專利名稱：牛質粒型腺病毒載體pAd-ZBED6及其構建方法和用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種含有ZBED6基因的質粒型腺病毒載體，該質粒型腺病毒載體腺病毒載體的構建以及在改造種子細胞和牛ZBED6功能鑒定的應用。
背景技術：
AdEasyTM系統是由T. C. He等(1998)構建的用來代替傳統腺病毒重組系統的一個快捷系統。在這個系統中，只需二步即可產生重組腺病毒先將表達盒裝入轉移載體，然后再通過同源重組插入腺病毒基因組。將外源基因插入腺病毒的最有效途徑是通過同源重組，原因是1)腺病毒DNA是大型的線性分子，含有幾乎所有的內切酶切位點；2)基因組過大(36kb),難于操作。在AdEasyTM載體系統中，含有大部分腺病毒基因組的載體為超螺旋質粒，而不是線性DNA，同源重組則在大 腸桿菌進行。相對于傳統系統而言，這兩點改進使病毒DNA操作更容易，同時由于利用了大腸桿菌的高效率同源重組特性而使重組載體的篩選更為簡單。在本系統中，首先將基因cDNA插入一個轉移載體，將得到的質粒用PmeI線性化，然后在大腸桿菌BJ5183中與病毒DNA質粒pAdEasy-Ι進行同源重組。pAdEasy-Ι缺失了 El和E3區，其El區功能將在293A細胞中得到互補。重組子通過卡那霉素篩選，用內切酶進行鑒定分析。最后將得到的重組腺病毒用PacI線性化，暴露其反向末端重復序列(ITR，IavertedTermined Repeats),轉染293A細胞后產生重組病毒顆粒。同源重組在線性化的轉移載體和完整的超螺旋腺病毒質粒之間進行。應用完整的腺病毒質粒而不用內切酶進行線性化，對于產生重組腺病毒至關重要。轉移載體中的卡那霉素抗性基因則可用來篩選重組子。由于線性化的轉移載體產生卡那霉素抗性克隆的背景較低，因此該同源重組系統有較高的信噪比。大腸桿菌BJ5183有recA活性，但同時缺失介導細菌重組的其它酶，具有高效的轉化和重組能力。一旦重組子經確定，則可轉入普通的無reCA、endA活性的細菌株如DH5a等進行擴增。由于缺乏recA活性，DH5 a不能用于腺病毒的同源重組。與傳統系統相比，AdEasyTM系統中篩選和純化腺病毒所需的時間大大縮短了。克隆和篩選約需I 3周，重組后需驗證重組病毒質粒是否含有目的基因。重組子在DH5 α中擴增后轉入哺乳動物細胞293Α，最后將293Α細胞中產生的重組病毒顆粒進行純化和滴定。最終得到的重組腺病毒只能在提供El區功能的293Α細胞中進行增殖。一般來說，用傳統方法產生重組腺病毒并不需要大量工作，每天只需I小時進行細胞傳代和觀察空斑形成。但由于病毒空斑形成速度慢，整個過程就需要很長時間。而AdEasyTM載體系統用大腸桿菌產生重組病毒，大大縮短了所需時間。鋅指蛋白是一類具有手指狀結構域的轉錄因子，對基因調控起重要的作用。根據其保守結構域的不同，可將鋅指蛋白主要分為C2H:型、C。型和C6型。鋅指通過與靶分子DNA、RNA、DNA-RNA的序列特異性結合，以及與自身或其他鋅指蛋白的結合，在轉錄和翻譯水平上調控基因的表達。
鋅指蛋白ZBED基因家族共發現有5個成員；其功能如下ZBED1基因參與調節一些能夠促進細胞的增殖的基因；ZBED2基因參與胚胎發育；ZBED3基因參與正調控Wnt/β-catenin信號通路。ZBED4基因作用于視網膜的形成。ZBED5基因與乳腺癌有關。ZBED6基因主要影響著發育、細胞增殖和肌肉生長。ZBED6基因是失去轉座功能的轉座子，在所有哺乳動物中位于ZC3H11A基因第一內含子中；該基因在小鼠、大鼠、人、猩猩、狗、馬、家豬中高度保守。實時定量PCR分析顯示，小鼠ZBED6的mRNA在腦、心臟、腎臟、肝臟、肺、肌肉、卵巢、脾、尾和睪丸組織有不同程度地表達。ZBED6蛋白含有2個BED結構域和I個hATC 二聚結構域；第61 80位和第231 248位氨基酸殘基是2個細胞核定位信號(富Lys-Arg區段)。該蛋白在哺乳動物中高度保守，尤其是DNA結合BED結構域，在26個物種中(包括家豬)顯示出100%相似性。Markljung等(2009)用siRNA將小鼠C2C12成肌細胞中的ZBED6基因沉默后的實驗結果表明，ZBED6蛋白作為抑制因子是通過與位于胰島素樣生長因子2(insULin-likegrowth factor 2, IGF2)基因第 3 內含子中的 QTN(Quantitative traitnucleotide)位點結合來抑制IGF2基因的表達。當ZBED6基因沉默后，IGF2基因的表達量升高、細胞增殖(肌管形成)加快、創傷愈合加快。Markljung等(2009)采用ChIP-Seq技術對小鼠C2C12成肌細胞進行分析，研究ZBED6蛋白作用靶點(IGF2基因及其下游基因)，在IGF2基因內含子中的QTN位點是ZBED6蛋白在基因組上的主要結合位點。家豬IGF2基因第三內含子單堿基G — A的替換，導致抑制因子ZBED6在該基因上結合位點的喪失，從而使IGF2在骨骼肌中上調表達(表達量是正常情況的3倍)，這一突變主要影響肌肉生長(提高了骨骼肌的數量，因此豬肉產量提高了39Γ4%)、心臟增大和脂肪沉積。GO注釋分析發現，ZBED6蛋白的1200個作用靶點起著發育、轉錄調控、細胞分化等作用。其中，262個靶基因編碼轉錄因子，36個含有Homeobox結構域，26個屬于bHLH(basic helix -loop-helix)家族，10個屬于FOX家族,8個細胞核受體,7個屬于SOX家族。綜上所述，在哺乳動物中，ZBED6是一個重要的轉錄因子，影響著發育、細胞增殖和肌肉生長。通過秦川牛ZBED6基因腺病毒載體的構建能夠為秦川牛肉質性能、生長性能的標記輔助選擇和新的優良品種的育種提供重要的研究資料，最終為轉基因動物的研究及秦川牛生長發育和牛肉品質的改善提供理論依據。

發明內容
本發明的目的在于公開了一種質粒型腺病毒載體pAd_ZBED6。本發明的第二個目的在于公開了質粒型腺病毒載體pAd_ZBED6的制備方法。本發明的第三個目的在于公開了質粒型腺病毒載體pAd_ZBED6的應用。本發明的目的是通過以下技術方案實現的一種質粒型腺病毒載體pAd_ZBED6，其中，所述質粒型腺病毒載體pAd_ZBED6含有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的秦川牛ZBED6基因。上述技術方案所述的質粒型腺病毒載體pAd_ZBED6，其中，所述質粒型腺病毒載體pAd-ZBED6是由AdEasyTM系統構建完成。
上述技術方案所述的質粒型腺病毒載體pAd_ZBED6，其中，所述質粒型腺病毒載體pAd-ZBED6中的ZBED6基因連接于穿梭質粒CMV啟動子之下。上述技術方案所述的質粒型腺病毒載體pAd_ZBED6，其中，所述質粒型腺病毒載體pAd-ZBED6中的ZBED6基因起始密碼子前含有Kozak序列；其中Kozak序列為GCCCACC。上述技術方案所述的質粒型腺病毒載體pAd_ZBED6，其中，所述質粒型腺病毒載體pAd-ZBED6中的ZBED6基因起始密碼子后含有6個His標簽序列。構建上述技術方案中任一技術方案所述的質粒型腺病毒載體pAd_ZBED6的方法，所述方法包括如下步驟(I)、將PCR擴增的ZBED6基因片段連接到pGM_T載體，重組質粒pGM_T_ZBED6 ;將重組質粒PGM-T-ZBED6和穿梭質粒pAdTrack_CMV經KpnI和XbaI雙酶切，將ZBED6基因片段和pAdTrack-CMV載體片段利用T4DNALigase進行酶連反應，酶連產物轉化E. coli DH5 α感受態細菌，得到pAdTrackCMV-ZBED6重組質粒；(2)、限制性內切酶Pme I線性化pAdTrack-CMV_ZBED6重組穿梭質粒，用線性化pAdTrack-CMV-ZBED6重組穿梭質粒轉化含有pAdEasy-Ι質粒E. coliBJ5183感受態細菌,利用E. coli BJ5183內Cre重組酶高效的同源重組系統，在細菌中完成pAdTrack-CMV_ZBED6和pAdEasy-Ι的同源重組，獲得攜帶ZBED6基因的重組腺病毒質粒pAd_ZBED6。上述技術方案所述的方法，其中，所述方法還包括將重組腺病毒質粒pAd_ZBED6用脂質體LIPOFECTAMINE 2000轉染后，在293A細胞中進行病毒包裝。上述技術方案中任一技術方案所述的質粒型腺病毒載體pAd_ZBED6，作為秦川牛ZBED6基因功能鑒定的應用。上述技術方案中任一技術方案所述的質粒型腺病毒載體pAd_ZBED6，作為細胞改造的應用。上述技術方案中任一技術方案所述的質粒型腺病毒載體pAd_ZBED6，作為肌肉生長發育調控的應用。具體的本發明是通過以下技術方案來實現PCR擴增ZBED6后和pAdTrack-CMV穿梭質粒經KpnI和XbaI雙酶切，凝膠回收試劑盒回收ZBED6基因片段和pAdTrack-CMV載體片段，回收的載體片段和目的基因片段T4DNA Ligase進行酶連反應。酶連產物轉化E. coli DH5 α感受態細胞，純化試劑盒抽提pAdTrack-CMV-ZBED6重組穿梭質粒，KpnI和XbaI雙酶切鑒定證明獲得正確的pAdTrackCMV-ZBED6 重組質粒。 限制性內切酶Pme I線性化pAdTrack-CMV_ZBED6重組穿梭質粒，凝膠回收試劑盒回收線性化pAdTrack-CMV_ZBED6重組穿梭質粒，轉化含有pAdEasy-Ι質粒E. coliBJ5183感受態細胞，利用E. coli BJ5183內Cre重組酶高效的同源重組系統，在細菌中pAdTrack-CMV-ZBED6和pAdEasy-Ι同源重組獲得攜帶ZBED6基因的重組腺病毒質粒，將同源重組成功的重組腺病毒質粒命名為pAd-ZBED6。試劑盒抽提同源重組質粒，O. 7%瓊脂糖凝膠電泳，選擇比pAdEasy-Ι大的重組腺病毒質粒，Pac I酶切。酶切產物通過O. 7%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，瓊脂糖凝膠電泳結果與理論上同源重組質粒多克隆位點圖譜吻合。pAd-ZBED6重組腺病毒質粒轉化E. coli DH5 α感受態細胞，大量抽提質粒備用。pAd_ZBED6重組腺病毒質粒用PacI線性化暴露反向的末端重復序列，采用脂質體轉染包裝細胞(293Acells)進行病毒包裝。轉染24h后熒光顯微鏡直接觀察，可見穿梭質粒帶有的綠色熒光蛋白(GFP)基因表達。重組病毒上清液感染293A細胞擴增重組腺病毒，熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白基因的表達。將重組腺病毒質粒pAd_ZBED6感染牛原代肌肉細胞，利用實時定量PCR和Westernbloting技術檢測過表達ZBED6基因對牛肌肉細胞增殖分化和肌肉發育相關基因的表達模式的影響，是本發明重組腺病毒質粒pAd-ZBED6作為秦川牛ZBED6基因功能鑒定方面的應用。本發明的重組腺病毒質粒pAd_ZBED6，可用于感染牛肌肉細胞，牛脂肪細胞，293細胞，C2C12細胞，3T3L細胞等細胞系，檢測其對相應細胞結構和功能的影響，是本發明重組腺病毒質粒pAd-ZBED6作為細胞改造的應用。
將重組腺病毒質粒pAd_ZBED6感染鼠C2C12細胞系，利用實時定量PCR和Western bloting技術檢測過表達ZBED6基因對肌肉細胞增殖分化和肌肉發育標志基因(MyoD、MyoG、MEF-2D、Pax7、MHC )在肌肉細胞中的差異表達情況，是本發明重組腺病毒質粒pAd-ZBED6作為肌肉生長發育調控的應用。本發明具有以下有益效果本發明構建了能夠表達秦川牛ZBED6基因的重組腺病毒載體，本發明所構建的載體，轉染原代培養的秦川牛肌肉細胞后，可獲得ZBED6mRNA的高效表達，為ZBED6基因功能鑒定和改造細胞，調控代謝和生長發育奠定了基礎。


1、圖1為PCR擴增的秦川牛ZBED6基因；2、圖2為pAdTrack-CMV_ZBED6重組質粒雙酶切鑒定；3、圖3為pAd_ZBED6重組腺病毒質粒PacI酶切鑒定；4、圖 4 為 pAd_ZBED6 質粒轉染 293A 細胞 5d ；5、圖 5 為 pAd-ZBED6 質粒轉染 293A 細胞 IOd ；6、圖6為pAd_ZBED6質粒轉染秦川牛原代肌肉細胞4d。
具體實施例方式為使本發明的技術方案便于理解，以下結合具體試驗例對鬼子紅在制備治療胃潰瘍藥物中的應用作進一步的說明。本發明利用質粒的體外酶切及連接技術，應用pAdEasy-Ι系統，將線性化的穿梭質粒轉化含有pAdEasy-Ι質粒的E. coli BJ5183感受態細胞進行同源重組,所得重組腺病毒質粒可以通過卡那霉素篩選出，并通過質粒大小和限制性內切酶分析鑒定。最后，PacI酶切后的重組腺病毒質粒轉染293A細胞包裝產生重組腺病毒。實施例1 :DAd-ZBED6重組腺病毒質粒的構建1、材料和方法1.1、儀器超凈工作臺、生化培養箱、基因擴增儀、PTC-200單槽梯度基因擴增儀、Heraeus冷凍高速離心機(德國)、Bio-Rad凝膠成像分析儀(USA)、CO2培養箱、HZS-H水浴振蕩器(哈爾濱)、Eppendorf移液器、DYY-1II型穩壓穩流電泳儀(北京六一)、DYY-1II 31A和DYY-1II 28D電泳槽(北京六一)、制冰儀、MDF-382E超低溫冰箱(日本三洋)、Eppendorf臺式高速離心機、Sartorious電子天平(德國)、常規冰箱等。1. 2、主要生化試劑和試劑盒Long Taq 聚合酶、PrimeSTAR DNA 聚合酶、DNA 限制性內切酶(Xba1、Pac1、Pme1、KpnI和XbaI等)、膠原蛋白、胰蛋白酶、DNA Marker>DNA連接酶、Trizol、反轉錄試劑盒、表達載體(pAdTrack-CMV、pAdEasy-Ι)、質粒提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、胎牛血清、細
胞培養基等。1. 3、培養基和抗性LB培養基胰蛋白胨，酵母粉，NaCl，瓊脂粉；抗性氨芐青霉素，卡納霉素等。1. 4、普通試劑肝素鈉，Tris, EDTA, NaCl, NaOH，無水乙醇，醋酸鈉，十二烷基磺酸鈉(SDS)，抗生素，溴化乙錠(EB)，溴酚藍，二甲基苯菁FF，乙酸，蔗糖，去離子甲酰胺，硝酸，鹽酸，硝酸銀，無水碳酸鈉，硫代硫酸鈉，甲醒，硼酸，瓊脂糖，KCl,Na2HPO4,KH2PO4,Tris飽和酚(pH = 8. O)，氯仿，異戊醇，甘油，石蠟油。1. 5、秦川牛ZBED6基因PCR引物的設計(引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成)參照GenBank 公布的 ZBED6mRNA 序列(NC 007314. 4)設計引物上游引物5，>CGGggtaccGCCCACCATGcaccaccaccaccaccacAGTGTATGTACCTTAAGTGTACC〈3，；下游引物5’>CCCaagcttTTAAGGTAATATTTCTTT TTCATTGC〈3’，其中Kpnl，XbaI分別為上下游的酶切位點。1. 6、PCR擴增秦川牛的ZBED6基因片段(I)、PCR總反應體系為50 μ L，見表1:表I本發明的PCR反應體系
權利要求
1.一種質粒型腺病毒載體pAd-ZBED6，其特征在于所述質粒型腺病毒載體pAd-ZBED6含有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的秦川牛ZBED6基因。
2.如權利要求1所述的質粒型腺病毒載體pAd-ZBED6，其特征在于所述質粒型腺病毒載體pAd-ZBED6是由AdEasyTM系統構建完成。
3.如權利要求1所述的質粒型腺病毒載體pAd-ZBED6，其特征在于所述質粒型腺病毒載體pAd-ZBED6中的ZBED6基因連接于穿梭質粒CMV啟動子之下。
4.如權利要求1所述的質粒型腺病毒載體pAd-ZBED6，其特征在于所述質粒型腺病毒載體pAd-ZBED6中的ZBED6基因起始密碼子前含有Kozak序列。
5.如權利要求1所述的質粒型腺病毒載體pAd-ZBED6，其特征在于所述質粒型腺病毒載體pAd-ZBED6中的ZBED6基因起始密碼子后含有6個His標簽序列。
6.—種構建權利要求1至6中任一權利要求所述質粒型腺病毒載體pAd-ZBED6的方法，所述方法包括如下步驟(1)、將PCR擴增的ZBED6基因片段連接到pGM_T載體，重組質粒pGM_T_ZBED6;將重組質粒pGM-T-ZBED6和穿梭質粒pAdTrack_CMV經KpnI和XbaI雙酶切，將ZBED6基因片段和pAdTrack-CMV載體片段利用T4DNALigase進行酶連反應，酶連產物轉化E. coli DH5 α感受態細菌，得到pAdTrackCMV-ZBED6重組質粒；(2)、限制性內切酶PmeI線性化pAdTrack-CMV_ZBED6重組穿梭質粒，用線性化pAdTrack-CMV-ZBED6重組穿梭質粒轉化含有pAdEasy-Ι質粒E. coliBJ5183感受態細菌,利用E. coli BJ5183內Cre重組酶高效的同源重組系統，在細菌中完成pAdTrack-CMV_ZBED6和pAdEasy-Ι的同源重組，獲得攜帶ZBED6基因的重組腺病毒質粒pAd_ZBED6。
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于所述方法還包括將重組腺病毒質粒pAd-ZBED6用脂質體LIPOFECTAMINE 2000轉染后，在293A細胞中進行病毒包裝。
8.權利要求1至5中任一權利要求所述的質粒型腺病毒載體，作為秦川牛ZBED6基因功能鑒定的應用。
9.權利要求1至5中任一權利要求所述的質粒型腺病毒載體，作為細胞改造的應用。
10.權利要求1至5中任一權利要求所述的質粒型腺病毒載體，作為肌肉生長發育調控的應用。
全文摘要
本發明牛質粒型腺病毒載體pAd-ZBED6及其構建方法和用途，屬于基因工程技術領域。牛質粒型腺病毒載體pAd-ZBED6的構建方法包括(1)將秦川牛ZBED6基因插入pAdTrack-CMV腺病毒穿梭質粒的CMV啟動子之下，構建重組穿梭質粒pAdTrack-CMV-ZBED6；(2)Pme I線性化后轉化含有pAdEasy-l質粒的E.coli BJ5183感受態細胞，利用E.coli BJ5183內Cre重組酶高效的同源重組系統，在細菌中完成pAdTrack-CMV-ZBED6和pAdEasy-1的同源重組，將正確的重組腺病毒質粒命名為pAd-ZBED6；(3)pAd-ZBED6經Pac I酶切線性化后，脂質體轉染293A細胞和秦川牛原代肌肉細胞，產生并獲得重組病毒顆粒。本發明可應用于秦川牛ZBED6基因功能研究、鑒定和對種子細胞進行改造，調控肌肉生長發育相關基因的代謝。
文檔編號G01N33/68GK103031336SQ201210524888
公開日2013年4月10日 申請日期2012年12月10日 優先權日2012年12月10日
發明者陳宏 , 黃永震, 王璟, 李明勛, 賴新生, 藍賢勇, 雷初朝 申請人:西北農林科技大學