專利名稱：：重組犬2型腺病毒轉移載體、其構建方法及應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種重組病毒轉移載體，尤其涉及一種重組犬2型腺病毒轉移載體、其構建方法及應用，屬于基因工程領域。
背景技術：
：E3區是腺病毒體外復制的非必需區，在E3區插入外源基因不影響病毒的生長特性，常被用于克隆外源基因的區域。人與動物腺病毒中，除羊腺病毒外(Vrati等，1995)E3區都位于腺病毒基因組L4區的pVIII蛋白基因和L5區纖維蛋白基因之間，但各種腺病毒基因組大小不同，其E3區的起始位點也有差別。E完整的腺病毒E3區含有912個開放閱讀框架(ORF)，其中7個編碼產物已在感染細胞中確定，分別為E3—12.5K、E3—6.7K、E3一gpl9K、E3—11.6K、E3—10.4k、E3—14.5K、E3—14.7K。除了E3—12.5K(Dimitriove"厶1997;Tollefsone"厶1996)。CAV-1和CAV-2的E3區結構均為部分缺失，CAV-1的E3區比CAV-2少約500bp。CAV-2的E3區編碼13.3kDa和40.7kDa的兩個蛋白，但具體功能尚不清楚，其兩側分別為PVIII蛋白基因和纖維蛋白基因，二者所編碼的蛋白均與病毒的毒力密切相關，是構建E3區缺失載體不可缺少的部分。腺病毒基因組含有早期轉錄基因(El-E4)和晚期轉錄基因(LI-L5)，E1-E4區與病毒復制、病毒代謝調節有關。El、E3和E4上游區都是外源基因主要的插入部位。El區缺失的腺病毒雖然可使外源基因高效表達，但它是復制缺陷型的，不能在人和動物體內生長和繁殖，是在構建基因治療性表達載體時最常用的外源基因插入部位。E4上游區存在一個轉錄沉默區，在該區域插入外源基因不影響病毒的復制，但插入的容量受到限制。E3區是腺病毒的體外復制非必需區，在E3區(或缺失部分E3區序列)插入外源基因構建的腺病毒載體為非依賴，可Si制性載體，這種載體在體內各器宮及細胞中能自主復制和表達外源苯因，被廣泛應用r蛋rr持性研究、診斷抗原和亞單位疫苗及重組活載體疫苗的制備。重組腺病毒載體疫苗作為一種新型疫苗，在各種人和動物病毒病、細菌病和寄生蟲病的免疫預防中進行了大量的研究。目前在人病毒病的重組腺病毒載體疫苗研究中，已進行研究的病原主要有人/猿免疫缺陷病病毒(H咖an/Simiani誦unodeficiencyvirus，HIV/SIV)、狂犬病病毒(Rabiesvirus,RV)，丙型肝炎病毒(泡pa&'&'sCw'r"s，HCV)、乙型肝炎病毒(H印atitisBvirus，HBV)、SARS冠狀病毒(SARS-coronavirus)、麻疹病毒(j/譜7esW潛)(Putze"厶2003)、登革病毒(Denguevirus)、巨細胞瘤病毒(Cytomegalovirus,CMV)(Shanleyeta厶2005)、EB病毒(Epstein-Barrvirus,EBV)、埃博拉病毒(Ebolavirus)等，重組腺病毒均可有效的表達上述病毒的抗原基因，在實驗動物和非人靈長類動物體進行的免疫試驗表明，可以刺激產生特異性的細胞免疫和體液免疫反應，其中HIV重組腺病毒載體疫苗已在人體進行了免疫試驗(Robinson"a厶2002)。在利用重組腺病毒表達人瘧原蟲(malaria)CS抗原蛋白進行免疫研究中證明，其免疫效果甚至比放射孢子體的免疫效果還要好(Bruna-Romero"s厶2004)。在動物疫病的腺病毒活載體疫苗的研究中HAd5型復制缺陷型的腺病毒載體是最常應用的。用表達偽狂犬病毒gD糖蛋白的重組痘病毒和重組腺病毒載體疫苗進行對比試驗，證明腺病毒在刺激特異性抗體應答和免疫保護方面要好于痘病毒(Gonin"si，1996)，并且可以多途徑進行免疫，說明人腺病毒HAd5具有較廣泛的細胞嗜性。而CAV-2的基本結構與人腺病毒相類似，具有人腺病毒的優點。且CAV-2只能感染犬，導致呼吸道疾病和腹瀉，對人類及其它動物不具感染性和致病性，作為活病毒載體研制雙價或多價疫苗有著明顯的優勢。從理論上講，重組腺病毒核衣殼DNA的容量只有野生型腺病毒DNA的105%，即基因組大小為31323bp的CAV-2容納外源基因的最火限度僅為1560bp左右。在腺病毒早期研究中，人們發現腺病毒復制和包裝所必需的順式作用元件僅在病毒基因組兩端，即反向末端重復序列和包裝信號所在，加起來長度不到1kb。這部分順式作用元件稱為病毒的最基本結構，除此之外的病^基閃組都可以被置換，其功能可用異位作用來補fg。腺病毒載體的構建策略通常為通過缺失基因組的部分區域而擴大禎入外源某因容量，E3區是腺病毒的基因組中最大的復制非必需區，因此在E3區(或缺失部分E3區序列)插入外源基因構建非依賴型可復制性重組活載體具有重大的研究價值和應用前景。插入E3區的外源基因的轉錄受E3啟動子或腺病毒MLP控制，一般不需要再加基因表達調控元件，且插入的外源基因與E3區和晚期轉錄同向，即從左向右才能高效表達。Johnson等(1988)在E3區構建了SV40啟動子控制下的HSVgB蛋白表達載體，在人源細胞系上感染重組病毒后1260h都能表達gB。轉錄分析發現gB基因直接受MLP和E3啟動子控制，而SV40啟動子被作為內含子，在RNA加工時被剪切掉。Zakhartchouk等(1998)構建了缺失完整E3區的BAV3病毒，將不含外源性啟動子的全長或截短的朋V-l糖蛋白gD基因插入BAV3.E3d的E3區，并使之與E3區同向，感染MDBK細胞后24h，用SDS-PAGE開始檢測到gD的表達，且在感染MDBK細胞過程中一直持續表達。而在感染細胞中加入DNA合成抑制劑(AraC)時，gD的表達降低，說明gD的表達部分由病毒MLP和E3啟動子控制。與上述研究結果不同的是，Reddy等(2002)[ps}首次將無任何調控序列的GFP基因分別插入PAV3不缺失E3區的SacI和Snagl位點，并使之與E3轉錄方向一致，但僅能得到GFP基因插入SnagI位點的病毒，這說明SacI位點所處的E30RF可能是病毒復制所需的。將無轉錄調控元件的PRVgD基因引入E3區缺失595bp的PAV3缺失E3區突變株后檢測到，gD的表達是一過性的，僅在感染后12h時能檢測到，說明該區域的表達是暫時調控的。Rasmussen等認為CAV-2如果完全缺失El和E3區，理論上可插入5.8kb的外源DNA片段，但E3可缺失的最大極限還不十分清楚(1990)，Fischer等(2002)分別缺失了CAV-2E3區684bp和1263bp，所構建的載體均能使外源基因獲得表達。邱微等(2003)構建了缺失E3區1370bp表達載體，但外源基因的表達需要有外源啟動子存在。
發明內容本發明首先所要解決的技術問題是克服現有技術的不足，提供一種新的重組犬2型腺病毒轉移載體，該重組犬2型腺病渴轉移載體能夠將犬2型腺病毒E3區最大限度的缺失，從而可以插入和表達大片段的外源基因。本發明首先所要解決的技術問題是通過以下技術方案來實現的-一種重組犬2型腺病毒轉移載體，該重組犬2型腺病毒轉移載體缺失了E3基因從24954bp到26360bp之間的片段，并且在所缺失的E3區片段位置插入hCMVIE啟動子、多克隆位點、增強型綠色熒光蛋白基因(EGFP)和SV40早期轉錄PolyA信號。作為一種最優選的方案，本發明所述的重組犬2型腺病毒轉移載體PUC-AE3-EGFP，其全基因序列為SEQIDN0:1所示。本發明重組犬2型腺病毒轉移載體對E3區進行了最大限度的缺失，即缺失了1412bp的E3區片段，使CAV-2E3區的容量增加到將近3kb，為了保證外源基因的有效表達，本發明載體在E3區啟動子的下游同向加入了hCMVIE啟動子，使外源基因同時受到兩個啟動子的控制。用本發明重組犬2型腺病毒轉移載體轉染CAV-2親本毒株感染的MDCK細胞，細胞病變后收取的病毒液經傳代仍能觀察到綠色熒光，證明所構建的轉移載體與親本CAV-2發生了同源重組。通過蝕斑篩選獲得了遺傳穩定表達綠色熒光蛋白的單一純化重組病毒克隆株rCAV-2AE3-EGFP，重組病毒rCAV-2AE3-EGFP，其微生物保藏號是CGMCCNO.2109，分類命名是表達EGFP缺失E3區的重組犬2型腺病毒(CanineAdeno-virusTypeII);保藏時間是2007年7月13日；保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏地址北京市海淀區中關村北一條13號，中國科學院微生物研究所。本發明對所獲得的重組病毒克隆株rCAV-2AE3-EGFP的生物學特性進行了分析，經鑒定該重組病毒生物學特性穩定，建立了表達外源基因的E3缺失重組CAV-2病毒表達系統及其克隆純化方法，為進一歩開展CAV-2活載體疫苗研制及相關基礎研究提供了技術平臺。本發明所要解決的另一個技術問題是提供一種構建上述重組犬2型腺病毒轉移載體PUC-AE3-EGFP的方法。本發明所要解決的另一個技術問題是通過以下技術方案來實現的一種構建匕述重組犬2型腺病4轉移載體PUC-AE3-EGFP的方法，包(1)制備含有犬2型腺病毒E3區及其側翼核苷酸序列的質粒pMD-E3;(2)以質粒pMD-E3為模板，以SEQIDN0:2和SEQIDN0:3為引物進行PCR擴增，得到犬2型腺病毒上游同源重組臂基因；以質粒pMD-E3為模板，以SEQIDN0:4和SEQIDNO:5為引物進行PCR擴增，得到犬2型腺病毒下游同源重組臂基因；(3)擴增后得到的犬2型腺病毒下游同源重組臂基因經《w71和歷V^III雙酶切與同樣處理的PUC18質粒連接，轉化感受態細胞(DH5a)，得到質粒puc-x;將所擴增得到上游同源重組臂基因與rac-x質粒同時進行EcoRI和KpnI雙酶切，將二者連接后缺失了兩同源重組臂之間的E3區序列，得到質粒PUC-AE3;(4)以pEGFP-Nl載體為模板，以SEQIDN0:6和SEQIDN0:6為引物進行PCR擴增，將擴增得到的產物與PUC-AE3質粒同時進行SpeI酶切后相連接，即得。對于E3區的缺失，本發明也采用了新的方法，現有技術中，一般需要通過多步PCR進行序列突變、酶切、連接用以缺失E3區。而本發明通過在所選擇的上、下游同源重組臂靠近缺失區域的一端引入相同的酶切位點，通過這兩個片段之間的連接缺失掉了中間的E3區，與現有技術相比，本發明方法極大的減少了工作量。為了篩選有外源基因插入的重組病毒，人們發展了與外源基因同時插入篩選標記基因的方法，常見的有抗生素基因、可提供病毒蝕斑顏色的報告基因等。報告基因的應用，大大減少了篩選病毒的工作量，但其中的報告基因又給重組疫苗的應用帶來許多弊端，如攜帶抗生素基因的重組病毒免疫動物很可能會使動物機體產生抗藥性；用攜帶大腸桿菌lacZ基因的重組病毒免疫動物也可能由于lacZ基因的表達而干擾重組病毒的免疫效果因為在自然界中的絕大多數動物體內都有抗大腸桿菌的免疫。EGFP報告基因近年來被廣泛用于體內外實驗研究(Gedesetal1996;Tsienetal1998)，表達的EGFP在紫外光激發下能發出綠色熒光，用熒光顯微鏡便可直接觀察到，方便檢測。另外EGFP可作為融合蛋白顯示目的蛋白的表達而不影響F1的蛋白的性質，對細胞也沒有毒性作用(Liuetal，1999)。CAV-2的E3區只有1521bp，盡管我們作了最大限度的缺失，但其包裝容量仍然有限，而源自質粒pEGFP-Nl的EGFP只有780bp，加上hCMVIE啟動子、MCS和SV40poly-A信號僅翻bp，這也是本發明選用EGFP作報告基因的主要原因。本發明將質粒pEGFP-Nl中所包括的各種表達元件按照與E3區轉錄相同的方向一并亞克隆至E3區缺失處，簡化了載體構建的過程。本發明成功構建了E3區缺失的重組CAV-2轉移載體并獲得了純化的含有EGFP報告基因的重組CAV-2毒株，對其克隆純化方法進行了優化，經鑒定該重組病毒生物學特性穩定，為進一步開展CAV-2活載體疫苗研制及相關基礎研究提供了技術平臺。圖1CAV-2的E3區及其側翼序列的擴增。圖2質粒pEGFP-Nl的物理圖譜。圖3本發明重組轉移載體PUC-AE3-EGFP的構建示意圖。圖4上、下游同源重組臂序列的擴增產物電泳圖譜；1.水對照；2.DL15000Marker;3.上游同源重組臂的PCR擴增結果；4.下游同源重組臂的PCR擴增結果。圖5含有hCMVIE、MCS、EGFP和SV40polyA信號的pEGFP-Nl部分片段的擴增；1.水對照；2.PCR擴增產物；3.DL2000Marker。圖6PUC-X的酶切鑒定；1.DL15000Marker;2.A^/I消化結果；3.歷/7din消化結果。圖7PUC-AE3的酶切鑒定；1.DL15000Marker;2.價fldIII消化結果；3.消化結果。圖8HindIII酶切篩選正向重組質粒；l.外源表達元件反向插入；2.外源表達元件正向插入；3.DL15000Marker。圖9pUC-AE3-EGFP轉染MDCK細胞24h后觀察到的瞬時表達(100X);A.EGFP在MDCK中的瞬時表達;B.MDCK細胞對照。圖10rCAV-2AE3-E(;FP在MDCK細胞上形成的蝕斑。圖11熒光顯微鏡下觀察到的r(AV-2AE3-EGFP在MDCK細胞h形成的蝕斑(100X)圖12重組病毒rCAV-2AE3-EGFP的純化(100X);A.EGFP在純化后rCAV-2AE3-EGFP中的表達；B.MDCK對照。圖13rCAV-2AE3-EGFP的PCR鑒定；1.引物EGFP-S/EGFP-X鑒定親本CAV-2;2.DL2000Marker;3.引物EGFP-S/EGFP-X鑒定rCAV-2AE3-EGFP;4.引物AE3-S/AE3-X鑒定rCAV-2AE3-EGFP;5.引物AE3-S/AE3-X鑒定CAV-2圖14rCAV-2AE3-EGFP在MDCK細胞上形成的細胞病變；l.rCAV-2AE3-EGFP形成的細胞病變；2.正常的MDCK細胞；3.親本CAV-2形成的細胞病變。圖15細胞培養上清液中的腺病毒樣顆粒。圖16rCAV-2AE3-EGFP的MDCK細胞生長曲線圖。圖17第1-15代rCAV-2AE3-EGFP的PCR鑒定；Al，B2，C5.引物AE3-S/AE3-X擴增rCAV-2AE3-EGFP;A2，Bl，C3.引物AE3-S/AE3-X擴增CAV-2;A3，B3,C4.DL15000Marker;A4，B4，B2.引物EGFP-S/EGFP-X擴增rCAV-2AE3-EGFP;A5，B5，C1.引物EGFP-S/EGFP-X擴增CAV-2。圖18EGFP在rCAV-2AE3-EGFP中表達的穩定性檢測(100X)。圖19試驗犬接種親本/重組病毒后病理變化的比較(40X)22。圖20CDVF基因的擴增；A:1.Fl基因的PCR擴增結果；2.DL2000Marker;3.陰性對照。B:1.F2基因的PCR擴增結果；2.陰性對照；3.DL2000Marker。圖21CDVH基因的擴增；1.H基因的PCR擴增結果；2.DL2000Marker;3.陰性對照。圖22pUC-AE3-F的酶切鑒定；1.DL15000Marker;2.A^II酶切結果(7550bp);3.5^ni/AWI酶切結果(5546bp+2004bp)。圖23pUC-AE3-H的酶切鑒定；1.DL15000Marker;2.勘7I1酶切結果(7430bp);3.^^n/7fofl酶切結果(5592bp+1838bp)。圖24rCAV-2AE3-F和rCAV-2AE3-H在MDCK細胞上形成的細胞病變(100X);A.rCAV-2AE3-F在MDCK上形成的CPE;B.rCAV-H在MDCK上形成的CPE:C.CAV-2在MDCKl.形成的CPE;D.正常的MDCK細胞。圖25重組病毒rCAV-2AE3-F和rCAV-2AE3-H的PCR鑒定；1.引物rF-U/rF-L擴增rCAV-2AE3-F的結果；2.引物EGFP-S/EGFP-X擴增rCAV-2AE3-F的結果；3.DL2000Marker;4.引物rH-U/rH-L擴增rCAV-2AE3-H的結果；5.引物EGFP-S/EGFP-X擴增rCAV-2AE3-H的結果。圖26重組病毒在MDCK細胞上的間接免疫熒光(100X);A.rCAV-2△E3-F;B.rCAV-2AE3-H;C.MDCK細胞。圖27rCAV-2AE3-F的Westernblot分析；1.蛋白分子量標準；2.rCAV-2AE3-F接種的MDCK細胞;3,CAV-2接種的MDCK細胞。圖28rCAV-2AE3-H的Westernblot分析；1.蛋白分子量標準；2.rCAV-2AE3-H接種的MDCK細胞；3.CAV-2接種的MDCK細胞。具體實施例方式以下通過具體實施方式對本發明進行進一步說明。這里想要指出的是，下面的具體實施方式僅用來說明本發明，本領域技術人員在理解本發明精神的前提下，可以根據本
技術領域：
的現有技術和公知知識對本發明進行相應變換，這些技術方案均落入本發明的范圍之內。實施例1重組質粒pMD-E3的構建1材料與方法細胞、病毒和菌種MDCK細胞由本實驗室傳代培養，培養基為含10。/。胎牛血清的DMEM;CAV-2疫苗株由哈爾濱獸醫研究所經濟動物研究室提供(說明本發明所用至IJCAV-2疫苗株也可按照下述義獻所公開的方法分離得到李六金等，犬腺病毒H型弱毒疫但株的分離、鑒定與篩選.肯海科技，2000年，6月，第7巻，增刊)，在MDCK細胞卜.增殖;受體菌DH5a由本實驗室保存。主要試劑PrimeSTARHSDNA聚合酶，rTaqDNA聚合酶、pMD18-Tvector，dNTP，IPTG，X-Gal均購自TaKaRa公司。DMEM購自GIBCO—BRL公司，胎牛血清購自天津灝洋生物公司。膠回收試劑盒(GelExtractionMiniKit)購自上海華舜生物工程有限公司，其它試劑為進口或國內分析純產品。1.3病毒擴增以O.25%胰蛋白酶+0.02。/。EDTA常規方法消化MDCK細胞，用含10%胎牛血清的DMEM37。C靜置培養，待細胞長滿單層后，換成含2y。胎牛血清的DMEM維持液，并按培養液量的P/o接入CAV-2種毒，培養至80%的細胞出現病變時，收取細胞及維持液，將其反復凍融3次后，-7(TC凍存備用。1.4引物參照GenBank中犬2型腺病毒TorontoA26/61株的全基因序列，利用01igo6.0設計一對引物，PCR擴增產物位于基因組2435828152位，包括了E3區及其上游的pVffl基因和下游的部分fiber基因在內的側翼序列。引物序列如下CAV-2U5，TTTGTCAGGACAACCACCAGACAAGGCAC3，CAV-2L5'GTTTTAAACAGGGTACCTCCGCTTAGTCT3'1.5病毒基因組的提取用SDS-蛋白酶K裂解法提取病毒DNA。收獲的細胞培養物12000rpm離心5分鐘，吸取上清液437.于1.5inlEP管中，然后加入20mg/nil的蛋白酶K12.5W，10%SDS5(M(蛋f:i酶K使用濃度為500化7ml，SDS使用濃度為1%)，輕輕混勻，55°C30min水浴后分別用等體枳的酚/氯仿和氯仿各抽提一次，上層水相用1/10體積的3MNaAC(pH5.2)、2倍體積的冷乙醇沉淀，-20。C放置lh，4°C12000r/min離心15min，上清用75%乙醇洗滌，沉淀干燥后用適量TE重懸，-20。C保存。1.6目的基因的擴增.以上述提取的CAV-2基因組為模板，擴增E3區及其側翼序列。50ul反應體系依次加入5倍PrimeSTARBuffer(Mg2+Plus)10ul、PrimeSTARHSDNAPolymerase1.25U、CAV-2U+CAV-2L(10mM)2ul、dNTP(各2.5raM)4u1、模板1u1。同時設立MDCK細胞腦A和無DNA水對照。循環參數為95。C預熱2min，98°C10S，68°C4min，30個循環，72。C延伸20min。反應結束后在PCR管中加入0.5u1r7agDNA聚合酶和0.5u12.5mM的d-ATP，72。C延伸30min，取5ulPCR產物經0.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。提取CAV-2基因組DNA，用特異性引物經PCR擴增后，得到的目的片段與預期大小一致(圖1)。1.7與pMD18-T的連接PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，用華舜小量膠回收試劑盒回收目的片段與pMD18-T載體連接。反應體系為TargetDNA4.5ul;pMD18-TVector0.5ul;2XligationBuffer5ul，16°C連接lh。1.8火腸桿菌感受態細胞的制備用TSS(TransformationandStorageSolution)法制備E.coliDH5a感受態細胞。以無菌接種環取凍存的E.coHDH5a菌種劃線接種于不加抗生尜LB瓊脂平板匕問時在含有抗性的培養基上劃線作對照，37t:過夜培養。次日挑取生長fe好的單個菌落，于含3mLLB培養^的試管中37°C振搖過夜培養。將培養物按1:100接種于200mLLB培養基中37。C振搖培養約3h，至對數生長期。將培養物無菌分裝于50mL離心管中，1000g4°C離心lOmin棄上清，沉淀用原始培養體積10%的冰預冷的無菌1XTSS溶液(配制方法見附錄)重懸，輕輕混勻(冰上操作)。用1.5mL離心管分裝感受態細胞，100叱/管，-70匸保存備用。1.9轉化取10"1連接產物加入100ii1自制的DH-5a感受態細胞中，輕輕混勻后冰浴30rain，42。C熱休克90秒后立即置于冰浴中2min,然后加入800u1S0C液體培養基，于37。C振蕩培養45min。取100yl培養物涂布于含有IPTG、X-gal和Amp+的LB瓊脂板上，37"C培養過夜。1.10堿裂解法小量提取質粒DNA挑取生長于LB培養基平板上的數個白色菌落，接種于裝有35mL含有氨芐青霉素的LB培養液中，37'C振搖過夜培養。取1.5mL培養物于1.5raLEP管中，腦Or/min離心lmin倒扣于吸水紙上待液體流盡，加入鮮L溶液I，徹底重懸；緩緩加入200叱新配制的溶液n，輕輕顛倒混勻35次，冰上放置不超過5min;加入150叱溶液ni，溫和顛倒混勻，冰上放置5min，12000r/min離心5min;取上清用等體積的飽和酚/氯仿、氯仿各抽提一次，取水相加入2倍體積的無水乙醇，室溫放置lOrnin，12000r/min離心5min;棄上清，沉淀用75。^的乙醇洗滌一次；離心棄上清，無菌干燥后沉淀溶于30WTE溶解，將初步鑒定為陽性的重組質粒命名為PMD-E3。1.11重組質粒的序列測定與分析將初歩鑒定為陽性菌送生物公司測序，對所測序列進行分析，并與TorontoA26/61強毒株進行同源性比較。對擴增的目的基因進行了測序，其核1^酸序列與預測的各0RF及其編碼的氨基酸序列見圖2(SEQIDN0.8)，各0RF在基因組中的相對位置見圖3。目的片段全長4614bp，該片段包括4個完整的開放閱讀框(ORF)，其中0RF1位于pVin基因內部，編碼224個氨基酸殘基。在600bp處，即距E3區起始位置的上游340bp發現一TATAbox,推測為E3區的上游啟動子序列所在的位置。E3區位于pVIl基因和fiber基因之間，即圖中8972401bp，全長1504bp，正向有2個0RF，即圖中0RF2和0RF3。0RF2編碼118個氨基酸殘基，與0RF1間有14bp重疊，0RF3編碼364個氨基酸殘基。0RF4是fiber蛋白基因的編碼框內部，本研究所克隆的fiber不完整。將該序列與GenBank中TorontoA26/61強毒株比較，發現二者只有7個堿基不同，分別在1968bp，2064bp，2089bp，2503bp，3162bp，3548bp，3702bp位置，核苷酸序列同源性高達99.81%。疫苗株與強毒TorontoA26/61E3區僅有2個堿基不同，且均為同義突變，所編碼的氨基酸不發生改變。將擴增得到的E3區及其側翼序列與TorontoA26/61強毒株進行了核苷酸序列的比較，發現二者的pvm基因核苷酸同源性為ioox，其余序列中共有7個堿基不同，其中5個堿基均分布在fiber基因編碼框內。在E3區的雖有2個突變堿基，但這兩個毒株E3區的氨基酸同源性為100X，這說明CAV-2E3區及其編碼的蛋白可能與病毒毒力的強弱無關，本實驗的結果為下一步構建E3缺失的CAV-2表達載體奠定了理論基礎。實施例2E3缺失重組犬2型腺病毒的構建及其生物學特性分析1材料和方法1.1病毒、載體及細胞CAV-2疫苗株、感受態細胞DH5a的來源同實施例l;pUC18載體購向大連寶生物工程公^;質粒pEGFP-Nl(物理閣譜見圖4)為Clontech公「d產品，帶有hCMV立即早期啟動了-、MCS、EGFP和SV40polyA信號。1.2主要試劑DMEM購自GIBCO—BRL公司；胎牛血清購自天津灝洋生物公司；PrimeSTARHSDNAPolymerase,dNTP，DNAMarker,T4DNA連接酶，限制性內切酶fcoyI、《p/7l和5^el等均購自大連寶生物工程公司；磷酸,丐轉染試齊U盒(CalciumPhosphateTtansfectionKit)購自Invitrogen公司；小量膠回收試劑盒購自上海華舜生物工程公司；六孔板購自Nunc公司，蛋白酶K購于Sigma公司，低熔點瓊脂糖購自Bio-rad公司。1.3E3缺失轉移載體的構建1.3.1E3區的缺失根據實施例1中對E3區及其側翼序列的核苷酸序列分析結果，分別選取2405024953bp及2636227238bp的序列作為轉移載體的上/下游同源重組臂，設計兩對引物，TS-U/TS-L用于擴增上游同源臂TX-U/TX-L用于擴增下游同源臂。在上游同源臂引物的兩端分別引入化oWI和I、5^el酶切位點，下游同源臂引物的兩端分別引入A^7l和^T7dlI酶切位點(序列中斜體部分)。TS-U:5'TTTGAATTCCAACCGCCTTTTTCCAAC3'(SEQIDNO.2)TS-L:5，TTTGGTACCACTAGTCCACCTGGTCCATGCTCTC3'(SEQIDNO.3)TX-U:5'TTCGGTACCACCCTCAGCCTTCTAAT3'(SEQIDNO.4)TX-L:5'TTT雄OTTTGGAAAGAGGCTCGTTGT3'(SEQIDNO.5)以質粒pMD-E3為模板，PrimeSTARHSDNAPolymerasePCR擴增上/下游同源重組臂基因。PCR反應參數為98°C10s，68。Clniin，30個循環。擴增后得到的下游同源臂U的片段經1和他./7dn雙酶切與同樣處理的pUC18質粒做以下體系的連接載體pUC180.5叱，F:I的基閃(PCR產物)3.7叱，10XTDNALigaseBuffer0.5W,，TDNAl,igase0.5叱。保溫瓶中16X:水浴，連接1小時，轉化感受態細胞DH5a，挑取單個克隆菌，提取質粒鑒定正確后命名為pUOX。上游同源臂目的片段與pUC-X質粒同時進行ibo7I和《如I雙酶切，將二者連接(方法同上)后缺失了兩同源重組臂之間的E3區序列，得到的質粒命名為的pUC-AE3。1.3.2轉移載體的構建根據pEGFP-Nl載體的核苷酸序列設計1對引物pE-U/pE-LpE-U:5'TTT釘縱CCGCCATGCATTAGTTATT3'(SEQIDNO.6)pE-L:5'TTT^C7^GTGCAGTGAAAAAAATGCTT3，(SEQIDNO.7)在上、下游引物的兩端同時引入了SpeI酶切位點(序列中劃線部分)這兩對引物可以擴增包括hCMVIE、MCS、EGFP、SV40早期轉錄PolyA終止信號等在內的1600bp的片段。反應參數為95°C5rain，94°C30s，55°C30s，72°C30s，共30個循環。將擴增得到的目片段與pUC-AE3質粒同時進行Spel酶切后相連接，通過酶切鑒定篩選出連接方向正確的質粒命名為pUC-AE3-EGFP，完成了E3缺失轉移載體的構建，構建過程見圖5。試驗結果以TS-U/TS-L為引物，以pMD-E3質粒為模板，擴增了兩個片段，與預期的上、下游同源臂大小一致(圖6)，測序結果正確后將下游、上游同源臂先后克隆于PUC18載體，利用TS-U和TS-L中共有的酶切位點A^/I將二者連接得到中間克隆載體PUC-AE3，以pE-U/pE-L為弓I物擴增質粒pEGFP-Nl得到了約1600bp片段(圖7)，與預期的包含有hCMV立即早期啟動子、MCS、EGFP和SV40早期轉錄polyA信號的目的片段大小相符，將該片段插入到PUC-AE3的&el酶切位點中，構建的重組質粒中含有3個附/oin酶切位點，若插入的方向為正，酶切應得到約為2830bp、1880bp及1450bp的3個片段；反向則為2830bp、1750bp及1580bp的3個片段，篩選正向連接的質粒經測序正確后命名為PUC-AE3-EGFP，即為E3區缺失的重組轉移載體。各中間產物及重組轉移載體的酶切鑒定結果見圖8，圖9，圖10。1.4中量法提取PUC-AE3-EGFP質粒并純化按Promega公司WziardPureFectionPlasmidDNAPurificationSystem試劑盒說明書進行。收集25ml細菌培養物，10，000g室溫離心10min，棄上清并用吸水紙吸盡殘液。加入1.25mlCellResuspensionSolution使細胞完全懸浮，然后再加入1.25mlCellLysisSolution,充分混勻后室溫作用5min，加入l.75mlNeutralizationSolution,立即顛倒6-8次混勻，10，000g室溫離心20min;將上清用0.45pm濾器過濾入新的離心管中，加入事先徹底混勻EndotoxinRemovalResin0.25ml，劇烈混勻后室溫靜止10min，期間間隔數秒混勻一次；將離心管放置在磁力棒上(Magnesi"MagneticS印arationUnit),輕輕搖動使樹脂完全吸附在管壁上，靜置30秒至溶液清晰后吸取上清至一新的離心管中；加入lral5raol/L的GuanidineThiocyanate，充分混勻后加入O.75mlMagnesilTMParamagneticParticles于管中，振蕩混勻后室溫作用2-3min，將管置于磁力棒上使顆粒吸附，溶液清晰并靜置30秒后，棄上清，將管從磁力棒上取下；加入lml4/10WashSolution振蕩重懸沉淀的顆粒，重復上述步驟，吸附棄上清；加入2.5ml80%的乙醇振蕩懸浮顆粒，吸附棄上清并重復洗滌三次；沉淀室溫干燥10min，用l.2ml滅菌去離子水重懸，劇烈振蕩10秒后，室溫靜置l分鐘，置于磁力棒上吸附后轉移上清到新的離心管中，加入O.5倍體積的7.5mol/L的醋酸納和2.5倍上述液體總體積的95%的乙醇，混勻后12000g室溫離心15min，棄去上清，用70%乙醇洗滌沉淀，12000g室溫離心5min,沉淀在無菌環境中自然干燥，加入200W滅菌去離子水重懸DNA，在紫外分光光度計檢測質粒濃度后一20。C保存備用。1.5CAV-2親本病毒PFU的測定空斑滴定法(Nickin，1999)測定病毒滴度將MDCK細胞傳代于24孔細胞培養板，培養至細胞長成單層，吸去培養液，用PBS洗細胞兩次；將試驗一中收取的CAV-2病毒液用無血清的畫EM培養液作10倍比稀釋，每孔接種200叱每稀釋度作4孔，37.r吸附lh后吸出禍毒液；將2%的低烙點瓊脂糖融化后降至4(TC左厶，。'車先在37。C預熱的2XDMEM(含4%胎牛血清，0.02%中性紅)等體積混和，緩慢注入24孔板中，厚度約為2mm平放至瓊脂凝固，置于37'C培養，待蝕斑出現后計數，計算病毒液中的病毒含量。滴度pfu/ml二plaquenumber/dilutionxvol咖e(ml)51.6重組質粒的轉染MDCK細胞經消化后接種于六孔板中，培養至長滿80%時，給細胞換成新鮮的培養液，每孔2ml，分別以105、1(f和107pFU的劑量感染親本CAV-2，2h后鈣轉染試劑轉染PUC-AE3-EGFP質粒每？L4ng，具體操作為分別準備兩個EP管，標為A、B，在A管內加入7.2MCacl和4ug質粒，加水補足60W，混勻。B管加入60W2XHBS。逐滴將A管內的液體加入B管，滴加同時用槍頭在B管從液面不斷向底部吹氣泡，直到液體完全混勻(液體內沒有肉眼可見的顆粒，晶瑩透亮為止)。將混合好的AB液室溫放置30min后加入已感染CAV-2的細胞中，輕輕晃動以混勻，置于37。CC02培養箱培養12h后將細胞內的液體吸出，加入10XDMS0(PBS溶解，pH7.2)，準確作用2.5min，加入新鮮的DMEM培養液。每隔24h在熒光顯微鏡下(Leica公司)觀察綠色熒光的表達及病變情況。當90X的細胞出現CPE，收獲細胞培養物反復凍融三次，超聲裂解，離心取上清一2(TC保存。在轉染時本發明采用的方法是CAV-2親本病毒先感染DK細胞再轉染重組質粒PUC-AE3-EGFP。這就需要用重組病毒進行多次純化用以去除親本CAV-2的污染。之所以采用這種方法是因為在本實驗中很難像構建重組人腺病毒那樣，用酶切過的病毒DNA和質粒DNA共轉染獲得重組病毒，其中原因首先是MDCK細胞不像293細胞那樣具有較高的轉染和重組效率，所用的CAV-2為致弱毒株，感染力及毒力均有減弱，其DNA的轉染能力自然不高。1.7重組病毒的篩選及純化將收獲的病毒液用含2%犢牛血清的DMEM稀釋后感染長滿^層的MDCK細胞，每隔12h監測熒光。選擇出現綠色熒光蛋白集中的位賞川lilW筆圈下，用細胞刮將圈外部分刮除，余下的細胞反復凍融后再次感染細胞，多次重復，直至在熒光顯微鏡下監測到被感染的大部分細胞中出現綠色熒光。待病變完全收取病毒液以無血清DMEM10倍比稀釋后感染MDCK細胞，吸附lh后棄去細胞表面液體，加入2mL2XDMEM(含有0.02%中性紅染液和4%血清)和2%低熔點瓊脂糖等體積混合凝膠，待出現明顯的蝕斑時，在熒光顯微鏡下觀察是否有綠色熒光出現。挑取有綠色熒光的蝕斑放入lmL無血清的DMEM培養液中，反復凍融3次后接種細胞進行新一輪的蝕斑純化，直至所有病毒蝕斑在均呈現綠色熒光為止。將純化到的重組病毒擴大培養，命名為rCAV-2AE3-EGFP。本發明用重組質粒轉染CAV-2親本病毒感染后的MDCK細胞病變后而用收獲的病毒液再次感染細胞則發現視野中僅有極少量的熒光。這說明親本病毒與PUC-AE3-EGFP質粒的在細胞內發生同源重組的效率并不高，我們所收獲的病毒大多為親本病毒，我們曾嘗試直接通過蝕斑篩選重組病毒，而事實證明這是很難辦到的，為了克服此難題，所采用的辦法是用記號筆將在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光聚集的位置各自圈在盡量小的范圍內，將余下的細胞刮除。用收獲的細胞培養物再次感染細胞，如此反復多次，直至被感染的大部分細胞在視野中均能呈現綠色熒光，則表示重組病毒已成為優勢病毒，這是再用蝕斑篩選重組病毒就很容易了。為了檢驗外源基因的表達是否穩定，本發明對13代的重組CAV-2作蝕斑鑒定，結果仍為陽性，熒光顯微鏡下觀察可見到EGFP的表達，證明EGFP在重組病毒中穩定表達，這對于重組病毒而言至關重要。若外源基因表達不穩定、在傳代過程中丟失，將直接影響到重組病毒作為活載體疫苗的可行性。pUC-AE3-EGFP經紫外分光光度計測定濃度為1.27Pg/叱，按每2化/mL的比例取純化的重組質粒pUC-AE3-EGFP轉染已被親本CAV-2感染的MDCK細胞，在熒光顯微鏡下觀察。轉染24h后即可觀察到瞬時表達的綠色熒光蛋白(圖12)，72h后可看到明顯的細胞病變，收取病變的細胞培養物，反復凍融3次后接種MDCK細胞，用含1。/。低熔點瓊脂糖的DMEM培養細胞爭:出現明顯的蝕斑吋(國13)，挑取在在炎光顯微鏡下M現綠色熒光的蝕斑(見圖14)進行下-輪的純化，用經過連續6次蝕斑純化的載組病毒接種MDCK細胞，24h后觀察到幾乎所有細胞均呈現綠色熒光(圖15)，且所形成的蝕斑均為綠色。1.8重組病毒的PCR鑒定在缺失的E3區內部以及EGFP的內部分別設計一對引物AE3-S/AE3-X;EGFP-S/EGFP-X。序列如下△E3-S5，GTATGCCCAAACCTGCAC3，△E3-X5，GCATTGCAGTGTCAGGTA3，EGFP-S5，CGACGTAAACGGCCACAAGTT3，EGFP-X5'ACTCCAGCAGGACCATGTGAT3'用重組病毒rCAV-2AE3-EGFP感染細胞，病變完全后收取細胞培養物，SDS-蛋白酶K法提取重組病毒的核酸DNA，用上述兩對引物做PCR鑒定。若不能擴出E3區缺失部分的基因，而EGFP的基因條帶特異而明顯，則表明已經純化完全。將篩選到的表達EGFP陽性的蝕斑在MDCK細胞上擴增后，提取重組病毒的核酸DNA，用E3區內部的引物AE3-S/AE3-X及EGFP上的引物EGFP-S/EGFP-X作為鑒定引物，用野生型的CAV-2作為對照，結果如圖15所示。用AE3-S/AE3-X為引物，擴增野生型的CAV-2的擴增的理論值應約為1300bp;以rCAV-2AE3-EGFP基因組為模板，用EGFP-S/EGFP-XPCR擴增片段大小理論值約為650bp。從圖中可知AE3-S/AE3-X只能擴出野生型的CAV-2的片段，而EGFP-S/EGFP-X只能擴出rCAV-2AE3-EGFP的片段(圖16)，且實際值與理論值相符，證明獲得了純化的單一克隆的rCAV-2AE3-EGFP。1.9重組病毒的生長特性及形態學的鑒定用經6代純化后篩選到的重組病毒感染MDCK細胞，觀察細胞所形成的病變。所收獲的細胞培養物超生波破碎后，離心取上清，磷鉤酸負染色，置電鏡下觀察病毒形態。重組病毐接種在MDCK細胞72h后，出現細胞腫脹變圓、葡萄串樣等典型的CAV-2樣病變(圖17)。在電鏡下可見腺病毒樣病毒粒子(圖18)。病毒粒子呈正二十面體結構，病毒表面由五鄰粒和六鄰粒構成的衣殼，還可見到由殼粒構成的正三角行結構(圖中箭頭所示)。以106PFU/mL的劑量分別將重組病毒rCAV-2AE3-EGFP及CAV-2親本病毒接種于長滿單層MDCK細胞，在接種后培養24h、48h、72h、96h、120h和144h收獲病毒，空斑滴定法測定病毒滴度，繪制生長動力學曲線(圖19)。從圖18中可以看出，CAV-2和rCAV-2AE3-EGFP生長曲線走勢相似，從24h到96h期間病毒滴度不斷升高，且二者的滴度相近；自96h以后達到平穩期，rCAV-2AE3-EGFP的滴度比CAV-2略低；120h后病毒滴度有所下降。1.10重組病毒遺傳穩定性檢測將純化的rCAV-2AE3-EGFP在MDCK細胞上連續傳代13次，在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白表達的情況。并用1.8中的方法對傳代后的的rCAV-2AE3-EGFP進行PCR鑒定。用連續傳13代的rCAV-2AE3-EGFP接種MDCK細胞，48h后在熒光顯微鏡下可見除部分病變脫落的細胞外幾乎所有細胞均呈現綠色熒光。PCR鑒定結果與2.3的結論相同。將純化后的重組病毒rCAV-2AE3-EGFP連續傳15代，經測定每一代病毒的滴度相接近(見表l)。選取第5、10、15代重組病毒進行PCR鑒定，均只能擴增出特異性外源基因條帶，而CAV-2對照只能擴增出缺失的E3區基因(圖20)，證明外源基因在傳代過程中未丟失且無野生型病毒的污染。接種病毒24h后觀察熒光結果顯示EGFP在第5、10、15代:歐組病毒中均獲得了表達(圖21)。證實本實驗所獲得的重組病毒rCAV-2AE3-EGFP能夠穩定表達外源基因。表1rCAV-2AE3-EGFP在MDCK細胞上傳代后病毒滴度的變化<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>1.11重組病毒作為疫苗載體的安全性評估5只1月齡的幼犬隔離飼養于哈爾濱獸醫研究所動物房，生長至4月齡時經血凝抑制試驗檢測犬腺病毒抗體為陰性。將5只犬隨機分為3組第一組2只接種rCAV-2AE3-EGFP(5X108PFU/mL)，肌注5mL/只;第二組兩只接種同樣劑量的CAV-2;第三組一只肌注5mLDMEM培養液。接種后每天觀察犬的臨床變化。3周后剖檢犬，觀察心、肝、脾、腎、肺、氣管、腮腺、扁桃體、肩前淋巴結，頜下淋巴結等器官的病理變化。三組犬接種病毒后均無明顯臨床癥狀，3周后剖檢做病理切片。接種CAV-2犬、接種rCAV-2AE3-EGFP犬與對照犬各組織器官病理變化的比較見表2及圖21。分析實驗結果，接種rCAV-2AE3-EGFP的犬組織無明顯病變，僅個別組織出現淋巴細胞浸潤，屬正常免疫反應，說明E3區的缺失未使CAV-2的致病力增強。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>注表中(一)表示無明顯病理變化。本發明成功構建了E3區缺失的重組CAV-2轉移載體并獲得了純化的含有EGFP報告基因的重組CAV-2毒株，對其克隆純化方法進行了優化，經鑒定該重組病毒生物學特性穩定，為進一步開展CAV-2活載體疫苗研制及相關基礎研究提供了技術平臺。試驗例1犬瘟熱病毒A株F和H蛋白在重組犬腺病毒中的表達腺病毒為載體的重組活疫苗，不僅刺激機體產生系統免疫而且還產生良好的局部粘膜免疫，可對抗母源抗體的干擾，且可通過多種途徑傳播，口服、點眼、滴鼻、氣霧和注射均引起病毒感染，給疫苗應用提供了方便，特別適用于動物的群體免疫。因此選用腺病毒作載體進行活載體重組疫苗的研究是有實用意義的。CAV-2以犬為天然宿主，常用作弱毒疫苗用于犬傳染性肝炎和犬傳染性喉氣管炎的預防，本研究擬將CDV中能夠刺激機體產生中和抗體的兩種主要的免疫原性蛋白F及H的編碼基因插入表達載體pUC-AE3-EGFP中，用以構建表達CDV-F和CDV-H的重組CAV-2，為研制能夠同時預防犬傳染性肝炎、犬傳染性喉氣管炎和犬瘟熱的重組活載體疫苗奠定基礎。1材料及方法1.1病毒和細胞重組2型犬腺病毒rCAV-2AE3-EGFP由本發明實施例2所構建，犬瘟熱病毒A株種毒由哈爾濱獸醫研究所經濟動物研究室提供，在雞胚成纖維細胞上增殖培養；MDCK細胞由本實驗室保存。1.2質粒表達載體pUOAE3-EGFP山本發明實施例2所構建。1.3主要試劑TRIzolReagent購自Invitrogen公司DEPC，Taq、限制性內切酶^^1I禾nAtotI、IPTG、NC膜均購自TaKaRa公司；蛋白分子量標準購自Fermentas公司；辣根過氧化物酶標記的羊抗犬IgG、FITC標記的兔抗犬IgG熒光抗體購自KPL公司，其它試劑同實施例2。1.4SPF雞胚由哈爾濱獸醫研究所實驗動物中心提供。1.5犬瘟熱病毒的增殖取911日齡的SPF雞胚，先后用碘酒棉和酒精棉消毒氣室部位，無菌取雞胚，棄去頭、四肢和內臟，剪成約2mm大小的組織塊；用Hank，s液洗滌組織塊，去除污血后，以5mL/胚的比例加入0.25%胰酶溶液，放置在37。C水浴中消化15min;倒掉胰酶，用Hank's液洗滌23次后加入適當的含10%胎牛血清的DMEM培養液，分散細胞，用6層紗布過濾，制成1(f10'個/ml的細胞懸液，分散于細胞培養瓶中，制成雞胚成纖維細胞(Chickenembryofibroblast,CEF)待細胞長成單層后，棄去培養基，用PBS洗滌細胞以去除殘留血清。取A株CDV種毒1:100倍稀釋后取少量接種細胞，37'C吸附lh，加入DMEM維持液，繼續培養至細胞病變完全，收獲細胞培養物反復凍融3次后于-7(TC保存備用。1.6RT-PCR引物設計參照己發表的CDVF和H基因序列，分別設計了用于分段擴增F基因的兩對引物F1U/F1L和F2U/F2L;及用于擴增H基因的引物HU/HL，由上海生物工程公司合成。合成后所有上游引物均采用DEPC處理的滅菌水溶解。F1U:5'AGAAGGCAGATCATTATCGGAC3'F1L:5，CATCTCTGCCCAA〔'TAATTCAC3，F2U:5'GATGTGAATTAGTTGGGCAGAGA3'F2L:5，TGTTGGACTACCTGAGCCCTAA3，HU:5'TAGGGCTCAGGTAGTCCARCAAT3，HL:5'GTATACGGCCTAAATCTTCGACA3，1.7病毒基因組RNA的提取參照TRIzolReagent的說明書進行，具體步驟如下取病毒懸液約200uL加入ImL的TRIzol裂解液，顛倒混勻室溫放置5min，加入200uL氯仿蓋緊EP管用力振蕩15S，室溫放置23min，4°C12000rpm離心15min，小心吸出上清加入等量的異丙醇混勻后于室溫放置10min，4°C12000rpm離心15min，棄上清，沉淀用75%乙醇洗滌后真空干燥，用DEPC水重懸，紫外分光光度計測定RNA的濃度及純度，立即反轉錄或-7(TC保存。1.8反轉錄在DEPC處理的EP管里配置反應液，模板RNA3叱，RandomPrimerl叱(25pmol/叱)混勻后置于7(TC5min，于冰上依次加入以下組分M-MLVX5ReactionBuffer5叱，dNTPMixture(10mmol/U機，Ribo匿leaseInhibitorl叱，M-MLVl叱，加滅菌DEPC水定容至25叱，37。C作用lh，70°C10min后冰浴2min，所得的cDNA模板用于PCR擴增反應。1.9目的基因的PCR擴增取上述反轉錄產物為模板50叱反應體系依次加入TaKaRaLATaq(5u/叱)l叱，10XLApCR"'BufferII(Mg"'Plus)10叱，上游引物(10mM)2叱、下游引物(10mM)2叱、dNTP(各2.5mM)8叱、模板3叱。PCR反應參數為95。C預變性3min，94°C30S，60°C(F1)/55。C(F2)/58。C(H)2mm，30個循環，72。C延伸10min。取5叱PCR產物經0.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定條帶大小正確后將PCR產物送英杰生物公司測序。I.IO序列分析選擇GenBank中幾種標準疫苗株0nderst印oort(AF378705)丄ederle株(AF164967)、Convac(Z35493)及從不同國家分離到的具有代表性的野毒株5408P(AY86316)、11103B(DQ494319)、012689(AY649446)、A75/17(AF164947)、GN(EF445054)、SC01(EF)、Yanaka(AB028914)、5VD(AY297454)、HM6(AB040768)、MS01(DQ922630)、ZD01(EF445051)、顧(EF445053)、982645(AY542312)、25259(AY964114)、002601(AY395984)等與A株的F、H基因進行了核苷酸及氨基酸序列的比對。1.ll重組轉移載體的構建通過對上述PCR產物基因測序結果的分析，設計2對引物rF-U/rF-L和rH-U/rH-L分別用于擴增包括完整閱讀框的CDV-F和CDV-H。在兩條上游引物的5'端均引入了^^II酶切位點，兩條下游引物的5'端均引入了A^H酶切位點，引物序列(斜線部分為酶切位點)如下rF-U:5，CCC掘7TrCCCCATGCACAAGGAAAT3，rF-L:5'ATA■紅G6TTATTGCAGTTGAGTGAC3'rH-U:5，CCC■7tTCGCMTGCTCTCCTACCAAGAC3,rH-L:5'AAA<6TAGTGGTCACATGAGAATC3'提取A株CDV基因組RNA，分別以rF-U/rF-L、rH-U/rH-L為引物經RT-PCR擴增了CDV-H及CDV-F。兩目的片段用S^II和vVotI消化后，分別與經過同樣處理的pUC-AE3-EGFP載體連接，用插入的外源基因替換了綠色熒光蛋白基因，鑒定連接正確的質粒分別命名為pUC-AE3-F。1.12重組病毒的篩選MDCK細胞在六孔板中培養至單層，以每孔107PFU的劑量接種重組病毒rCAV-2AE3-EGFP，每孔200uL吸附lh后棄去感染液，磷酸鈣轉染法(具體操作同實施例2)分別轉染純化的重組質粒pUC-AE3-F、pUC-△E3-H。待細胞病變完全后收取病毒液繼續接種MDCK細胞，在熒光顯微鏡下篩選無綠色熒光的蝕斑，經多次蝕斑純化復至用篩選到的重組病^感染細胞后在熒光顯微鏡下觀察不到綠色熒光為止，將篩選到的重組病毒分別命名為rCAV-2AE3-F和rCAV-2AE3-H，擴大培養后-7(TC保存。1.13重組病毒的PCR鑒定SDS-蛋白酶K法(同實施例1)提取重組病毒rCAV-2AE3-F和rCAV-2△E3-H的核酸DNA，分別用rF-U/rF-L和rH-U/rH-L做PCR鑒定，驗證F和H基因是否重組到rCAV-2AE3-EGFP的基因組中，用引物EGFP-S/EGFP-X做PCR鑒定檢驗重組病毒的純化是否完全。1.14間接免疫熒光鑒定將重組病毒rCAV-2AE3-F和rCAV-2AE3-H感染后的MDCK細胞分別用0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化；PBS洗滌，2000rpm離心5min，將吹打均勻的細胞滴在載玻片上，自然干燥；冷丙酮固定5-10min后，自然干燥；用PBS洗滌3次，每次5min;CDV單因子陽性血清用PBS稀釋100倍，滴加在載玻片上，37。C作用45rain;載玻片用PBS洗滌3次，每次5min，用去離子水洗滌一次，自然干燥；取FITC標記的兔抗犬IgG熒光抗體用的PBS稀釋到工作濃度，滴加在載玻片上，37。C作用45min;用PBS洗滌3次，用去離子水脫鹽后，自然干燥；滴加堿性甘油，加蓋玻片，置于熒光顯微鏡下觀察。1.15Westernblot分析用重組病毒rCAV-2AE3-F和rCAV-2AE3-H分別感染MDCK細胞待細胞病變完全，刮取細胞作為檢測樣品。加入等體積的2XSDS電泳上樣緩沖液置于沸水中煮沸10min。處理好的樣品進行10。/。凝膠SDS-PAGE蛋白電泳，具體操作按《分子克隆實驗指南》(科學出版社，第二版)進行。將6張濾紙和硝酸纖維素(NC)膜剪成與凝膠同樣大小，在轉移緩沖液中浸泡5min，按3張濾紙、NC膜、PAGE凝膠、3張濾紙的順序依次疊放在一起，按NC膜側在陽極、凝膠側在陰極將其放入轉移槽中穩流(40mA)轉印2h。轉印結束將NC模放入封i:i袋中，加入封閉液4r封閉過夜。然后用PBST(0.05%Tween20)洗滌三次，每次35min，加入用封閉液配制的l:100倍稀釋的CDV多克隆抗血清，37。C感作lh,棄去一抗，用PBST洗3次，每次10min。然后加入用PBST稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗犬IgG，37°C感作lh，再用PBST漂洗3次后顯色，待出現明顯的條帶時去離子水終止顯色反應。2結果2.1F和H基因的擴增結果提取的病毒基因組RNA經反轉錄后用特異性引物F1U/F1L和F2U/F2L分別擴增了約1200bp和1500bp的兩個片段(圖23);HU/HL擴增后得到了約1900bp的片段，與預期大小一致(圖24)。2.2F和H基因的核苷酸及推導的氨基酸序列分析對PCR產物的測序結果進行了分析，A株CDV的F基因編碼框全長1989bp,共編碼662個氨基酸殘基，與其它毒株進行比較發現A株CDV的F基因與標準疫苗株Onderst印oort的核苷酸及氨基酸序列同源性最高，分別為97%和96.4%。與另外8株的核苷酸同源性在96.6%91.6%之間，氨基酸同源性在94.9%89.8%之間。H基因編碼框全長1824bp，共編碼607個氨基酸殘基，與其它毒株進行了序列比較發現A株H基因與Lederle株Onderst印oort株序列同源性較高，核苷酸同源性分別為98.8%和96.6%;氨基酸同源性分別為97.5%和95.4%，與其余毒株的核苷酸及氨基酸同源性分別在90%和89%以上。2.3轉移載體的構建將擴增得到的F、H基因片段用勘/II和A^1消化后，分別'j經過同樣處理的pUOAE3-EGFP載體連接，構建了重組質粒pUC-AE3F和pUC-△E3-H。對重組質粒分別作《^n單酶切鑒定，7%711和7W^I雙酶切鑒定所得到條帶均與理論上的大小相一致(圖25，圖26)。2.4重組病毒的篩選及PCR鑒定用純化的重組質粒pUC-AE3-F、pUC-AE3-H分別轉染rCAV-2AE3-EGFP感染的MDCK細胞，病變完全后收取病毒液繼續接種MDCK細胞，在熒光顯微鏡下篩選無綠色熒光的蝕斑，經多次蝕斑純化直至用篩選到的單一克隆株感染細胞后在熒光顯微鏡下觀察不到綠色熒光并能夠形成典型的CAV-2樣細胞病變為止(圖27)，將篩選到的兩株單一克隆重組病毒分別命名為rCAV-2AE3-F和rCAV-2AE3-H。用引物rF-U/rF-L和rH-U/rH-L對所篩選到的兩種單一克隆株進行了PCR擴增，結果為陽性，而引物EGFP-S/EGFP-X擴增的結果為陰性(圖28)2.5間接免疫熒光檢測間接免疫熒光結果(見圖29)證實F及H基因在重組病毒中均獲得了表達。2.6Westernblot分析將重組病毒rCAV-2AE3-F和rCAV-2AE3-H分別接種MDCK細胞，待細胞病變達80%以上時，刮取病變細胞作為檢測樣品進行WesternBlot，以CAV-2接種的MDCK細胞作對照。結果在rCAV-2AE3-F的細胞培養物中檢測到大小約為43kDa和20kDa的蛋白，與F1、F2蛋白大小一致；在rCAV-2△E3-H的細胞培養物中檢測到大小約為68kDa的蛋白，與H蛋白大小相一致；證明F及H蛋白在重組病毒中均獲得了表達，并具有抗原反應原性(圖30，圖31)CDV病毒的結構蛋白主要冇核衣蛋白(N)、磷蛋國、基質膜蛋白(M)、融合蛋白(F)、附著蛋fl(H)，其中F、H為分布在囊膜表面的兩種糖蛋白，囊膜糖蛋白為宿主免疫識別的主要靶抗原，是病毒的吸附和侵入宿主細胞過程中必不可少的。其中F蛋白是融合過程中所必需的，它所誘導的免疫反應能阻止病毒進一步侵染，并在病毒增殖的情況下對癥狀的發生具有一定的抑制作用。純化的F蛋白免疫犬可免受致死量的CDV攻擊(Blixenkron-Mollereta人1992)。H蛋白是CDV與細胞受體結合的蛋白，決定著病毒的細胞噬性，與F蛋白一起介導了病毒感染細胞合胞體的形成，H蛋白上分布著許多中和抗體表位，是產生中和抗體的主要抗原。具有中和作用的抗H蛋白抗體和抑制細胞融合的抗F抗體，在抗CDV感染的機制中發揮著重要作用。因此，在構建病毒的亞單位疫苗或重組基因工程疫苗方面，主要以這兩個蛋白作為切入點。在實施例2中所構建的重組載體pUC-AE3-EGFP缺失了E3區1412bp的片斷，從理論上講可使外源基因的容量擴增至3000bp，但所插入的hCMVIE啟動子、多克隆位點，綠色熒光蛋白基因、SV40早期轉錄PolyA信號等元件又占用了約1600bp的容量，而CDV-F和CDV-H基因片斷大小分別為1998，1824bp,若將二者直接插入載體pUC-AE3-EGFP中則會超過CAV-2核衣殼的包裝限度。對此本發明所采取的措施是，去除pUC-AE3-EGFP中的EGFP基因，即分別用CDV-F和CDV-H基因取代EGFP基因。為了方便篩選，本發明用篩選獲得的遺傳穩定表達綠色熒光蛋白的單一純化重組病毒克隆rCAV-2AE3-EGFP作為親本病毒感染MDCK細胞，使其基因組分別與重組質粒-rCAV-2AE3-F和rCAV-2AE3-H發生細胞內同源重組。通過篩選無綠色熒光的蝕斑來篩選重組病毒。本實驗對篩選的重組病毒進行了Western-blot檢測，在感染rCAV-2AE3-F的細胞培養物檢測到了大小約為40kDa和23kDa的兩個蛋白。在對rCAV-2AE3-H中重組H蛋白的檢測中，得到了與預期大小相符的約67kDa的蛋白，但在其它的下方出現一條分子量略小于H蛋白的特異性條帶，推測為病毒系統對重組蛋白加工、剪切的結果。本實驗利用在實施例2中已驗證的能夠穩定表達外源蛋白的的E3區缺失的CAV-2載體構建了表達了A株CDV的F和H基因的重組病毒，經Western-blot檢測所表達蛋白具有良好的免疫活性。序列表SEQUENCELISTING<110>中國農科院哈爾濱獸醫研究所<120>重組犬2型腺病毒轉移載體、其構建方法及應用<130〉22〈160>10〈170〉Patentlnversion3.1〈210〉1<211>6152<212>隨〈213〉Artificial<400>1tcgcgcgtttcggtgatgscggtg3333CCtctgacac3tgcagctcccgg3g3CggtC360cagcttgtctgtaagcggatgccggg3gcagacaagcccgtcagggcgcgtC3gCgggtg120ttggcgggtgtcggggctggCtt38Ct8tgcggcatcagsgcag3ttgtaCtg3g8gtgC1803CC3t3tgCggtgtgaaataCCgC3C3g3tgCgt33gg3gsaastacegeatcsggcgcc240attcgccattC3ggctgcgc33CtgUggg33gggCg8tCggtgcgggcctcttcgctat300t8cgccagctggcg認ggggg3tgtgCtgcaaggcg8tt33gttgggt33CgCC3gggt360tttCCC3gtC3Cg3CgttgtaaaacgacggccagtgccaagCUgC3tgCctgcaggtcg4203CtCt3gaggatccccgggt3CCg3gCtCgaattccaaccgcctttttccaac3ctgtac480gCC8tCttCC33C333gC3gaggctcccccacggc3tt3acagatccctc540agatccctcct33g38gCtgtctct3CC3Caagtcagagg3gC3gCtgCtgCgC3CgCg360038Cg3CgCCgaagctttgctC33C333t3CtgtC38gg3Ctcgagtccggcacagactga660gcaeitgtctaaagaaataccaaccccttatatgtggagct8CC33CCgC38acgggacac720gccgccggcgrctcccaggactactccaccggttt3gtgCtgggccatca7803tg3ttagtc服gtttatggC3ttagagacttgCg(，33C3fl3gt11tgflt83cccagg(:a840aacaataatggatCCgCC33tttggCC3gCtgccatgctt900gttcaggaagCCgCCCC3CCC3333CggtC〖ictctgcccagfl犯CC3C3CCCt3g33C3g960gctstgacc3actctggggcgC3gCt3gCggg3gg3Cgac3gCtgtgCCCctcccaaatii1020gCCC3gtgCtggCtggC3Cgggcattcagctt9gCg33g3catcccx8g('1080g(:rtrrtgga1(:agg(::ccgacggcat3tTcgggggtCT(:gcU'gt(('"('1卜l()C8CCCtgC3Scaggcatcct(:g3('gcrg('g1200gtgggC3CCtaccagttt.gtgcgcg犯tttgtgCC3g3ggtataccttaaccctttttea1260ggaccaccggacacctttcctgatcagttcattcctaactacg8cattgtaaccaactct1320gtcgatggct3tgactgsgg卿gcatggaccaggtggactagtccgccatgcattagtt1380attaatagta8tC33tt3CggggtC3tt3gttcatagcccttccgcgtt31440cataacttacggtsaatggcccgcctggctg3CCgCCC33Cg3CCCCCgCccattgacgt1500C3at3atgacgtatgttcccatagtaacgcC33taggg3Ct.ttccattgaCgtC33tggg1560tggagtatttacggtaaactgcccacttggC8gtacatc33gtgt8tcatatgccsagta1620cgccccctattg3CgtC33tgacggtaaatggcccgcctggcattatgccC3gt3C3tg31680CCtt3tggg3CtttCC"t3CttggcagtacatctacgtaU3g"tC3tCgCtattaccatggmotgatgcggttttggC3gt8CatcaatgggcgtggatagcggtttgactcaCgggg3tttC1800caagtctccaccccattgacgtC33tggg3gtttgttttggcaccaaaatcaacgggact1860ttccaaaatgtcgtaac8actccgccccattgacgc3a3tgggcggt鄉cgtgtacggt1920gggaggtctatataagC8gagctggtt.tagtg3accgtc3gatccgctagCgCt3CCgg31980ctcagatctcg3gCtC33gCttcgaattctgC8gtCg3Cggtsccgcgggcccgggatcc2040accggtcgccaccatggtgagC33gggCg3gg3gCtgttC3CCggggtggtgCCC3tCCt2100ggtcgagctggacggcgacgt833CggCC3caagttcagcgtgtccggcg3gggcgaggg2160cgatgccacctacggcaagctg3CCCtg33gttcatctgcaccaccggcaagctgcccgt2220gccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcsgtgcttcagccgctaccc2280cgaccscatg^mgC3gC3Cgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccagga2340gcgcaccatcttcttcaaggacg3cggcaactscaag3cccgcgccgaggtg犯gttcga2400gggCg8C8CCCtggtg33CCgcatcgagctg犯gggC3t.CgacttC3aggaggacggcaa2460CEltCCtggggC3caagctggagtacaactaC33C3gCC3Caacgtct3tatcatggccga2520caagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgcCaC33C3tCg3gg3CggC3g2580CgtgC3gCtCgccgaccactaccsgcagaacacccccstcggcgscggccccgt.gctgct2640gcccg3caaccactacctgagcacccagtccgccctgagc333g3CCCC33Cg3g33gCg2700cgatc3C3tggtcctgctgg3gttcgtgaccgccgccggg3tC3CtCtCggC3tggscga2760gCtg"t3C33gtsaagcggccgcgactct3g3tcata3tcagCC3taCC3Catttgt卿g2820gttttacttgCttt333333CCtCCC3C3Cctccccctgaacctgaascataa83tgaat2880gcaattgttgttgttaacttgtttattgc3gcttataatggtt3caa8t.a3agcsat3gc2940atcac3aatttcacaaataaagcatttttttcactgcact3gtggt3CC3ccctcagcct3000tct33tgggaaa3tC3ggcccatgtagctt3060ttttgctaag9CgtCtgggtcctgcgtttct3tgtCC3CCa(化gtcccctcttcccagct3120ttggtacttccacttgtgcgCgCg3gCC3gcttgcggatgtgCUg333g8t33tgtggt3180ctctcccaacagcttcccgttC3CC8gC8Ccagggccatg朋gcggei〔:3Cgaagagctct3240acct.gcaaattstgaccctgt3t3tCC3t3cgacgcccccgggmircaC3C33CCCCC3300gtCtC3Ctg3gt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