蛋白酶體抑制劑與細胞自噬激活劑聯合在膽管癌治療中的應用
【技術領域】
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[0001]本發明涉及醫藥技術領域，具體涉及在膽管癌中檢測PTEN表達的方法，PTEN過表達非增值型腺病毒載體的構建和包裝，以及蛋白酶體抑制劑和細胞自噬/溶酶體激活劑聯合在PTEN缺失型膽管癌治療中的運用。
【背景技術】
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[0002]膽管癌(carcinoma of bile duct，簡稱CC)指源于肝外膽管包括肝門區至膽總管下端的膽管的惡性腫瘤，是原發性肝癌中的一種，占原發性肝癌比例約為10% ;在臨床中表現為潛伏期長，惡性程度高，放化療抵抗，預后差等特點；流行病學顯示近年來膽管癌的發病率持續上升，給整個醫療衛生事業帶來極大的挑戰。隨著研究的深入，人們對參與膽管癌發生發展的分子機制也有了更進一步的認識。基因組測序顯示，部分CC腫瘤組織中3p, 4q, 6q, 9p, 9q, 13q, 14q, 8p, 17p,及21q發生缺失，Iq和7p有增加。外顯子測序顯示P53，KRAS, SMAD4，IHD等是在膽管癌中常常突變或激活的基因JAK_Stat，MAPK,TGFP-SMAD, TOGF信號通路在膽管癌中經常被激活或放大，促進了膽管癌發生發展；這些分子機制的探索為膽管癌的診治提供了新的思路(Ong, C.K.et al.Exome sequencing ofliver fluke-associated cholang1carcinoma.Nat Genet, 2012，44，690-693)。目前，對于膽管癌的治療除手術外，化療是最主要的方式，使用藥物有吉西他濱(GEM)和順鉑(DDP)等，但它們都缺乏明確的分子分型靶標，為腫瘤的治療帶來困難。
[0003]PTEN(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，即MMAC1)是一個重要的抑癌基因，其全稱是人10號染色體上缺失的磷酸酶與張力蛋白同源物，其核苷酸Genebank ID號為5728。1997年被兩個獨立的課題組發現和確認，是繼P53之后發現的最重要的抑癌基因，在多種腫瘤中存在突變或缺失(Li, J.et al.PTEN, a putative proteintyrosine phosphatase gene mutated in human brain, breast, and prostate cancer.Science, 1997，275，1943-1947)。PTEN 通過自身脂質磷酸酶活性，拮抗 PI3K-Akt_mT0R信號通路，調控細胞多種生理進程，包括:存活，增殖，能量代謝，細胞骨架構建以及細胞間相互識別(Song, M.S., Salmena, L.&Pandolfi, P.P.The funct1ns and regulat1nof the PTEN tumour suppressor.Nat Rev Mol Cell B1l, 2012，13，283-296)。因此，調節PTEN表達和功能的機制，在腫瘤發生發展中尤其重要。越來越多的研究發現腫瘤中PTEN缺失與否直接關系著化療藥物的敏感性，有文章指出PTEN的缺失會導致腫瘤細胞基因組不穩定，這種不穩定性恰好適用于某些小分子抑制劑或化療藥物，從而可以實現以 PTEN 為基礎的個性化治療(Mason, J.M.et al.Funct1nal characterizat1n ofCF1-400945, a Polo-like kinase 4inhibitor, as a potential anticancer agent.Cancer Cell, 2014，26，163-176)。
[0004]蛋白酶體(proteasome)是在真核生物和古菌中普遍存在的結構，主要作用是降解細胞不需要的或受到損傷的蛋白質。抑制蛋白酶體的功能將引起蛋白降解的紊亂，導致細胞出現病理性變化，嚴重時會引起細胞死亡。目前，臨床上應用蛋白酶體抑制劑Bortezomib 治療多發性骨髓瘤，取得了 一定的療效(Ria, R., Reale, A.&Vacca, A.Novelagents and new therapeutic approaches for treatment of multiple myeloma.WorldJ Methodol, 2014，4，73-90)。
[0005]細胞自卩蜜(autophagy)是由Ashford和Porter在1962年發現細胞內有“自己吃自己”的現象后提出的，是指從粗面內質網的無核糖體附著區脫落的雙層膜包裹部分胞質和細胞內需降解的細胞器、蛋白質等成分形成自■體(autophagosome)，與溶酶體融合形成自噬溶酶體(autolysosome)，降解其所包裹的內容物，以實現細胞本身的代謝需要和某些細胞器的更新。細胞自噬的現象在機體的生理或病理過程均能觀察到，所起的作用需要進一步闡明。有研究報道mT0R(Mammalian target of rapamycin)的抑制劑Rapamycin，CC-223，AZD8055等可以激活細胞自噬，抑制HCC腫瘤細胞系增殖迀移等生物學過程，目前該類部分藥物已進入二期臨床試驗。這提示我們干預自噬，打破細胞的穩態，可以用于疾病的治療(Ashworth, R.E.&ffu, J.Mammalian target of rapamycin inhibit1n in hepatocellularcarcinoma.World J Hepatol, 2014，6，776-782)。
[0006]但不論是蛋白酶體的抑制劑，或是細胞自噬的調節劑，在臨床上應用均較少。它們都是針對細胞最基本的生命過程，治療的靶向性較差；已經上市的藥物適應癥較為單一，目前還不能廣泛運用。因此，尋找新的適應癥，根據分子分型進行靶向性治療，是這一類藥物急需的。
【發明內容】
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[0007]本發明的目的在于提供一種以PTEN為靶標的膽管癌個性化治療方案；本發明的另一目的在于提供蛋白酶體抑制劑和細胞自噬激活劑新的醫藥用途，即聯合蛋白酶體抑制劑和細胞自噬/溶酶體激活劑可以用于治療PTEN缺失的膽管癌腫瘤。
[0008]為了更好地分析膽管癌的預后風險因素，本發明提供了 PTEN在127例膽管癌石蠟組織切片中的免疫組化評分結果，用于評估膽管癌預后不良。本發明發現，在這127例膽管癌患者的腫瘤組織中有63例樣本(50% )PTEN表達為陰性，表明PTEN在膽管癌中缺失嚴重。結合患者的臨床統計資料，以Kaplan-Meier法比較PTEN陰性/陽性表達的術后無瘤生存時間(DFS)和總體生存時間(OS)，均體現出顯著差異，PTEN陽性的患者預后存活更好。
[0009]本發明的第一方面，提供了人10號染色體上缺失的磷酸酶與張力蛋白同源物(PTEN)可以作為肝內膽管癌評估預后的分子標記物。
[0010]進一步地，本發明提供了 PTEN在制備膽管癌預后評估試劑或試劑盒中的應用。
[0011]所述的試劑為檢測生物樣品中PTEN表達量的試劑；所述的試劑盒包含檢測生物樣品中PTEN表達量的試劑。
[0012]所述的檢測生物樣品中PTEN表達量的試劑，選自:對PTEN具有檢測特異性的探針、基因芯片，或PCR引物等。
[0013]本發明的第二方面，提供了人10號染色體上缺失的磷酸酶與張力蛋白同源物(PTEN)在制備治療膽管癌藥物中的應用。
[0014]所述的藥物為提高PTEN表達量的的試劑。
[0015]所述的能夠提高PTEN表達量的的試劑，選自:PTEN分子、PTEN分子作為活性物質的組合物，或含有PTEN分子的載體等。
[0016]所述的PTEN分子為PTEN基因或PTEN蛋白。
[0017]所述的含有PTEN分子的載體，可以是PTEN過表達的病毒載體，例如PTEN過表達的腺病毒載體，或PTEN過表達的慢病毒載體等。
[0018]本發明提供了一種PTEN過表達腺病毒載體在制備治療膽管癌藥物中的應用；特別是針對PTEN缺失的膽管癌腫瘤。
[0019]所述的PTEN過表達腺病毒載體的構建方法為:使用限制性內切酶獲得線性化載體；通過PCR擴增獲得PTEN cDNA，通過酶切獲得與表達載體相同的粘性末端；在連接酶的作用下，將cDNA與線性化的載體相連接，篩選連接成功的質粒并進行測序鑒定。
[0020]本發明提供了在膽管癌細胞系中過表達PTEN后的芯片分析結果，所篩選出的信號通路可以作為藥物靶點