人3型腺病毒展示載體及其構建方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種病毒展示領域，尤其一種人3型腺病毒展示載體；屬于生物醫學
技術領域。
【背景技術】
[0002] 人3型腺病毒顆粒，是一種無囊膜病毒，其為一種具有20面體對稱結構的的病毒 顆粒。其殼體由252個亞單位構成，其中240亞單位為6鄰體構成的三聚體，能夠刺激機體 產生中和抗體以及組合型特異抗體。
[0003] 人3型腺病毒衣殼蛋白包括六鄰體、五鄰體基座、纖突及蛋白IX。其中六鄰體是主 要的衣殼結構蛋白，其中位于表面的塔尖有7個高變區（HVRs)，包含有型特異性表位。生物 信息學分析表明HVR1、HVR2、HVR5和HVR7攜帶有潛在的中和抗原表位，適合通過基因工程 的方法來融合外源抗原表位，并同時規避宿主自身已存在的針對腺病毒載體的免疫反應。

【發明內容】

[0004] 本發明的目的在于提供一種快速、高效的人3型腺病毒展示載體及其該載體的構 建方法。
[0005] 為解決上述技術問題，本發明提供的前一技術方案如下：
[0006] 該人3型腺病毒展示載體，其特征在于，所述的載體6鄰體高變區HVR1位置含有 Sfil-pAD-CCDBl-Chloramphenicolresistance-Sfil序列SEQIDNO: 1〇
[0007] 上述的人3型腺病毒展示載體，所述人3型腺病毒6鄰體高變區HVR1含Golden gate位點。
[0008] 進一步的，上述的人3型腺病毒展示載體，所述HVR1位點含有兩個反向的Sfil位 點。
[0009] 進一步的，上述的人3型腺病毒展示載體，所述Goldengate位點含有如序列SEQ IDNO:2Chloramphenicolresistance篩選基因。
[0010] 進一步的，上述的人3型腺病毒展示載體，所述Goldengate位點含有如序列SEQ IDN0:3負向篩選基因CCDB1。
[0011] 本發明提供的另一個技術方案如下：
[0012] 該人3型腺病毒展示載體的構建方法，該方法是通過在人3型腺病毒6鄰體高 變區HVR1位點上插入兩個反向的Sfil位點，通過Goldengate的方法將外源核酸序 列插入到人3型腺病毒6鄰體高變區HVR1位點上，在兩個反向的Sfil位點之間，插入 pAD_CO)Bl-ChloramphenicolCassette，作為質粒構建的負向篩選基因，進行融合表達。
[0013] 與現有技術相比，本發明提供的人3型腺病毒展示載體本發明選擇HVR1區域，通 過克隆進去兩個反向Sfil位點，從而可以通過Goldengate的方法，將外源的肽段克隆到 這個位點，進行融合表達，可以快速、高效的構建載體。可用于疫苗的開發。
【具體實施方式】
[0014] 為了更好地理解本發明，下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，下面 實施例僅說明本發明，而不是用來限制本發明范圍。實施例中未提及的實驗方法，通常按照 常規方法操作。
[0015] 本發明提供一種人3型腺病毒展示載體，該人3型腺病毒展示載體，所述的載體6 鄰體高變區HVR1 位置含有Sfil-pAD-CCDBl-Chloramphenicolresistance-Sfil序列SEQ IDN0:l〇
[0016] 具體的說，該人3型腺病毒6鄰體高變區HVR1含Goldengate位點，兩個反向的 Sfil位點。所述Goldengate位點含有如序列SEQIDN0:2篩選基因Chloramphenicol resistance;所述Goldengate位點含有如序列SEQIDNO: 3負向篩選基因CO)Bl。
[0017] 實施例2
[0018] 本發明提供的另一個技術方案如下：
[0019] 該人3型腺病毒展示載體的構建方法，該方法是通過在人3型腺病毒6鄰體高 變區HVR1位點上插入兩個反向的Sfil位點，通過Goldengate的方法將外源核酸序 列插入到人3型腺病毒6鄰體高變區HVR1位點上，在兩個反向的Sfil位點之間，插入 pAD_CO)Bl-ChloramphenicolCassette，作為質粒構建的負向篩選基因，進行融合表達。
[0020] 具體制備方法如下：
[0021] 構建含有外源DNA的人3型腺病毒載體。
[0022] 1、人3型修飾腺病毒載體構建。基因合成包含Sfil-pAD-CCDBl-Chlorampheni col-Sfil的Modified-Hexon;然后用Clal和BamHI雙酶切合成的DNA片段和穿梭載體 PBR322-L/R，瓊脂糖凝膠電泳回收之后，將二者回收產物用T4DNA連接酶連接轉化感受態 細胞E.coliT0P10,經鑒定得到穿梭質粒pBR322-L/R-mHexon。
[0023] 2、重組腺病毒質粒pBRADdeltaE3GFP-mHexon的構建，穿梭質粒pBR322-L/ R-mHexon經EcoRI和Sail雙酶切獲得HexonL-mHexon-HexonR片段，pBRADdeltaE3GFP 經PacI和AvrII雙酶切去除原有的六鄰體基因，將兩個回收后的DNA片段同時轉化到 E.coliBJ5183進行重組，獲得重組子pBRADdeltaE3GFP-mHexon。最后將陽性重組克隆 pBRADdeltaE3GFP-mHexon轉化到E.coliT0P10 以提取質粒，并測序鑒定，如SEQIDN0:1 所示。
【主權項】
1. 一種人3型腺病毒展示載體，其特征在于，所述的載體6鄰體高變區HVRl位置含有 Sfil-pAD-CCDBl-Chloramphenicol resistance-SfiI 序列 SEQ ID NO: 1〇
2. 根據權利要求1所述的人3型腺病毒展示載體，其特征在于，所述人3型腺病毒6鄰 體高變區HVRl含Golden gate位點。
3. 根據權利要求1所述的人3型腺病毒展示載體，其特征在于，所述HVRl位點含有兩 個反向的SfiI位點。
4. 根據權利要求2所述的人3型腺病毒展示載體，其特征在于，所述Golden gate位點 含有如序列 SEQ ID N0:2Chloramphenicol resistance 篩選基因。
5. 根據權利要求2所述的人3型腺病毒展示載體，其特征在于，所述Golden gate位點 含有如序列SEQ ID NO:3負向篩選基因(XDBl。
6. 權利要求1所述的人3型腺病毒展示載體的構建方法，其特征在于，該方法是通過在 人3型腺病毒6鄰體高變區HVRl位點上插入兩個反向的SfiI位點，通過Golden gate的 方法將外源核酸序列插入到人3型腺病毒6鄰體高變區HVRl位點上，在兩個反向的SfiI 位點之間，插入pAD-CO)Bl-Chloramphenicol Cassette，作為質粒構建的負向篩選基因，進 行融合表達。
【專利摘要】本發明公開了一種人3型腺病毒展示載體及其構建方法，旨在提供一種快速和通量化展示的人3型腺病毒展示載體及其該載體的構建方法；所述的載體6鄰體高變區HVR1位置含有SfiI-pAD-CCDB1-Chloramphenicol resistance–SfiI序列SEQ ID NO:1；其構建方法是通過在人3型腺病毒6鄰體高變區HVR1位點上插入兩個反向的SfiI位點，通過Golden gate的方法將外源核酸序列插入到人3型腺病毒6鄰體高變區HVR1位點上，在兩個反向的SfiI位點之間，插入pAD-CCDB1-Chloramphenicol Cassette，作為質粒構建的負向篩選基因，進行融合表達；屬于生物醫學技術領域。
【IPC分類】C12N15-861, C12N15-66
【公開號】CN104651404
【申請號】CN201510125605
【發明人】霍依然, 李紅梅, 王文忠
【申請人】覃啟紅
【公開日】2015年5月27日
【申請日】2015年3月20日