改進的腺病毒配制品的制作方法
【專利說明】改進的腺病毒配制品 發明領域
[0001]本發明設及用于例如基因療法和/或疫苗應用的腺病毒配制品和相關的藥用產 品。具體地而言，在此披露了針對腺病毒的液體配制品，當存放在約2°C-8°C范圍或更高范 圍時，同時還與腸胃外給予相容，該液體配制品通過保留所含有的腺病毒的數量、效力(感 染性)和質量改進了腺病毒的穩定性。 巧00引發明背景
[0003] 腺病毒載體被認為是用于基因送遞的最有效并廣泛使用的運載體。在基因療法和 疫苗研究的領域中一個持續性挑戰是產生液體腺病毒配制品，運些腺病毒配制品能夠在藥 用產品的現實儲存溫度范圍內，如從約2°C至約8°C，穩定運些病毒較長的時間。
[0004] 腺病毒的生物活性取決于由二十面體外殼結構包圍的核巧酸的至少一個核屯、序 列的構象的完整性，該二十面體外殼結構由衣殼蛋白組成。不同于傳統有機和無機藥物，運 些是非常復雜的生物結構和小化學或物理壓力源，可W促進腺病毒粒子的降解。因此，為了 確保合理的保質期，腺病毒制劑的良好配制品是至關重要的，但是穩定運些載體帶來了特 殊的挑戰。腺病毒可能由于物理不穩定性而失去效力，運些物理不穩定性包括變性、聚集 (可溶的和不溶解的聚集體形成）、沉淀和吸附，連同化學不穩定性，運些化學不穩定性包括 水解、脫酷胺、和氧化。任何運些降解途徑可W導致降低的生物活性，但是還可潛在地導致 具有增加的毒性、和/或改變的免疫原性的副產物或衍生物的形成。
[000引因此，它需要專口定制的方法找到腺病毒的穩固的配制品，確保在較寬的條件范 圍內的穩定性。將需要對緩沖液類型、抑和專業的賦形劑進行細致地優化，W保持腺病毒化 學、物理和生物學上的穩定性。鑒于可W變化的所有因素，發現用于配制腺病毒的最佳條件 承受著挑戰，并且良好配制品的組合物是先驗不可預知的。
[0006] 凍干配制品存在并且是穩定的。然而，它們往往是相對昂貴的，在給予前需要費時 的處理，并且效力在凍干過程中可能在一定程度上有所損失。存在在冷凍條件(-80°C)穩定 的液體配制品，但是運些需要專口的裝運和昂貴的膽存設施，使得可靠冷鏈幾乎是不可能 的，尤其是在分配網絡的周邊。因此，針對腺病毒的優選配制品是一種液體配制品，該液體 配制品在2°C-8°C之間或更高的溫度范圍提供腺病毒穩定性。運種配制品可W存儲在普通 的冰箱，并且可W快速并容易地給予。
[0007] 之前已經描述了針對腺病毒的液體配制品，例如在埃文斯化vans)等人(2004)中。 在所述申請中例不的最佳配制品是具有抑范圍在7.5和8.5之間的Tris緩沖配制品。我們在 此已經發現針對腺病毒所述配制品是次優的。在WO 00/29024中還披露了針對腺病毒的配 制品，其主要設及凍干技術。其他包括多元醇的腺病毒配制品在WO 00/29024中提到。
[0008] 因此，在本領域存在找到W下配制品的需要，運些配制品在延長的時期內通過保 留所含有的腺病毒的數量和效力改進腺病毒的穩定性。腺病毒穩定性還應當在運輸過程中 的攬拌應激的情況下，或生產或臨床使用過程中的剪切力的情況下，并且在廣泛的氣候條 件下，特別是在升高的溫度下或反復凍/融循環后仍然保持。此外，該配制品應當適用于預 期給予途徑，應當被很好地耐受并且應當優選具有含盡可能少的組分的組合物。本發明的 目的是提供此類針對腺病毒的配制品。 巧009] 發明概述
[0010] 我們已經發現了并且在此描述了 W下針對腺病毒的配制品，與之前披露的配制品 相比，運些針對腺病毒的配制品通過保留腺病毒的數量和效力(感染性)改進了腺病毒的穩 定性。很明顯，具有抑范圍在5.5和6.5之間的巧樣酸鹽緩沖液與徑丙基-0-環糊精化BCD)的 組合產生了出色的用于保留腺病毒的數量、效力(感染性)和質量的配制品，于此與本領域 已知的其他配制品相比改進了整體腺病毒穩定性。
[0011] 與用于配制品開發的所有賦形劑一樣，在根據本發明的配制品中存在的組分中的 一些單獨地在現有技術中引用。然而，它是若干組分的非常特定的組合，該組合為本發明配 制品提供了其優秀的特性和穩定化潛能。根據本發明的確切的配制品未披露于現有技術 中。此外，它是無法預見的，基于在運固有不可預測的領域中的現有技術，所述配制品將對 腺病毒提供運種改進的穩定性。
[0012] 因此，本發明設及可W例如用于基因療法和/或疫苗應用的穩定化的腺病毒配制 品和相關的藥物產品。
[001引根據本發明的配制品包括抑處于在5.5和6.5之間范圍內的巧樣酸鹽緩沖液，并進 一步包括徑丙基-e-環糊精化BCD)。該配制品另外包括鹽和非離子型洗涂劑。可任選地，根 據本發明的配制品進一步包括2-碳醇或4-碳醇。本發明的腺病毒配制品適合在2°C至8°C或 者含-65°C下長期儲存，持續超過6個月、1年、1.5年、2年、或更久。
[0014]本發明的腺病毒配制品包括在b)巧樣酸鹽緩沖溶液中的a)重組腺病毒，該巧樣酸 鹽緩沖溶液進一步包括C)徑丙基-0-環糊精化BCD) ;d)鹽；W及e)非離子型洗涂劑。為了保 持腺病毒的穩定性，必要的是此配制品的抑范圍在5.5和6.5之間。
[001引優選地，根據本發明的配制品包括滴度范圍在約1X107VpAiL和1 Xl 0i3vp/mL之間的 腺病毒。
[0016] 在根據本發明的一個優選實施例中，配制品中的巧樣酸鹽濃度范圍在約5mM和 30mM之間。
[0017] 徑丙基-0-環糊精化BCD)是優選的冷凍保護劑。皿CD優選W范圍在約1 % (w/w)和 10% (w/w)之間的濃度存在。
[001引氯化鋼(NaCl)是優選的鹽，其優選W范圍在約20mM和200mM之間的濃度存在。
[0019] 聚山梨醋-80是優選的非離子型洗涂劑，其優選具有范圍在約0.005% (w/w)和 0.5%(w/w)之間的濃度。
[0020] 在根據本發明的更優選的實施例中，該配制品具有范圍在約5.7和6.3之間的pH， 并且包括濃度范圍在約5和30mM之間的巧樣酸鹽;濃度范圍在l%(w/w)和10%(w/w)之間的 皿CD;濃度范圍在20mM和200mM之間的NaCl;濃度范圍在約0.01%(w/w)和0.05%(w/w)之間 的聚山梨醋-80。
[0021] 在根據本發明的另一個優選實施例中，該配制品具有范圍在約5.8和6.2之間的 pH，并且包括濃度范圍在約15和25mM之間的巧樣酸鹽;濃度范圍在3%(w/w)和8%(w/w)之 間的皿CD;濃度范圍在SOmM和IOOmM之間的化Cl;濃度范圍在約0.0 l % (w/w)和0.03% (w/w) 之間的聚山梨醋-80。
[0022] 在一個甚至更優選的實施例中，根據本發明的配制品抑約為6,并且包括濃度約為 20mM的巧樣酸鹽;濃度約為5%(w/w)的皿CD;濃度約為75mM的化Cl;濃度約為0.02%(w/w) 的聚山梨醋-80。
[0023] 在此證實了，添加 2-碳醇或4-碳醇（具體地而言是乙醇）到本發明的配制品中，出 乎意料地有力保護了腺病毒抵抗凍/融損害并且因此充當冷凍保護劑。
[0024] 因此，在一個優選的實施例中，根據本發明的配制品進一步包括2-碳醇或4-碳醇。 在一個甚至更優選的實施例中，根據本發明的配制品包括乙醇。該乙醇濃度優選在約0.1% (w/w)至l%(w/w)之間的范圍內。
[0025] 在根據本發明的一個優選實施例中，該配制品具有范圍在約5.7和6.3之間的pH， 并且包括濃度范圍在約5和30mM之間的巧樣酸鹽;濃度范圍在l%(w/w)和10%(w/w)之間的 皿CD;濃度范圍在20mM和200mM之間的NaCl;濃度范圍在約0.01%(w/w)和0.05%(w/w)之間 的聚山梨醋-80; W及濃度范圍在約0.2% (w/w)和0.6% (w/w)之間的乙醇。
[0026] 在根據本發明的另一個優選實施例中，該配制品具有范圍在約5.8和6.2之間的 pH，并且包括濃度范圍在約15和25mM之間的巧樣酸鹽;濃度范圍在3%(w/w)和8%(w/w)之 間的皿CD;濃度范圍在SOmM和IOOmM之間的化Cl;濃度范圍在約0.0 l % (w/w)和0.03% (w/w) 之間的聚山梨醋-80; W及濃度范圍在約0.2% (w/w)和0.6% (w/w)之間的乙醇。
[0027] 在一個甚至更優選的實施例中，根據本發明的配制品抑約為6,并且包括濃度約為 20mM的巧樣酸鹽;濃度約為5%(w/w)的皿CD;濃度約為75mM的化Cl;濃度約為0.02%(w/w) 的聚山梨醋-80; W及濃度約為0.4 % (w/w)的乙醇。
[0028] 在另一個優選的實施例中，根據本發明的配制品抑約為6,并且包括濃度約為20mM 的巧樣酸鹽;濃度約為5 % (w/w)的皿CD;濃度約為SOmM的化Cl;濃度約為0.025 % (w/w)的聚 山梨醋-80; W及濃度約為0.4 % (w/w)的乙醇。
[0029] 在一個甚至更優選的實施例中，根據本發明的配制品抑約為6,并且包括濃度約為 20mM的巧樣酸鹽;濃度約為5% (w/w)的皿CD;濃度約為SOmM的NaCl;濃度約為0.025 % (w/w) 的聚山梨醋-80; W及濃度約為0.4 % (w/w)的乙醇。
[0030] 在本發明的另一個優選的實施例中，運些配制品是(冷凍的）液體配制品。在又另 一個實施例中，本發明的配制品適用于腸胃外使用。
[0031] 在一個實例中，根據本發明的配制品包含在小瓶中。在另一個實施例中，運些配制 品包含在袋或瓶中。在又另一個實施例中，運些配制品包含在注射器或藥筒中。
[0032] 本發明還設及一種保存腺病毒的方法，該方法包括制備根據本發明的配制品。
[0033] 在又另一個實施例中，本發明設及一種保存腺病毒的方法，該方法包括制備如在 此描述的配制品并且將所述配制品儲存在范圍在2°C和8°C之間的溫度下。
[0034] 在寬溫度范圍內的增強的長期穩定性導致在此披露的病毒配制品的保質期延長， 允許運些配制品在優選約1-2年期間內或更長時間儲存W及最終的宿主給予，伴隨著可接 受的病毒效力的損失（即，在2°C-8°C下每兩年不超過0.31og)。此外，本發明的配制品在暴 露于升高的溫度、延長的凍融循環和攬拌期間顯示出穩定性。
【附圖說明】
[003引圖1.在配制品B(空屯、菱形)和對照配制品（實屯、圓）中，在25°C下，在加速溫度過程 中，Ad26的效力（Wlog lU/mL計)損失（A )。顯示了平均A效力(n = 4)，反映了效力端-效 力礎漲捕。已經通過QPA測量效力。
[0036]圖2.在配制品B(空屯、菱形)和對照配制品（實屯、圓）中，在25°C下，在加速溫度過程 中，Ad35的效力（Wlog lU/mL計)損失（A )。顯示了平均A效力(n = 4)，反映了效力端-效 力礎漲捕。已經通過QPA測量效力。
[0037 ] 圖3.在配制品B和對照配制品中的Ad26的熱烙點。在t = 0樣品上針對Ad26進行TMA (熱烙解測定)分析(n = 3)。
[003引圖4.在配制品B和對照配制品中的Ad35的熱烙點。在t = 0樣品上針對Ad35進行TMA (熱烙解測定)分析(n = 3)。
[0039] 圖5.在具有或不具有化Cl、邸TA、乙醇及其組合的情況下，在25°C下，在69天后，配 制品B中的Ad26的A Ct( A Ct)值。A Ct值與效力損失直接相關，其中較高的數量意指較多的 效力損失。
[0040] 圖6.在具有或不具有化Cl、邸TA、乙醇及其組合的情況下，在35°C下，在16天后，配 制品B中的Ad26的A Ct( A Ct)值。A Ct值與效力損失直接相關，其中較高的數量意指較多的 效力損失。
[0041] 圖7 .在具有或不具有化Cl、EDTA、乙醇及其組合的情況下，在30次凍/融循環隨后 攬拌1天后，配制品B中的Ad26的A Ct( A Ct)值。A Ct值與效力損失直接相關，其中較高的數 量意指較多的效力損失。
[0042] 圖8.在具有或不具有化CUEDTA、乙醇及其組合的情況下，t = 0(實屯、環）的、在25 °C下持續69天(空屯、菱形）的、在35°C下持續16天(實屯、S角）的和30次凍/融循環隨后攬拌 (空屯、S角）的配制品B中，在350nm下，通過Ad26的吸光度測量的比濁法。
[0043] 圖9.在具有或不具有化CUEDTA、乙醇及其組合的情況下，t = 0(實屯、環）的、在25 °C下持續69天(空屯、菱形）的、在35°C下持續16天(實屯、S角）的和30次凍/融循環隨后攬拌 (空屯、立角）的配制品B中，Ad26的內源巧光