一種復制缺陷型人55型腺病毒載體及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種復制缺陷型人55型腺病毒載體及其制 備方法和應用。
【背景技術】
[0002] 腺病毒（Adenovirus，Ad)是雙鏈DNA病毒，其基因組長度約35-40kb。已知人腺病 毒分為7個亞群（A~G)，包括60多個血清型，其中B亞群中的3、4、7、14型腺病毒感染后 可引起急性呼吸道疾病甚至致死性肺炎。近年來，出現了由11、14型腺病毒重組產生的55 型腺病毒（以下簡稱Ad55)，已導致一系列社區獲得性肺炎疫情甚至死亡病例。但是，尚無 抗Ad55感染的特效藥物及疫苗，臨床上只能采取支持性治療。因此，研發抗Ad55的疫苗及 藥物，對于控制Ad55在廣大人群尤其是入伍新兵、青少年學生等人群中的傳播至關重要。
[0003]目前，抗腺病毒感染的疫苗僅在美國軍隊獲得使用。該疫苗為野生型Ad4、Ad7在 人胚腎二倍體成纖維細胞上傳代，經冷凍脫水、混和纖維素乳糖等制成的腸溶型膠囊，為口 服活病毒疫苗。該疫苗的使用有效遏制了美軍腺病毒感染疫情的爆發。但是，美軍使用的 腺病毒疫苗尚存在極大的缺陷，一方面，該疫苗主要預防Ad4、Ad7的感染，而對致病力極強 的Adl4、Ad55等無確切的預防效果；另一方面，該疫苗主要成分為野生型腺病毒，安全性較 差，殘余活病毒從腸道排出后極易污染水源，造成病毒的擴散，因而不能應用于普通人群。 因此，研制安全性高并能預防Ad55等強毒株的復制缺陷型腺病毒疫苗是迫在眉睫的需求。
[0004] 已有研宄顯示，腺病毒E1基因是其復制增殖的必需基因，E3基因則可以對抗宿主 的免疫系統。敲除El、E3基因后，腺病毒在正常人體內喪失復制能力，具有減毒表型，而其 主要的表面抗原如Hexon、Fibre等則不受影響。因此，采用復制缺陷的腺病毒作為疫苗可 有效提升其安全性，擴大其使用范圍。復制缺陷型腺病毒可在互補細胞株，如表達Ad5El基 因的293細胞、PerC6細胞中生產。但是，很多腺病毒尤其是B亞群腺病毒，敲除El、E3基 因后在這些生產細胞株中難以獲得有效產量，主要原因是Ad5ElB 55K不能與B亞型腺病毒 E40rf6相互作用，不能有效抑制宿主細胞mRNA的出核并提升病毒晚期蛋白的表達。
[0005] 復制缺陷型Ad55還可作為基因載體在基因治療、疫苗等領域獲得廣泛應用。腺病 毒載體在這些領域具有一系列優勢，如良好的安全性、基因轉導的有效性以及方便的大規 模生產能力等。基于這些優勢，全球范圍內已有數百項臨床試驗以腺病毒作為基因載體，居 各類載體之首（24.8%)。這些研宄大部分采用Ad5或Ad2作為載體。然而，多數人體內 由于既往腺病毒感染而產生的抗腺病毒免疫反應限制了傳統腺病毒載體的應用。研宄表 明非洲、南美及我國等發展中國家和地區的人群中Ad2、Ad5中和抗體陽性率很高，甚至超 過90%。這些中和抗體會抑制腺病毒載體進入機體細胞，使其難以行使免疫或治療功能。 為克服預存抗腺病毒免疫反應，研宄者已開發一系列技術如：1)采用免疫抑制劑如環孢霉 素、環磷酰胺、FK506等抑制抗腺病毒免疫反應；2)修飾或改造腺病毒載體表面蛋白，繞開 預存中和抗體；3)我們此前開發的以腺病毒體外感染PBMC然后自體回輸的AVIP技術；等 等。但是這些策略或者具有相當高的毒副作用（如免疫抑制劑），或者僅能使用一次即因產 生針對新載體的免疫反應而不能繼續重復使用。

【發明內容】

[0006] 本發明所要解決的技術問題是，為了克服現有技術的上述問題，提供一種復制缺 陷型人55型腺病毒載體。
[0007] 本發明所要解決的上述技術問題通過以下技術方案予以解決：
[0008] -種復制缺陷型人55型腺病毒載體，由如下方法制備得到：通過敲除Ad55的E1、 E3基因，再將Ad55基因組中的E4基因開放閱讀框6或開放閱讀框2、3、4、6、6/7改換為Ad5 基因組的相應閱讀框。
[0009] 優選地，所述的復制缺陷型人55型腺病毒載體，還在Ad55的E1基因區域整合外 源基因表達框。
[0010] 一種復制缺陷型人55型腺病毒載體的制備方法，包含如下步驟：
[0011] S1.PCR擴增Ad55El區同源重組臂并反向連接至卡那霉素抗性載體，線性化后與 經部分酶切線性化的pAd55 A E3同源重組，得到基因組質粒pAd55 A El A E3-Kana ;
[0012] S2.PCR擴增Ad55El區同源重組臂并同向連接至卡那霉素抗性載體，線性化后與 線性化的pAd55 A El A E3_Kana同源重組，得到基因組質粒pAd55 A El A E3;
[0013] S3. PCR 擴增 Ad5E40rf2-6、Ad55E4 基因，以 Ad5E40rf2-6 取代 Ad55E4 基因中相 應區域得到P55E4 (5E4)，線性化后與線性化的pAd55 A El A E3同源重組，得到基因組質粒 pAd55 AE1 AE3(5E4)；
[0014]S4. PCR擴增Ad5E40rf6，以其取代步驟S3.所述Ad55E4基因的相應區域得 到p55E4 (50rf6)，線性化后與線性化的pAd55 A El A E3同源重組，得到基因組質粒 pAd55 AE1 AE3(50rf6)。
[0015] 優選地，步驟S1.的具體方法為：
[0016] 以Ad55基因組為模板，PCR擴增得到E1基因同源重組臂L-delEl及R-delEl，酶 切后連接至pVax載體得到pVax-delEl (L+R)，線性化后，與經部分酶切線性化的pAd55 A E3 同源重組，經氨芐青霉素、卡那霉素雙抗性篩選得到敲除E1、E3基因并引入唯一酶切位點 Pmel 的基因組質粒 pAd55 A El A E3_Kana〇
[0017] 最優選地，在其中一個實施例中，步驟SI.的具體方法為：
[0018] 以Ad55基因組為模板，PCR得到E1基因上下游重組臂L-delEl及R-delEl， L-delEl以Spel+EcoRI雙酶切后連接至同樣酶切的pVax載體得到pVax-L-delEl ;R-delEl 以EcoRI+Xbal雙酶切后連接至同樣酶切的pVax-L-delEl得到敲除El基因的穿梭質粒 pVax-delEl(L+R)；
[0019] pVax-delEl (L+R)以EcoRI線性化，pAd55 AE3以PacI部分酶切線性化，兩者同源 重組并經雙抗性篩選得到基因組質粒pAd55 A El A E3_Kana。
[0020] 優選地，步驟S2.的具體方法為：
[0021] 以Ad55基因組為模板，PCR擴增得到E1基因同源重組臂L-delK (E1)及 R-delK (E1)，酶切后連接至pVax載體得到pVax-delK (E1)，線性化后與線性化的 pAd55 AE1 AE3-Kana同源重組，得到去除El、E3、卡那霉素基因并引入唯一酶切位點Pmel 的基因組質粒pAd55 A El A E3。
[0022] 最優選地，在其中一個實施例中，步驟S2.的具體方法為：
[0023] 以Ad55基因組為模板，PCR得到E1基因上下游重組臂L-delK及R-delK，L-delK 以Spel+EcoRI雙酶切后連接至同樣酶切的pVax載體得到pVax-L-delK(El) ;R-delK以 EcoRI+Xbal雙酶切后連接至同樣酶切的pVax-L-delK(El)得到敲除卡那霉素抗性基因的 穿梭質粒 pVax-delK(El);
[0024] pVax-delK(El)以 Spel+Xbal 雙酶切線性化，pAd55 AE1 AE3_Kana 以 Pmel 線性 化，兩者同源重組得到去除卡那霉素抗性基因并在原El區引入唯一酶切位點Pmel的基因 組質粒 pAd55AEl AE3。
[0025] 優選地，步驟S3.的具體方法為：
[0026] 分別以Ad5、Ad55基因組為模板，PCR擴增得到Ad5E40rf2-6以及Ad55E4,將 Ad55E4連接至T載體得到p55E4,進一步以p55E4為模板PCR去除Ad55E40rf2-6,然后與 Ad5E40rf2-6連接得到p55E4 (5E4)，線性化后與線性化的pAd55 A El A E3同源重組，得到 pAd55 AE1 AE3(5E4) 〇
[0027] 最優選地，在其中一個實施例中，步驟S3.的具體方法為：
[0028] 以Ad5、Ad55基因組為模板，PCR擴增得到Ad5E40rf2-6、Ad55E4基因，分別連接至 T載體得到p50rf2-6、p55E4 ;以p55E4為模板，PCR去除Ad55的E40rf2-6并引入SapI位 點，兩者經SapI酶切、連接得到p55E4(5E4);
[0029] p55E4(5E4)以 Pmel+Mlul 雙酶切，pAd55 AE1 AE3 以 Psil 酶切，重組得到已將 Ad55E40rf2-6 置換為 Ad5E40rf2-6 的基因組質粒 pAd55 A El A E3 (5E4)。
[0030] 優選地，步驟S4.的具體方法為：
[0031] 以Ad5基因組為模板，PCR擴增得到Ad5E40rf6,將p55E4經PCR去除Ad55E40rf6， 兩者連接得到P55E4 (50rf6)，線性化后與線性化pAd55 A El A E3同源重組，得到 pAd55 AE1 AE3(50rf6)。
[0032] 最優選地，在其中一個實施例中，步驟S4.的具體方法為：
[0033]以 p50rf2-6、p55E4 為模板，PCR得到 Ad5E40rf6 并引入 SapI 位點，并在 p55E4 中 去除Ad55E40rf6,兩者經SapI酶切連接得到p55E4(50rf6);
[0034] p55E4(50rf6)以 Pmel+Mlul 雙酶切，pAd55 AE1 AE3 以 Psil 雙酶切，重組得到已 將 Ad55E40rf6 置換為 Ad5E40rf6 的基因組質粒 pAd55 A El A E3 (50rf6)。
[0035] 一種復制缺陷型人55型腺病毒載體的制備方法，還包含如下步驟：
[0036] S5.以Ad55基因組為模板PCR得到E1區同源重組臂SE1L、SE1R，酶切 并連接至pVax載體得到pSElLR ;以pGAl-EGFP為模板PCR得到外源基因表達框 CMV-EGFP-BGH，與pSElLR經酶切、連接得