人3型腺病毒展示載體高通量構建方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種人3型腺病毒展示載體的構建方法，具體地說，涉及一種人3型腺 病毒展示載體高通量構建方法，屬于生物醫學技術領域。
【背景技術】
[0002] 腺病毒顆粒，是一種無囊膜病毒，其為一種具有20面體對稱結構的的病毒顆粒。 其殼體由252個亞單位構成，其中240亞單位為6鄰體構成的三聚體，能夠刺激機體產生中 和抗體以及組合型特異抗體。
[0003] 之前我們發明了人3型腺病毒展示載體Golden gate的構建方法該，可以將外源 片段插入到腺病毒6鄰體高變區HVR1位置。但是，該方法是低通量的，因為單通道載體構 建工作，往往需要做大量的重復工作，工作重復性和無序性常常導致載體構建工作中出現 的樣本交叉污染，給工作造成極大不便。另外，隨著生物信息學的迅猛發展，目前高通量研 究工作逐漸增多。
【發明內容】
[0004] 針對上述不足，本發明的目的在于提供一種基于Goldgen gate技術的人3型腺病 毒展示載體高通量構建方法。
[0005] 為解決上述技術問題，本發明提供的技術方案是這樣的：
[0006] 該人3型腺病毒展示載體高通量構建方法，所述方法包括以下步驟：
[0007] 1)將PCR片段或者合成的核酸片段，純化后稀釋測定濃度20ng-50ng/ul ;
[0008] 2)將步驟1)的PCR片段或者合成的核酸片段轉移至96孔Golden gate反應預制 板，與配置在所述96孔Golden gate反應預制板混合液進行Golden gate反應；
[0009] 3)將步驟2) Golden gate反應產物轉移至感受態細胞板中，進行Golden gate反 應產物轉化；
[0010] 4)將步驟3) Golden gate反應產物轉化后的細胞轉移至大型LB固體培養基上，分 離單克隆抗體；
[0011] 5)挑取步驟4)制備的單克隆抗體，并培養后轉移至96孔PCR克隆鑒定預制板，進 行Golden gate反應產物克隆鑒定；
[0012] 6)將步驟5)鑒定后的陽性克隆轉移至96深孔板中，培養后提取克隆質粒，并測定 克隆質粒濃度；
[0013] 7)將質粒送測序。
[0014] 上述的人3型腺病毒展示載體高通量構建方法，步驟1)所述的純化采用微珠進行 純化。
[0015] 上述的人3型腺病毒展示載體高通量構建方法，所述微珠為磁性微珠。
[0016] 上述的人3型腺病毒展示載體高通量構建方法，每一份所述96孔Golden gate反 應預制板反應混合液為1 U L,包括如下重量組分：
[0017]
【主權項】
1. 一種人3型腺病毒展示載體高通量構建方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟： 1) 將PCR片段或者合成的核酸片段，純化后稀釋測定濃度20ng-50ng/ul ; 2) 將步驟1)的PCR片段或者合成的核酸片段轉移至96孔Golden gate反應預制板， 與配置在所述96孔Golden gate反應預制板混合液進行Golden gate反應； 3) 將步驟2) Golden gate反應產物轉移至感受態細胞板中，進行Golden gate反應產 物轉化； 4) 將步驟3) Golden gate反應產物轉化后的細胞轉移至大型LB固體培養基上，分離單 克隆抗體； 5) 挑取步驟4)制備的單克隆抗體，并培養后轉移至96孔PCR克隆鑒定預制板，進行 Golden gate反應產物克隆鑒定； 6) 將步驟5)鑒定后的陽性克隆轉移至96深孔板中，培養后提取克隆質粒，并測定克隆 質私濃度； 7) 將質粒送測序。
2. 根據權利要求1所述的人3型腺病毒展示載體高通量構建方法，其特征在于，步驟 1)所述的純化采用微珠進行純化。
3. 根據權利要求2所述的人3型腺病毒展示載體高通量構建方法，其特征在于，所述微 珠為磁性微珠。
4. 根據權利要求1所述的人3型腺病毒展示載體高通量構建方法，其特征在于，每一份 所述96孔Golden gate反應預制板反應混合液為1 μ L,包括如下重量組分： 余量為水。
5. 根據權利要求1所述的人3型腺病毒展示載體高通量構建方法，其特征在于，步驟 3) 中所述的感受態細胞板為96孔感受態細胞板。
6. 根據權利要求1所述的人3型腺病毒展示載體高通量構建方法，其特征在于，步驟 4) 中所述分離單克隆采用畫線方式分離。
7. 根據權利要求1所述的人3型腺病毒展示載體高通量構建方法，其特征在于，步驟 6)中所述克隆質粒采用96孔板質粒提取方法進行提取。
【專利摘要】本發明公開了一種人3型腺病毒展示載體高通量構建方法，旨在于提供一種基于Goldgen gate技術的人3型腺病毒展示載體高通量構建方法；其技術方案是：所述方法包括以下步驟：1)將PCR片段或者合成的核酸片段，純化后稀釋測定濃度；2)轉移至96孔Golden gate反應預制板，與配置在所述96孔Golden gate反應預制板混合液進行Golden gate反應；3)反應產物轉移至感受態細胞板中，進行Golden gate反應產物轉化；4)將細胞轉移至大型LB固體培養基上，分離單克隆抗體；5)挑取單克隆抗體，并培養后轉移至96孔PCR克隆鑒定預制板，進行Golden gate反應產物克隆鑒定；6)轉移至96深孔板中，培養后提取克隆質粒，并測定克隆質粒濃度；7)將質粒送測序；屬于生物醫學技術領域。
【IPC分類】C12N15-861, C12N15-64
【公開號】CN104673833
【申請號】CN201510125522
【發明人】霍依然, 李紅梅, 王文忠
【申請人】覃啟紅
【公開日】2015年6月3日
【申請日】2015年3月20日