一種豬瘟病毒基因重組腺病毒載體疫苗兔體效力檢驗方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術檢測領域，具體涉及一種新型豬瘟病毒基因重組腺病毒載體 疫苗效力檢驗方法。
【背景技術】
[0002] 豬瘟（CSF)是由黃病毒科瘟病毒屬的豬瘟病毒（Classical swine fever virus， CSFV)引起的一種豬的高度接觸性傳染病，死亡率極高，給世界養豬業造成了巨大的經濟損 失。我國面對這樣烈性的染病一般都是采用疫苗和疫苗接種來提前預防，降低發病率和死 亡率。豬瘟疫苗的發展經歷了早期的滅活疫苗、弱毒疫苗、基因工程疫苗。目前廣泛使用 的是弱毒疫苗，我國批準使用的弱毒疫苗是由中國獸醫藥品監察所研制的豬瘟兔化弱毒疫 苗。長期以來，豬瘟兔化弱毒疫苗的普遍使用，使CSFV野毒株及兔化弱毒抗原發生了變異， 出現了慢性感染、隱性感染等非典型流行形式，很難區分豬群中的疫苗免疫豬和野毒感染 豬，致使疫情難以控制，或造成免疫失敗，這不但影響豬群中豬瘟的凈化，而且給出口造成 障礙。為此，研制更安全、更高效可以進行鑒別診斷的新型基因工程標記疫苗是全世界養豬 業的迫切要求。
[0003] 本實驗室從pMD18-T-E0質粒、pMD18-T-E2質粒中擴增編碼E0、E2基因，構建 重組腺病毒穿梭質粒pAd Track-E0、pAd Track-E2。通過PET32a載體將E0和E2基因 串聯，形成PET-E0-E2,然后再將E0-E2克隆到腺病毒穿梭載體上得到重組腺病毒穿梭 質粒pAd Track-E0-E2，轉化到大腸桿菌BJ5183感受態細胞中，得到重組腺病毒骨架載 體pAd Easy-E0-E2,轉染人胚胎腎細胞（HEK293)，獲得了含有目的基因的重組腺病毒 (rAd-E0-E2)〇
[0004] 疫苗效力是評價疫苗質量的關鍵指標。生物制品研發、生產企業由于生產疫苗批 次的不同，常常會導致最小免疫劑量有所差異。因此，對于每一種新研發出的疫苗有必要 建立一種有針對性的配套檢測該疫苗最小免疫劑量的方法。rAd-E0-E2作為本實驗室最 新研發的基因工程活載體疫苗，鑒于其沒有一個更加穩定、簡便、節省成本的疫苗效力評價 標準。為此，我們建立了一種用于rAd-E0-E2的兔體效檢模型，并確定其評價標準：將SPF 兔接種10倍梯度稀釋的rAd-E0-E2,14d后用豬瘟脾淋毒（1頭份）攻毒，通過攻毒兔的體 溫變化、脾重/體重指數比（％ )、脾臟病理組織變化、RT-PCR和IFA等評價方法共同判斷 rAd-E0-E2在兔體的免疫保護效力。該方法用小動物兔子代替了大動物豬，大大節省了生產 檢驗成本；而且該檢驗方法使用的兔子均為SPF兔（無外源病毒和抗體干擾），其生產性能 和質量標準較豬更加穩定，可以進行疫苗生產質量評價應用。

【發明內容】

[0005] 本發明的目的是提供一種新型豬瘟病毒基因重組腺病毒載體疫苗兔體效力檢驗 的方法，該方法主要按照如下步驟：
[0006] l.rAd-E0-E2凍干疫苗按照不同的稀釋梯度（107_°、106_°、10 5_°IFU/ml)免疫兔體后 第14天，用豬瘟脾淋毒（1頭份）接種兔的耳緣靜脈攻毒，于攻毒后連續3天每6h檢測兔 體反應熱；
[0007] 2.攻毒后第3天剖殺兔，稱兔體重和脾臟重量，計算兔脾臟/體重指數比；
[0008] 3.將兔脾臟放于10%福爾馬林固定、做組織切片，顯微鏡觀察兔脾病理學變化；
[0009] 4.將兔脾稱取lg提取脾臟總RNA，采用RT-PCR方法檢測豬瘟脾淋毒的存留情況；
[0010] 5.將兔脾組織低溫下研磨，通過0. 22um濾膜過慮除菌，濾液接種ST細胞，盲傳3 代后，進行IFA鑒定是否有豬瘟脾淋毒感染細胞；
[0011] 6.判定方法：當兔體溫均<40. 5°C、兔脾臟/體重指數比mean彡0.055%、兔脾 組織顯微觀察未出現充淤血、RT-PCR均檢測不到豬瘟脾淋毒基因存留和IFA病毒分離均為 陰性同時成立時，判為該疫苗保護兔體免受豬瘟脾淋毒的攻擊；當其中任何一項檢測均不 在此范圍內時，判為該疫苗未能保護兔免受豬瘟脾淋毒的攻擊。
[0012] 通過此方法來評價該疫苗的保護效力和最小免疫劑量為107_°IFU/ml，建立了 rAd-E0-E2兔體效力檢驗方法，可以更加穩定、簡便、節省成本的評價該疫苗的免疫效力，從 而彌補現有技術的不足。
【附圖說明】
[0013] 圖1:免疫前、后體溫測定及結果圖， 圖2 :攻毒前、后體溫測定及結果圖， 圖3 :攻毒后脾重/體重指數比圖， 圖4 :攻毒后脾臟病理變化圖。
【具體實施方式】 實施例1 :新型豬瘟病毒基因重組腺病毒載體疫苗兔體效力檢驗方法的建立
[0014] 1. 1試驗用毒、疫苗、試驗動物
[0015] 豬瘟重組腺病毒疫苗（rAd-E0-E2,彡2X 107_°IFU/瓶，測定方法詳見專利：張恒， 范根成，杜元釗，等.一種豬瘟病毒基因重組腺病毒載體疫苗病毒含量測定方法[P].中華 人民共和國國家知識產權局.CN 104535764 A，2015. 04. 22)，由青島易邦生物工程有限公 司技術中心凍干保存；豬瘟活疫苗（兔源）簡稱豬瘟脾淋毒，批號201401，20頭份/瓶，由 本公司凍干苗車間生產；1. 5~3kg健康易感家兔購自青島康大。
[0016] 1. 2免疫方法及免疫前、后體溫測定及結果
[0017] 體重為1. 5~3kg健康易感家兔28只，購回后第3d上下午，各測溫1次，連續測 3d，從28只兔子中挑選體溫波動不大的20只，隨機分成5組，每組4只，采用豬瘟脾淋毒作 為陽性對照組和生理鹽水作為陰性對照組，按照下表1進行免疫接種；同時上下午各測體 溫1次，連續測3d，測溫結果詳見圖1。
[0018] 表1免疫接種
[0019]
[0020] 1. 3攻毒前、后體溫測定及結果
[0021] 免疫后第14d攻毒，用無菌生理鹽水將每頭份豬瘟脾淋毒稀釋150倍，通過耳靜脈 注射給每組家兔，攻毒劑量為lml/只，攻毒前2天和攻毒當天上下午各測體溫1次，24小時 后，每隔6h測體溫1次，連續測3d至體溫恢復正常。結果詳見圖2。
[0022] 1.4攻毒后脾重/體重指數比
[0023] 將攻毒后體溫恢復正常的家兔稱重、剖殺取脾臟稱重，計算脾重/體重百分比 (% )，通過說明不同稀釋度的rAd-E0-E2和豬瘟脾淋毒免疫保護組與未保護對照組組的差 異是否顯著（P < 0. 05);經脾重/體重指數比分析發現，107_°IFU組與105_°IFU組、107_°IFU 組與對照組差異顯著（P〈〇.〇5);豬瘟脾淋苗組與105_°IFU組、豬瘟脾淋苗組與對照組異 顯著（P〈0. 05);然而，107_°IFU組與106_°IFU組、107_°IFU組與豬瘟脾淋苗組、10 6_°IFU組與 105_ °IFU組、106_ °IFU組與豬瘟脾淋苗組、106_°IFU組與對照組、105_°IFU組與對照組差異不顯 著（P>0.05)。（詳見圖 3)。
[0024] 1. 5攻毒后脾臟病理變化
[0025] 將脾臟做病理組織切片，觀察脾臟的病理變化。將攻毒后體溫趨于正常的兔子解 剖，取脾臟做石蠟切片，顯微鏡下觀看脾臟病理組織變化（圖4A-F)。10 7_°IFU組（圖4-A) 攻毒后脾組織切片未見充血、淤血；l〇6_°IFU組（圖4-B)攻毒后脾組織切片未見充血、淤血， 而10 6