing)的(de)(de)(de)(de)病(bing)原體之(zhi)一，是一種革蘭氏陽性(xing)的(de)(de)(de)(de)桿狀細菌。結核(he)分枝桿菌的(de)(de)(de)(de)幾(ji)個(ge)基(ji)(ji)因(yin)和(he)基(ji)(ji)因(yin)組區域的(de)(de)(de)(de)突變(bian)參(can)(can)與(yu)了對(dui)inh的(de)(de)(de)(de)抗(kang)性(xing)。據報(bao)道，至(zhi)少有四個(ge)不(bu)(bu)同的(de)(de)(de)(de)基(ji)(ji)因(yin)位(wei)點發生突變(bian)，包括編碼(ma)過(guo)氧(yang)化(hua)氫酶-過(guo)氧(yang)化(hua)物酶的(de)(de)(de)(de)katg、參(can)(can)與(yu)脂肪(fang)酸延(yan)(yan)伸的(de)(de)(de)(de)inha、編碼(ma)烷(wan)基(ji)(ji)氫過(guo)氧(yang)化(hua)物還原酶的(de)(de)(de)(de)ahpc和(he)參(can)(can)與(yu)氧(yang)化(hua)應(ying)激調(diao)節的(de)(de)(de)(de)oxyr。盡管存在這種復雜性(xing)，但katg315是與(yu)inh耐藥(yao)相(xiang)關的(de)(de)(de)(de)最常見突變(bian)位(wei)點(30-90％)。此外，據報(bao)道，由于該密碼(ma)子突變(bian)而(er)產生的(de)(de)(de)(de)耐藥(yao)菌株具(ju)有有效(xiao)的(de)(de)(de)(de)傳染(ran)性(xing)。如果不(bu)(bu)及時發現和(he)治(zhi)療，易導致傳染(ran)鏈的(de)(de)(de)(de)延(yan)(yan)續和(he)蔓延(yan)(yan)。通過(guo)對(dui)katg基(ji)(ji)因(yin)突變(bian)的(de)(de)(de)(de)檢測，可以早期發現患者，采取相(xiang)應(ying)的(de)(de)(de)(de)感染(ran)控制和(he)防治(zhi)措施，從而(er)減少傳播(bo)的(de)(de)(de)(de)風險。因(yin)此對(dui)結核(he)分支(zhi)桿菌的(de)(de)(de)(de)katg基(ji)(ji)因(yin)的(de)(de)(de)(de)突變(bian)診斷顯(xian)得尤為重(zhong)要(yao)。

2、目前對對結核(he)分枝桿(gan)菌的(de)(de)(de)檢(jian)測(ce)方法包括培養和(he)藥敏(min)(min)試(shi)驗，pcr檢(jian)測(ce)，dna測(ce)序，maldi-tof?ms技術等，這(zhe)些(xie)方法很難做(zuo)到對基(ji)因單(dan)堿基(ji)突變的(de)(de)(de)檢(jian)測(ce)，存在誤檢(jian)，漏檢(jian)的(de)(de)(de)情(qing)況，并且由于結核(he)分枝桿(gan)菌的(de)(de)(de)katg基(ji)因突變具有多種類型(xing)，傳統的(de)(de)(de)檢(jian)測(ce)方法很難做(zuo)到對katg基(ji)因快速準確的(de)(de)(de)檢(jian)測(ce),很難做(zuo)到對katg基(ji)因突變和(he)野(ye)生型(xing)結核(he)分枝桿(gan)菌的(de)(de)(de)快速鑒定。因此，建立靈敏(min)(min)、特(te)異(yi)、易用、快速、無需大(da)型(xing)設備即可實現(xian)的(de)(de)(de)檢(jian)測(ce)方法對于結核(he)分枝桿(gan)菌的(de)(de)(de)katg基(ji)因的(de)(de)(de)檢(jian)測(ce)十分必要。

3、重(zhong)組酶聚合酶擴增(zeng)(recombinase?polymerase?amplification,rpa)技術(shu)的原理是重(zhong)組酶與特異性dna引物結(jie)合識(shi)別靶標dna,在(zai)單鏈dna結(jie)合蛋白和dna聚合酶作用(yong)下發(fa)生(sheng)鏈置換,恒(heng)溫條件下大量擴增(zeng)核酸產(chan)物，本發(fa)明對rpa技術(shu)加以(yi)改良，在(zai)正向(xiang)引物的5’的端(duan)加上t7啟(qi)動(dong)子序列，在(zai)反(fan)應體系中加入t7rna聚合酶，在(zai)擴增(zeng)的同時將dna轉錄為rna，以(yi)便后續的crispr反(fan)應中能夠被cas13a識(shi)別并剪切。

4、近年來發(fa)明的(de)(de)(de)crispr/cas技(ji)術具有(you)(you)強(qiang)大的(de)(de)(de)基(ji)因(yin)編輯能(neng)力(li)，其(qi)中(zhong)cas13a等蛋白被發(fa)現可(ke)(ke)(ke)以用于核(he)酸檢(jian)(jian)測(ce)(ce)。由(you)這些cas蛋白與crrna形成的(de)(de)(de)復合(he)物在特(te)異(yi)識別靶(ba)標基(ji)因(yin)后，可(ke)(ke)(ke)以激活(huo)單(dan)(dan)鏈dna或rna切(qie)割(ge)活(huo)性(xing)，在反(fan)應(ying)(ying)體(ti)系(xi)中(zhong)引入熒(ying)光(guang)(guang)-淬滅基(ji)團修飾(shi)的(de)(de)(de)單(dan)(dan)鏈報告dna或rna分子，其(qi)被cas酶切(qie)割(ge)后可(ke)(ke)(ke)以通過(guo)儀器檢(jian)(jian)測(ce)(ce)到(dao)熒(ying)光(guang)(guang)信號。本發(fa)明中(zhong)采用cas13a，并(bing)依據其(qi)識別剪切(qie)rna的(de)(de)(de)特(te)性(xing)，設(she)(she)計出具有(you)(you)特(te)異(yi)性(xing)的(de)(de)(de)rna熒(ying)光(guang)(guang)報告分子，本發(fa)明中(zhong)針對katg基(ji)因(yin)突(tu)變(bian)多樣性(xing)的(de)(de)(de)特(te)點(dian)(dian)，設(she)(she)計多條檢(jian)(jian)測(ce)(ce)不同類型突(tu)變(bian)katg基(ji)因(yin)的(de)(de)(de)crrna，使得一(yi)(yi)次(ci)反(fan)應(ying)(ying)同時檢(jian)(jian)測(ce)(ce)多個位點(dian)(dian)，在一(yi)(yi)次(ci)反(fan)應(ying)(ying)中(zhong)便能(neng)檢(jian)(jian)測(ce)(ce)出katg基(ji)因(yin)是(shi)否突(tu)變(bian)，并(bing)且這些特(te)殊設(she)(she)計的(de)(de)(de)crrna具有(you)(you)極強(qiang)的(de)(de)(de)特(te)異(yi)性(xing)和靈(ling)敏度，能(neng)夠做(zuo)到(dao)對katg基(ji)因(yin)單(dan)(dan)堿基(ji)突(tu)變(bian)的(de)(de)(de)檢(jian)(jian)測(ce)(ce)。

技術實現思路

1、本發明的(de)具體原理是：利用(yong)rpa反應(ying)對(dui)樣本核酸(suan)進行(xing)(xing)擴增，利用(yong)t7?rna聚(ju)合酶進行(xing)(xing)轉錄，當其(qi)中任意一種crrna識(shi)別到了katg突(tu)變，便會(hui)引導(dao)cas13a蛋白對(dui)其(qi)序(xu)(xu)列進行(xing)(xing)酶切并(bing)激(ji)發其(qi)反式(shi)切割(ge)活性，切割(ge)體系中的(de)熒(ying)光報告分子，最(zui)后(hou)根據分子探針相(xiang)對(dui)于對(dui)照(zhao)組熒(ying)光強度的(de)強弱進行(xing)(xing)判別是否含有(you)目標序(xu)(xu)列。

2、本發明解決的技術(shu)問題是：

3、檢測特異(yi)性問(wen)題：結(jie)核(he)分(fen)(fen)枝(zhi)桿(gan)(gan)菌katg基(ji)因(yin)突(tu)(tu)變(bian)以單堿基(ji)突(tu)(tu)變(bian)為主，野生型結(jie)核(he)分(fen)(fen)枝(zhi)桿(gan)(gan)菌與katg基(ji)因(yin)突(tu)(tu)變(bian)的結(jie)核(he)分(fen)(fen)枝(zhi)桿(gan)(gan)菌的基(ji)因(yin)相似度(du)很高，傳統的pcr技術等方法(fa)很難(nan)做到(dao)對katg基(ji)因(yin)突(tu)(tu)變(bian)型結(jie)核(he)分(fen)(fen)枝(zhi)桿(gan)(gan)菌和野生型結(jie)核(he)分(fen)(fen)枝(zhi)桿(gan)(gan)菌的鑒別并且存在假(jia)陽性的問(wen)題。

4、檢測(ce)靈敏度(du)問題：結核分枝桿菌(jun)在體內的數量很少，傳統的檢測(ce)方(fang)法(fa)如抗酸桿菌(jun)染色和培(pei)養(yang)的靈敏度(du)較(jiao)低(di)，無法(fa)檢測(ce)到低(di)濃度(du)的病原體。

5、檢(jian)(jian)測(ce)多樣性的問題：katg基因突變(bian)具有多樣性的特點，突變(bian)類型(xing)高達(da)七(qi)種(zhong)，傳統檢(jian)(jian)測(ce)方(fang)法很(hen)難在一次檢(jian)(jian)測(ce)中(zhong)對(dui)(dui)七(qi)種(zhong)類型(xing)進行同時檢(jian)(jian)測(ce)，需(xu)要多次檢(jian)(jian)測(ce)才能達(da)到(dao)對(dui)(dui)katg基因突變(bian)型(xing)結(jie)核分(fen)枝桿(gan)菌和野生型(xing)結(jie)核分(fen)枝桿(gan)菌的鑒別。

6、氣溶膠(jiao)污(wu)染問題：由于當前的分子(zi)診斷技(ji)術在檢測時需要多次加(jia)樣等問題需要打開樣本管，會造成氣溶膠(jiao)污(wu)染，從而導致檢測結果的不準確性。

7、為了解(jie)決上(shang)述問(wen)題(ti)(ti)，本(ben)發明(ming)提(ti)(ti)(ti)出的(de)(de)技(ji)術(shu)方(fang)案是：提(ti)(ti)(ti)供一種katg基(ji)因突(tu)變(bian)結核桿菌(jun)(jun)的(de)(de)rpa-crispr的(de)(de)一鍋(guo)式檢(jian)(jian)測(ce)方(fang)法，將rpa技(ji)術(shu)和crispr/cas13a技(ji)術(shu)結合，rpa擴(kuo)增技(ji)術(shu)能(neng)夠解(jie)決檢(jian)(jian)測(ce)結核分枝桿菌(jun)(jun)的(de)(de)在(zai)體內(nei)含量少的(de)(de)問(wen)題(ti)(ti)，提(ti)(ti)(ti)高(gao)檢(jian)(jian)測(ce)的(de)(de)靈敏度，crispr/cas13a技(ji)術(shu)能(neng)夠解(jie)決基(ji)因相似的(de)(de)問(wen)題(ti)(ti)，提(ti)(ti)(ti)高(gao)檢(jian)(jian)測(ce)的(de)(de)特異(yi)性，并針對(dui)katg基(ji)因突(tu)變(bian)多(duo)樣性的(de)(de)特點(dian)，設計多(duo)條(tiao)crrna，使得(de)一次(ci)(ci)反應同(tong)時檢(jian)(jian)測(ce)多(duo)個位點(dian)，在(zai)一次(ci)(ci)反應中(zhong)(zhong)便能(neng)檢(jian)(jian)測(ce)出katg基(ji)因是否突(tu)變(bian)，同(tong)時采用一鍋(guo)式方(fang)法，在(zai)檢(jian)(jian)測(ce)過(guo)程(cheng)中(zhong)(zhong)僅需打開一次(ci)(ci)樣本(ben)管便可完成檢(jian)(jian)測(ce)，減少了與空氣的(de)(de)接觸，避免了氣溶膠污染。

8、本發明的(de)第一方面，提供一種引物組，包(bao)括(kuo)對靶基因katg進行rpa擴增的(de)引物對，以及crispr反應的(de)引導(dao)rna和分子探(tan)針ssrna。

9、一種(zhong)用于katg突變(bian)檢(jian)測(ce)的(de)檢(jian)測(ce)試劑盒，包括反(fan)(fan)應體系預混(hun)液；所(suo)述反(fan)(fan)應體系預混(hun)液包括500nm用于rpa擴增的(de)正向(xiang)引(yin)物(wu)rpa-f和反(fan)(fan)向(xiang)引(yin)物(wu)rpa-r，500nm?ssrna報告分子(zi)、1xt7?rna聚合酶(mei)，1xlwacas13a，各(ge)200nm多種(zhong)crrna，1x?rcutsmart緩沖液、1mm?ntp?mix、1u/μl重組rna酶(mei)抑制劑、1×rpa補液緩沖液、1×rpabasic?e-mix、14mm?mgoac。

10、優選的(de)，所述多種(zhong)crrna為(wei)針對不同類型的(de)結核分枝(zhi)桿(gan)菌(jun)katg基(ji)因(yin)設(she)計(ji)全(quan)面覆蓋的(de)特(te)異性錯配(pei)crrna，突變類型包(bao)括s315r，s315l，s315t，s315n，s315i，s315t，其中s315r和s135t分為(wei)a，b兩種(zhong)類型，能夠在一次(ci)反應(ying)中檢(jian)測(ce)出結核分枝(zhi)桿(gan)菌(jun)的(de)katg基(ji)因(yin)有無(wu)突變；所述crrna引(yin)物(wu)為(wei)序列表中seq?no.1、seq?id?no.2、seq?id?no.3、seq?no.4、seq?no.5、seqid?no.6、seq?id?no.7。

11、優選的(de)(de)，所述rpa引物(wu)的(de)(de)序列為序列表(biao)中(zhong)seq?id?no.8、seq?id?no.9，該引物(wu)在(zai)(zai)常規rpa引物(wu)的(de)(de)基礎上在(zai)(zai)5’端加入t7啟動子序列，以(yi)(yi)便在(zai)(zai)在(zai)(zai)擴增的(de)(de)同時，利用(yong)t7?rna聚(ju)合(he)酶將樣本dna轉錄(lu)為rna，以(yi)(yi)被crispr/cas13a識(shi)別并反式剪切ssrna報(bao)告分子。

12、優選的(de)(de)，所述ssrna報告分(fen)(fen)(fen)子(zi)為兩(liang)端分(fen)(fen)(fen)別修飾有熒(ying)光基(ji)團(tuan)fam和猝滅基(ji)團(tuan)bhq1的(de)(de)單鏈(lian)rna，序列為：fam-uuuuu-bhq1，該報告分(fen)(fen)(fen)子(zi)在檢測出不(bu)(bu)同類型的(de)(de)katg基(ji)因(yin)(yin)突(tu)變結核(he)分(fen)(fen)(fen)枝桿(gan)(gan)菌時(shi)，均能發出熒(ying)光信號，在檢測野生(sheng)型結核(he)分(fen)(fen)(fen)枝桿(gan)(gan)菌時(shi)不(bu)(bu)發出熒(ying)光信號，從(cong)而達到一次反應鑒別結核(he)分(fen)(fen)(fen)枝桿(gan)(gan)菌katg基(ji)因(yin)(yin)有無突(tu)變的(de)(de)目的(de)(de)。

13、本發明的(de)(de)第二方(fang)(fang)面，提供一(yi)種(zhong)檢(jian)測(ce)結核分枝桿菌(jun)katg基因是否(fou)突(tu)變的(de)(de)一(yi)種(zhong)檢(jian)測(ce)方(fang)(fang)法(fa)，包括以下步驟：

14、(1)提取待測樣(yang)本中的核(he)酸，提取液(ye)作為rpa-crispr反應(ying)的模板(ban)；

15、(2)首先將待測(ce)樣品與試劑配制成(cheng)核(he)酸檢測(ce)的反(fan)應(ying)體系，置(zhi)于反(fan)應(ying)容(rong)器中(zhong).

16、(3)將反應容器(qi)置于為37℃的恒溫裝(zhuang)置中(zhong)，反應20-40min

17、(4)將反(fan)應(ying)容(rong)器取出放置在熒光(guang)檢測裝置中，檢測反(fan)應(ying)溶液的熒光(guang)情況

18、(5)每隔1分(fen)(fen)(fen)鐘在波長465-510nm采集fam熒(ying)(ying)光(guang)信號，通過觀察fam熒(ying)(ying)光(guang)情況，來確定待(dai)測樣(yang)本的(de)類型(xing)，若為(wei)綠色熒(ying)(ying)光(guang)且與陰(yin)(yin)性對照(zhao)相比(bi)(bi)有(you)顯(xian)著(zhu)(zhu)差異則(ze)(ze)判(pan)斷rpa產物中含有(you)katg基(ji)因突(tu)變結(jie)(jie)核(he)(he)分(fen)(fen)(fen)枝桿菌(jun)的(de)的(de)特異性擴增產物，該樣(yang)本為(wei)katg基(ji)因突(tu)變型(xing)結(jie)(jie)核(he)(he)分(fen)(fen)(fen)枝桿菌(jun)，若不(bu)發光(guang)且熒(ying)(ying)光(guang)值與陰(yin)(yin)性對照(zhao)相比(bi)(bi)沒有(you)顯(xian)著(zhu)(zhu)差異，則(ze)(ze)判(pan)斷rpa產物中不(bu)含有(you)katg基(ji)因突(tu)變結(jie)(jie)核(he)(he)分(fen)(fen)(fen)枝桿菌(jun)的(de)特異性擴增產物，該檢測樣(yang)本為(wei)katg基(ji)因正常型(xing)結(jie)(jie)核(he)(he)分(fen)(fen)(fen)枝桿菌(jun)。

19、優選地，步驟(zou)(2)中rpa-crispr預混液(ye)具體(ti)為500nm用于rpa擴增的正向(xiang)引物(wu)rpa-f和反向(xiang)引物(wu)rpa-r，500nm?ssrna報告分子、1x?t7?rna聚合(he)酶(mei)，1x?lwacas13a，各200nm多(duo)種(zhong)crrna，1xrcutsmart緩沖液(ye)、1mm?ntp?mix、1u/μl重(zhong)組(zu)rna酶(mei)抑制劑、1×rpa補液(ye)緩沖液(ye)、1×rpa?basic?e-mix、14mm?mgoac。

20、有益效果：

21、將rpa技(ji)術(shu)和crispr技(ji)術(shu)相結合的(de)(de)檢(jian)(jian)測(ce)(ce)方法(fa)，使擴增檢(jian)(jian)測(ce)(ce)同(tong)步進行(xing)，大(da)(da)大(da)(da)減少(shao)檢(jian)(jian)測(ce)(ce)的(de)(de)時間，同(tong)時針對katg基因(yin)多種突變(bian)的(de)(de)特(te)點，設計多種crrna，使得一次反(fan)應(ying)同(tong)時檢(jian)(jian)測(ce)(ce)多個位點，在一次反(fan)應(ying)中(zhong)便能(neng)檢(jian)(jian)測(ce)(ce)出katg基因(yin)是否突變(bian)，同(tong)時優化了預混液(ye)的(de)(de)檢(jian)(jian)測(ce)(ce)體系(xi)，使用(yong)crispr檢(jian)(jian)測(ce)(ce)技(ji)術(shu)極(ji)大(da)(da)的(de)(de)了提(ti)高檢(jian)(jian)測(ce)(ce)靈敏度和特(te)異度，避(bi)免了誤檢(jian)(jian)，漏檢(jian)(jian)的(de)(de)情(qing)況，便于醫生更好的(de)(de)為(wei)患者治療，對檢(jian)(jian)測(ce)(ce)設備等應(ying)用(yong)場(chang)景要(yao)求減低，簡化操(cao)作步驟(zou)，不在需要(yao)專業人員(yuan)，使得結核分枝(zhi)桿(gan)菌的(de)(de)檢(jian)(jian)測(ce)(ce)更易(yi)推廣。從而提(ti)高結核病的(de)(de)治愈率。