一種利用迭代同源重組體內進化目標蛋白質的新方法
【專利摘要】本發明涉及一種利用迭代同源重組體內進化目標蛋白質的新方法。其特征在于：首先在體外通過兩步PCR制備得到帶突變的單鏈核苷酸并用DNase I酶切，回收80?100nt片段構成目標蛋白質的單鏈核苷酸突變庫；以此單鏈突變庫轉化大腸桿菌，通過λ?Red同源重組技術建立含有目標蛋白質突變體的大腸桿菌菌群；再次將上述單鏈突變庫轉化含有目標蛋白質突變體的大腸桿菌菌群，形成更大庫容量的大腸桿菌菌群；再次轉化大腸桿菌的操作循環2?6次，構建含有目標基因突變的大腸桿菌突變庫；最后通過高效篩選或高通量篩選獲得目標蛋白質突變體。這一技術可應用于微生物基因原位進化，提高酶催化活性，并應用于提高微生物代謝產物的產率。
【專利說明】一種利用迭代同源重組體內進化目標蛋白質的新方法 發明領域
[0001] 本發明涉及一種利用迭代同源重組體內進化目標蛋白質的新方法，屬于生物技術 領域。
【背景技術】
[0002] 定向進化技術是一種在實驗室中模擬達爾文進化，進化出在自然界并不存在的或 是具有更優性質的蛋白質，并可以通過改變酶的催化效率改變代謝流，擴展或構建新的代 謝途徑，弱化或消除不必要或有害的代謝途徑，從而達到提高某種代謝產物產率或降解有 害物質的目的。定向進化技術主要有兩個步驟:首先利用現代分子生物學方法構建基因的 突變文庫，然后耦合篩選方法對文庫進行篩選。突變文庫的構建可以提供足夠的多樣性以 供篩選，是定向進化的關鍵步驟。按照DNA突變發生的場所，構建突變文庫的技術可以分為 體外突變和體內突變。
[0003] 體外突變手段通過易錯PCR、飽和點突變或DNA重排等標準實驗技術在感興趣的基 因上引入多樣性。體外突變手段可以有效得控制突變率和突變譜，而體內突變手段可以耦 合突變和篩選，并且可以繞開轉化效率瓶頸，避免費時費力的建庫，克隆，操作步驟。
[0004] 最常用的體內突變手段包括化學誘變劑，堿基類似物，紫外線和超突變菌株。化學 誘變劑產生的突變譜很窄，而且可能對人有致癌作用。紫外線輻射產生的突變譜很廣，而且 幾乎沒有序列偏好性。然而紫外線對細胞的殺傷作用限制了它的作用。最廣泛應用的體內 突變方法是使用超突變菌株比如XLl-Red。此菌株通過刪除和修飾DNA復制和修復相關基因 來提高突變概率，然而其突變頻率無法控制，基因不穩定，生長緩慢使得分離突變子較為困 難。
[0005] George Church實驗室發明了MAGE(多重自動基因組改造技術）。它同時針對基因 組的不同區域設計一系列的單鏈寡核苷酸，利用A-Red同源重組系統將這些寡核苷酸整合 到基因組上，實現單個細胞基因組多個位點的改造或細胞群體間基因組改造的多樣性。利 用該技術定向改造大腸桿菌中番茄紅素合成過程中的20個基因的RBS區域，設計不同的簡 并引物，使它們定向進化到認為可以提高表達量的經典的SD序列(TAAGGAGGT)，最終篩選得 到高產菌株。MAGE技術利用體外合成的90nt單鏈寡核苷酸達到高效同源重組的目的，且針 對的改造目標都是調芐基因，并沒有實現對蛋白質的結構基因進行定向進化。

【發明內容】

[0006] 本發明所要解決的技術問題是提供一種利用迭代同源重組體內進化目標蛋白質 的新方法。為此，本發明采用以下技術方案：
[0007] 構建一個80-100nt的單鏈核苷酸目標基因突變庫，通過A-Red同源重組技術，利用 所述突變庫對大腸桿菌基因組上的蛋白質基因進行原位迭代重組，構建較大庫容量的含有 目標基因突變的大腸桿菌突變庫，以較高的突變率達到進化酶分子結構提高酶催化效率的 目的。
[0008] 進一步地，所述方法為在體外構建目標蛋白質基因的TA克隆載體，以此載體為模 板，用error-prone PCR制備得到帶堿基突變的雙鏈核苷酸；以此雙鏈為模板，單引物PCR制 備得到帶突變的單鏈核苷酸；用DNase I把以上單鏈酶切并回收80-100nt片段構成目標蛋 白質的單鏈核苷酸目標基因突變庫。
[0009] 進一步地，所述迭代的步驟為：
[0010]以得到的單鏈核苷酸目標基因突變庫轉化大腸桿菌，通過A-Red同源重組技術建 立含有目標蛋白質突變體的大腸桿菌菌群，得到初始的含有目標基因突變的大腸桿菌突變 庫；
[0011] 將上述單鏈核苷酸目標基因突變庫轉化初始的含有目標基因突變的大腸桿菌突 變庫，得到新的含有目標基因突變的大腸桿菌突變庫，形成更大庫容量的大腸桿菌菌群，構 建成含有目標基因突變的大腸桿菌突變庫;或者：
[0012] 再用上述單鏈核苷酸目標基因突變庫轉化新形成的含有目標基因突變的大腸桿 菌突變庫，得到更新后的含有目標基因突變的大腸桿菌突變庫，以此不斷增加含有目標基 因突變的大腸桿菌突變庫的庫容量，構建含有目標基因突變的大腸桿菌突變庫。
[0013] 單鏈核苷酸的獲取方式包括但不限于T7逆轉錄法，核酸外切酶法，變性高效液相 色譜法，磁珠捕獲法，不對稱PCR，兩步PCR法等。
[0014] 80-100nt的單鏈核苷酸是通過降解長單鏈核苷酸的方式得到，它的獲取方式包括 但不限于DNase頂每切，超聲波破碎法等。
[0015] 單鏈核苷酸可以通過轉化或轉染的方式進入細胞內。轉化或轉染的方式包括但不 限于磷酸鈣法，氯化鈣法，脂質體轉染，電穿孔法，光穿孔法等。轉化介質包括但不限于水， 氯化媽，脂質體等。
[0016]在轉化或轉染之前，大腸桿菌細胞在30°C培養至一定濃度，并于42 °C進行誘導。在 細胞基因組上的A-Red同源重組系統在pL啟動子控制下，并受到cI857阻遏蛋白的調控。在 30°C時pL啟動子受阻遏不表達，42°C時誘導表達A-Red同源重組所需的三個蛋白。經過 15min誘導之后的細胞放于4°C保存，防止誘導的蛋白降解。
[0017] 培養基需要置換成轉化介質，去除其中的離子。此過程可以采用的方式包括但不 限于離心法，膜過濾法等。
[0018] 本發明為了在大腸桿菌基因組上實現較高的突變率并對一個或多個蛋白質基因 進行突變，通過迭代A-Red同源重組的策略，達到對蛋白質進化的目的。此方法可以對基因 組上單一基因進行進化，也可以同時對多個基因進行修飾，并耦合篩選，尋找出多個突變蛋 白協同作用所達到的最佳效果。
[0019] 本發明所提供的利用迭代同源重組進化目標蛋白質的新方法是有效獲得所需蛋 白質突變的方法，比以往的方法更加簡便、高效。
[0020] 本發明所提供的一種利用迭代同源重組體內進化目標蛋白質的新方法，通過突變 大腸桿菌基因組上1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)基因，提高大腸桿菌產番茄紅素 的水平。通過篩選得到5個1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶的突變體，其基因序列選自序列 表第SEQ ID勵.5、^).7、勵.9、^).11、^).13序列中的一種，分別提高了相應大腸桿菌合成 番茄紅素水平50 % -300 %。
[0021] 本發明所提供的一種利用迭代同源重組體內進化目標蛋白質的新方法，通過突變 大腸桿菌基因組上0s因子(Rpos)基因，提高大腸桿菌產番茄紅素的水平。通過篩選得到2個 0s因子突變體，其序列選自序列表第SEQ ID NO. 19、N0.21序列中的一種，分別提高了相應 大腸桿菌合成番茄紅素水平80 %和205 %。
【附圖說明】
[0022] 圖1:本發明流程示意圖。其中，Gene:基因；Error-Prone PCR:易錯PCR;Single Primer PCR:單鏈PCR;DNase I Digestion:DNase I酶切；cycles of Recombination:多次 重組;Genome:基因組;E ? co 1 i :大腸桿菌。
[0023]圖2:野生型及含DXS突變體的大腸桿菌菌株產番茄紅素能力對比圖；其中， Lycopene Production:番前紅素產量。
[0024]圖3:野生型及含Rpos突變體的大腸桿菌菌株產番茄紅素能力對比圖；其中， Lycopene Production:番前紅素產量。
【具體實施方式】
[0025] 本發明通過迭代同源重組的策略對大腸桿菌基因組上的結構基因進行突變，達到 對功能蛋白原位進化的目的，以下把這種策略應用到兩個直接在大腸桿菌基因組上進化蛋 白質的例子中，證實了本發明為有效地獲得所需蛋白質突變體的方法。本發明的操作流程 如圖1所示，兩個例子分別為突變大腸桿菌基因組上1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS) 基因和突變大腸桿菌基因組上^因子(Rpos)基因提高大腸桿菌中產番茄紅素的水平。
[0026] 實施例1，大腸桿菌基因組上突變1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)基因
[0027] 1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)是大腸桿菌異戊二烯合成途徑中一個關鍵 酶，以3-磷酸-甘油醛和丙酮酸為底物合成1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸，提高其催化效率可以 增強異戊二烯代謝流，并最終提高番茄紅素的產量。
[0028] 在大腸桿菌EcNR2(Harris H.Wang等?（2009)Nature.460:894_890)中引入外源基 因(3^￡，(：竹8，(^?，使得該大腸桿菌可以產番茄紅素。由于番茄紅素具有可見的紅色，可以 根據菌落紅色的深淺，高通量的篩選番茄紅素產量提高的菌株。
[0029] 體外制備80-100nt dxs基因單鏈突變庫：
[0030] 1、從大腸桿菌基因組上PCR得到dxs基因并與T載體連接，構建dxs基因的TA克隆載 體。
[0031] 2、用上引物dxs-for(SEQ ID NO. 1)和5'端磷酸化的下引物dxs_rev(SEQ ID 勵.2)兩個引物以〇^8基因的了六克隆載體為模板，在添加此2+的條件下，941€458,54 1€5〇8,72 °C 2min循環30次做易錯PCR，割膠純化回收得到的雙鏈核苷酸；
[0032] 3、以上述含有突變的雙鏈核苷酸為模板，在PCR體系中只添加上引物dxs-for(SEQ ID NO? 1)，94°C30s，53°C30s，72°C4min循環 15次，制備得到dxs單鏈核苷酸；
[0033] 4、用Lambda EX0外切酶處理上述得到的PCR產物，把其中的dxs雙鏈酶切成單鏈核 苷酸；
[0034] 5、乙醇沉淀上述得到的酶切產物，得到dxs單鏈核苷酸；
[0035] 6、用DNase頂每切上述得到的單鏈核苷酸，并切膠回收80-100nt的單鏈核苷酸片 段，構成單鏈突變庫。
[0036]迭代同源重組進化目標蛋白質：
[0037] 1、在50mL LB培養基的搖瓶中接入從平板上挑取的大腸桿菌單菌落，并加入25yL 卡那霉素，30 °C下搖床過夜培養；
[0038] 2、轉接1%的菌液至2mL LB培養基的試管中，置于30°C下搖床培養2.5-3h至0D達 到0.7左右；
[0039] 3、將試管置于42°C水浴中振蕩培養15min，誘導A-Red重組蛋白充分表達；
[0040] 將試管置于冰上5min;
[0041 ] 4、取lmL菌液移入1.5mL預冷離心管中，4°C下以13000r/min離心30s，棄去上清液， 加入預冷的無菌水lml重懸洗滌，棄去上清液，并用預冷的無菌水lml重懸洗滌2次；
[0042] 5、去除上清液，并用100此預冷無菌水重懸菌體，加入80-100nt dxs單鏈突變庫；
[0043] 6、將上述混合物轉移到2mm電轉杯中，在電容25yF，電壓2.5kV，電阻200 Q條件下 進行電擊；
[0044] 7、迅速將準備好的lml S0C培養基加入到電擊杯中，輕輕吹打使細胞懸浮。將電擊 杯中的混合液轉移到裝有lml培養基的試管中，放入30°C搖床培養，使細胞復蘇；
[0045] 8、當細胞復蘇到0D達到0.7左右時，重復上述步驟，進行第二輪轉化。該轉化過程 一共進行4輪；
[0046] 9、最后一輪電轉后，復蘇12h并涂板。在平板上篩選出紅色較深的菌落。野生大腸 桿菌菌株(野生型〇乂5基因序列56〇10勵.3;氨基酸序列5￡〇10勵.4)及含0乂5突變體的大 腸桿菌菌株(DXS-M1，DXS-M2，DXS-M3，DXS-M4，DXS-M5，DXS突變位點總結如表1所示)產番茄 紅素能力對比如圖2所示。
[0047] 表1 DXS突變位點總結
[0049] 從圖中可以看出，各株含有DXS突變體的大腸桿菌菌株的番茄紅素積累量相對于 野生型菌株都得到了提高，幅度在50 % -300 %。
[0050] 實施例2,大腸桿菌基因組上突變〇3因子(Rpos)基因
[0051] 〇s因子(Rpos)在大腸桿菌細胞中發揮著至關重要的作用，可以應答不同環境壓 力。因為番茄紅素的大量積累對大腸桿菌有毒性，突變〇 s因子可以使大腸桿菌更好地適應 壓力。
[0052] 體外制備80-100nt rpos基因單鏈突變庫：
[0053] 1、從大腸桿菌基因組上PCR得到Rpos基因并與T載體連接，構建Rpos基因的TA克隆 載體。
[0054] 2、用上引物rpos-for(SEQ ID NO. 15)和5'端磷酸化的下引物rpos_rev(SEQ ID 如.16)兩個引物以印〇8基因的了六克隆載體為模板，在添加血2+的條件下，941€458,54 1€ 50s，72°C 2min循環30次做易錯PCR，割膠純化回收得到的雙鏈核苷酸；
[0055] 3、以上述含有突變的雙鏈核苷酸為模板，在PCR體系中只添加上引物rpos-for (SEQ ID 從).15)，941€3〇8,531€3〇8,721€4111111循環15次，制備得到鄺〇8單鏈核苷酸 ；
[0056] 4、用Lambda EX0外切酶處理上述得到的PCR產物，把其中的rpos雙鏈酶切成單鏈 核苷酸；
[0057] 5、乙醇沉淀上述得到的酶切產物，得到rpos單鏈核苷酸；
[0058] 6、用DNase頂每切上述得到的單鏈核苷酸，并切膠回收80-100nt的單鏈核苷酸片 段，構成單鏈突變庫。
[0059] 迭代同源重組進化目標蛋白質：
[0060] 1、在50mL LB培養基的搖瓶中接入從平板上挑取的大腸桿菌單菌落，并加入25yL 卡那霉素，30 °C下搖床過夜培養；
[0061 ] 2、轉接1%的菌液至2mL LB培養基的試管中，置于30°C下搖床培養2.5-3h至0D達 到0.7左右；
[0062] 3、將試管置于42°C水浴中振蕩培養15min，誘導A-Red重組蛋白充分表達;將試管 置于冰上5min;
[0063] 4、取lmL菌液移入1.5mL預冷離心管中，4°C下以13000r/min離心30s，棄去上清液， 加入預冷的無菌水lml重懸洗滌，棄去上清液，并用預冷的無菌水lml重懸洗滌2次；
[0064] 5、去除上清液，并用100此預冷無菌水重懸菌體，加入80-100nt dxs單鏈突變庫；
[0065] 6、將上述混合物轉移到2mm電轉杯中，在電容25yF，電壓2.5kV，電阻200 Q條件下 進行電擊；
[0066] 7、迅速將準備好的lml S0C培養基加入到電擊杯中，輕輕吹打使細胞懸浮。將電擊 杯中的混合液轉移到裝有lml培養基的試管中，放入30°C搖床培養，使細胞復蘇；
[0067] 8、當細胞復蘇到0D達到0.7左右時，重復上述步驟，進行第二輪轉化。該轉化過程 一共進行6輪；
[0068] 9、最后一輪電轉后，復蘇12h并涂板。在平板上篩選出紅色較深的菌落。野生大腸 桿菌菌株(野生型Rpos的基因序列SEQ ID N0.17;氨基酸序列SEQ ID N0.18)及含Rpos突變 體的大腸桿菌菌株(Rp〇s-Ml，Rpos-M2，Rpos突變位點總結如表2所示)產番前紅素能力對比 如圖2所示。
[0069] 表2 Rpos突變位點總結

[0072] 從圖中可以看出，各株含有Rpos突變體的大腸桿菌菌株的番茄紅素積累量相對于 野生型菌株都得到了提高，幅度分別為80 % -205 %。
[0073] 序列：
[0074] SEQ ID N0.1 上引物dxs-for
[0075] 5 '-GAGTTTTGATATTGCCAAATACCCGACCCTGGC-3 '
[0076] SEQ ID N0.2 5'端磷酸化的下引物dxs-rev
[0077] 5 ' -TTATGCCAGCCAGGCCTTGATITTG-3 '（5 ' 端磷酸化）
[0078] SEQ ID N0.3 DXS基因序列
[0080] SEQ ID N0.4 DXS氨基酸序列







【主權項】
1. 一種利用迭代同源重組體內進化目標蛋白質的新方法，其特征在于它包括以下步 驟： 構建一個80-100nt的單鏈核苷酸目標基因突變庫，通過λ-Red同源重組技術，利用所述 突變庫對大腸桿菌基因組上的蛋白質基因進行原位迭代重組，構建含有目標基因突變的大 腸桿菌突變庫，達到進化酶分子結構提高酶催化效率的目的。2. 如權利要求1所述的一種利用迭代同源重組體內進化目標蛋白質的新方法，其特征 在于所述方法為在體外構建目標蛋白質基因的TA克隆載體，以此載體為模板，用error-prone PCR 制備得到帶堿基突變的雙鏈核苷酸； 以此雙鏈為模板，單引物 PCR 制備得到帶突 變的單鏈核苷酸；用DNase I把以上單鏈酶切并回收80-100nt片段構成單鏈核苷酸目標基 因突變庫。3. 如權利要求1所述的一種利用迭代同源重組體內進化目標蛋白質的新方法，其特征 在于所述迭代的步驟為： 以得到的單鏈核苷酸目標基因突變庫轉化大腸桿菌，通過λ-Red同源重組技術建立含 有目標蛋白質突變體的大腸桿菌菌群，得到初始的含有目標基因突變的大腸桿菌突變庫； 將上述單鏈核苷酸目標基因突變庫轉化初始的含有目標基因突變的大腸桿菌突變庫， 得到新的含有目標基因突變的大腸桿菌突變庫，形成更大庫容量的大腸桿菌菌群，構建成 含有目標基因突變的大腸桿菌突變庫;或者： 再用上述單鏈核苷酸目標基因突變庫轉化新形成的含有目標基因突變的大腸桿菌突 變庫，得到更新后的含有目標基因突變的大腸桿菌突變庫，以此不斷增加含有目標基因突 變的大腸桿菌突變庫的庫容量，構建含有目標基因突變的大腸桿菌突變庫。4. 如權利要求1所述的一種利用迭代同源重組體內進化目標蛋白質的新方法，其特征 在于所述方法通過突變大腸桿菌基因組上1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)基因，提 高大腸桿菌產番茄紅素的水平。5. 如權利要求1所述的一種利用迭代同源重組體內進化目標蛋白質的新方法，其特征 在于所述方法通過突變大腸桿菌基因組上〇s因子(Rpos)基因，提高大腸桿菌產番茄紅素的 水平。6. -種DXS基因，其序列選自序列表第SEQ ID N0.5、N0.7、N0.9、N0.11、N0.13序列中的 一種。7. -種Rpos基因，其序列選自序列表第SEQ ID N0.19、N0.21序列中的一種。
【文檔編號】C12N15/31GK105820990SQ201610079480
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2016年2月4日
【發明人】徐志南, 濮悅, 黃磊, 杭寶建, 董昌, 蔡瑾
【申請人】浙江大學