帶有標記基因的Tet-on誘導過表達的重組載體及構建方法
【專利摘要】本發明屬于生物技術領域，涉及一種帶有標記基因的Tet?on誘導過表達的重組載體及構建方法，其特征在于：核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本發明構建了成本低而高效的載體系統及其相應的轉基因方法來建立轉基因細胞系，并通過可控誘導目的外源基因過表達來觀察該基因在多能干細胞向造血分化過程中可能發揮的效應和功能。本發明中的載體也能夠很好的應用于其他細胞或模式動物的轉基因操作，以簡化遺傳研究的方法。
【專利說明】
帶有標巧基因的Tet-on誘導過表達的重組載體及構建方法
技術領域
[0001] 本發明屬于生物技術領域，設及一種帶有標記基因的Tet-on誘導過表達的重組載 體及制備方法。
【背景技術】
[0002] 現有的基因過表達載體主要有慢病毒載體，還原病毒載體，類腺病毒載體，轉座子 載體和非整合質粒等。從建立穩定轉基因細胞系的角度來看，整合載體是最適合于轉基因 方法研究基因功能的。目前最有效的整合載體是慢病毒載體和轉座子載體PiggyBac。
[0003] 慢病毒載體最大的優點是侵染效率和整合效率高，足夠高的滴度條件下幾乎可W 使全部目標細胞受到轉染，包括一些很難轉染的細胞型。但它的缺點也是很明顯：
[0004] (1)首先它有物種特異性，受制于受體特異性，一般而言只能轉染人類細胞；即使 經過基因改造，其應用的范圍一般也不超過哺乳動物，應用面有限；
[0005] (2)載體本身體積太大而載體容量小，不能滿足很多分子遺傳學操作的需要；
[0006] (3)包裝困難且花費高昂，往往針對特定基因的包裝十分艱難甚至不可能，導致研 究方法的不可預見性，運是慢病毒載體的一個致命弱點；
[0007] (5)慢病毒載體整合到基因組W后很容易被基因沉默，其基因表達強度和持續性 往往較弱并且只在少數細胞群中有表達。
[000引基于轉座子原理的載體系統，包括PiggyBac,Sleeping Beauty等等，其中效率最 高的是PiggyBac載體。WSBI公司生產的PB系列載體為例，作為基于PiggyBac的表達載體， 具有如下的顯著優點：
[0009] (1)沒有物種和細胞型的限制，可W轉染幾乎所有的模式生物和細胞類型；
[0010] (2)可W用脂質體、憐酸巧沉淀法或電轉化方法轉化各種細胞，也可W注射受精 卵，一般轉染效率都很高；
[0011] (3)無需包裝步驟，省時省力，而且幾乎可W成功表達各種類型序列的表達框，基 本沒有序列特異性的問題，最大程度降低了研究進度的不可預見性，比慢病毒系統大大節 省了時間，精力和花費；
[0012] (4)由于PB系列載體都含有特定的隔離子（insulator)保護，表達框不易被失活而 且表達持續而穩定，任何時期和任何類型細胞里都可W成功表達；
[0013] (5)載體容積很大，插入片段可W達到1業bW上，可W滿足目前絕大多數分子遺傳 學研究的需要，也為后續衍生載體的開發提供了巨大空間；
[0014] (6)載體體積相對較小，易于分子克隆操作，載體的重組變異可能性要小于病毒載 體。
[0015] (7)該系統配套的轉座酶表達載體經過人源化改造，是目前重組效率最高的 PiggyBac轉座酶，配套使用整合效率很高。
[0016] 但它的缺點在于該載體沒有現成的適合我們需要的商品化Tet-on誘導表達系統， 重新改造載體工作量又相當大；
[0017] 本發明中的造血分化研究是從人類多能干細胞化PSC)開始向造血分化的，由于該 類細胞具有極其強烈的對于外源基因和載體表達的沉默特性，成為最難構建轉基因細胞系 的細胞種類。同時hPSC對慢病毒的轉導非常抗拒和敏感，極易導致基因沉默和細胞死亡W 及分化，難W有效應用已經極為成熟的慢病毒體系來實現基因的功能研究。而從hPSC向造 血分化過程中，會出現很多種細胞型，需要在各個不同的細胞型和發育時期實現基因的高 效持續過表達，運些都對載體系統提出了極為苛刻的要求。為了實現我們的實驗目的，并創 造出兼具各自優點的載體系統，必須對其進行徹底的改造，來實現與滿足在研究中的需要。

【發明內容】

[0018] 本發明所要解決的問題在于克服上述不足之處，提供一種帶有標記基因的Tet-on 誘導過表達的重組載體及構建方法。
[0019]解決W上技術問題的一種帶有標記基因的Tet-on誘導過表達的PiggyBac重組載 體，其特征在于:核巧酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0020] 所述重組載體包括源于pTRIPZ的Tet-on順式表達元件和反式表達元件，W實現成 功的誘導過表達;所述載體還包含源于PB513B-1的PiggyBac載體骨架、標記基因GFP及T2A 序列，W實現高效的基因整合和方便分子克隆。
[0021 ] 所述化t-〇n順式表達元件包括TRE調控區域和CMV mini Promoter序列。
[0022] 所述Tet-on反式表達元件包括hUbC啟動子、tTA3 CDS、內部核糖體插入位點 (IRES)元件、嚷嶺霉素(Puromycin)抗性基因W及猴空泡病毒(SV 40化olyA。
[0023] 所述PiggyBac載體骨架包括邊界與整合元件、隔離子、細菌克隆抗性篩選基因和 復制原點，等。
[0024] 本發明中構建具有帶有標記基因的成熟的Tet-on誘導過表達的重組載體，并利用 PiggyBac載體骨架將其插入人類多能干細胞的基因組，構建能夠持續高效而無滲漏性的外 源基因誘導表達轉基因細胞系。
[0025] 本發明中一種帶有標記基因的Tet-on誘導過表達的重組載體的構建方法，包括如 下步驟：
[0026] 步驟一：設計5 ' 引物GFP-5 ' -XhoI和3 ' 引物T2A-3 ' -SwaI，WPB513B-1 載體為模板， PCR擴增出GFP-T2A CDS片段，XhoI和MluI雙酶切后切膠回收；pTRIPZ的一個衍生載體 pHBTetOE-puro-Gatal，也經過趾O巧日MluI雙酶切后切膠回收；插入片段和載體片段WT4 DNA連接酶連接；將連接后的產物轉化感受態細胞DH5a ;并進行酶切鑒定與基因序列的測 定，構建成抑BTet0E-GFP-T2A-C載體；
[0027] 步驟二：設計5' 引物Tet-〇n-5'-PB-LVX和3' 引物Tet-〇n-3'-PB PCR擴增出2.化b 長的Tet-on相關元件，3 '用T4 PNK憐酸化，5 '引入XbaI位點，XbaI酶切后切膠純化;PB513B- 1經過SpeI和化al雙酶切后切膠回收;插入片段和載體片段WT4 DNA連接酶連接;將連接后 的產物轉化感受態細胞D冊a;并進行酶切鑒定與基因序列的測定，構建成PB-Tet-on-OE載 體。
[0028] 所述步驟一中，引物為：
[0029] 5'引物GFP-5'-XhoI:
[0030] 5 ' TTTCCCCTCGAGCCACCATGGAGAGCGACG 3 '；
[0031] 3'引物124-3'-5訊曰1:
[0032] 日'TTTCCCACGCGTGGCGCGCCGAATTCTTTGGGATTTMATGGGCCGGGATTCTCCTCCA 3'。
[0033] 所述步驟二中，引物為：
[0034] 5 ' 引物I'et-on-S ' -PB-LVX: 5 ' CGAGGTTCTAGACGAGTTTACTCCC 3 ' ；
[0035] 3 ' 引物I'et-on-S ' -PB: 5 ' ATTGTTCCAGACGCGAACTCAGG 3 '。
[0036] 所述步驟一中，擴增程序為:98°C預變性1111111，98。(：變性1〇3,58。(：退火3〇3,72。(：延 伸 1111111，35個循環后72°(：1〇111111，4°(：保存。
[0037] 所述步驟二中，擴增程序為:94°C預變性1111111;94。(：變性153,60。(：退火3〇3,68。(：延 伸5min，32個循環后72°C10min，4°C保存。
[0038] 本發明中還有根據重組載體而得的基于人類抓NX化基因誘導過表達載體PB-Tet- on-GFP-T2A-hRunx 化。
[0039] 本發明所述載體在構建能誘導過表達RUNXlb的人類多能干細胞系W及該基因功 能研究中的應用。
[0040] 本發明的有益效果為：
[0041] 該載體的優點在于：
[0042] (1)保持了PTRIPZ絕大多數Tet-on順反式元件，因此也就繼承了其主要的優點，能 夠在幾乎所有生物和細胞型中正常表達并避免滲漏表達。同時避免了慢病毒載體的很多缺 點，如容易沉默，物種和細胞型限制，W及轉導病毒可能帶來的細胞毒性和免疫反應。
[0043] (2)保持了PiggyBac載體，特別是PB513B-1的基因組整合特性，包括經過改進的整 合序列和人源化轉座酶，整合效率高，且可W用多種轉染方法進行轉基因操作。
[0044] (3)增大了Tet-on系統插入片段的范圍，即使是很大基因片段的插入，也不影響載 體的轉染、整合和正常過表達;而同樣的操作在pTRIPZ衍生載體中會使載體長度超過病毒 包裝的極限，導致包裝效率極低甚至不能包裝。利用PiggyBac載體骨架使得運個載體具有 很大的改造潛力，日后可W在運個載體上插入更多的元件，具有更多的功能。
[0045] (4)從PB513B-1引入隔離子元件（Insulator)保護Tet-on元件在插入任何物種或 細胞型的基因組的任何部位或者在細胞不同發育階段都能正常過表達，大大提高了過表達 的效率和載體的有效作用時空點。
[0046] (5)該載體不僅可W在人類多能干細胞中有效使用，也能很好的應用于其他任何 生物體或不同的細胞系，其可移植性非常出色。構建一個成功的載體，就能迅速應用于其他 的模式生物或細胞系的轉基因操作，可W大大加速基因功能的研究進程。
[0047] (6)由于引進了一個與目的基因共表達但又獨自定位的GFP基因（green fluorescence protein)，使得在不影響目的基因功能定位的前提下，提供了一個監測其時 空表達的精確方式，使研究者能夠用流式分析技術和其他免疫巧光技術準確分析和追蹤目 的基因正常表達的細胞，使其生物學效應不被其他未整合或基因沉默的細胞所淹沒。運是 目前絕大多數PiggyBac類型載體系統中所沒有的，特別適合于沉默效應明顯的研究系統 中。
[0048] 本發明構建了成本低而高效的載體系統及其相應的轉基因方法來建立轉基因細 胞系，并通過可控誘導目的外源基因過表達來觀察該基因在多能干細胞向造血分化過程中 可能發揮的效應和功能。本發明中的重組載體也能夠很好的應用于其他細胞型或模式動物 的轉基因操作，W簡化遺傳研究的方法。
[0049] 化t-on過表達載體的優點：
[0050] 只需化g/ml多西環素(Doxycycline)即可進行強度很高的過表達，表達時間也很 持久，而如此低濃度的誘導劑對于宿主細胞的毒性很低，減低了研究的背景，也利于迅速打 開和關閉目的基因的過表達，有利于研究精度的提高；
[0051] 沒有添加 Doxycycline時無滲漏型表達，屬于嚴謹控制的誘導表達體系，有助于減 少對宿主細胞的毒性和降低表達背景，提高研究的精度和可信度；
[0052] 目標基因的啟動子是CMV，反式激活因子的啟動子是P郵C，都沒有物種和細胞型的 表達特異性，適應面很廣。
[0053] 由于順式表達元件和反式調控元件都在一個載體上，單個載體發生整合即能使 Tet-on系統有效運作，大大提高了獲得良好轉基因細胞系和成功誘導表達的機率。
[0054] 本發明不僅適合于在轉基因多能干細胞向造血分化過程研究中，也試用其他細胞 及動物模型的相關轉基因和誘導過表達研究。
【附圖說明】
[0化5]圖1為本發明中的帶有GFP標記基因的成熟Tet-on誘導過表達系統PB-Tet-on-OE 的質粒示意圖。
[0056]圖 2-1，2-2 為轉染了PB-Tet-on-OE 和 PB-Tet-〇n-GFP-T2A-hRurudb的人類多能干 細胞化1)進行誘導表達的巧光圖
[0057]圖3為本發明中qPCR法鑒定過表達水平結果圖
[005引圖4-1為本發明中Western Blot法在蛋白水平鑒定過表達結果圖，圖4-1中（A為 Runxl特異性抗體檢測的Western Blot結果，B為GAPDH特異性抗體檢測的Western Blot結 果，Al，B1為DOX未誘導的PB-Tet-0n-GFP-T2A-hRunx化hESC總蛋白抽提樣品，A2，B2為DOX 誘導過表達的PB-Tet-0n-GFP-T2A-hRunx化hESC總蛋白抽提樣品，[,PageRuler預染蛋白 Ladder，D0X誘導過表達樣品檢測到一個52. Skd的主帶，與人類RUNX化蛋白的分子量吻合； 還有一個79. Skd的次帶，是未被蛋白酶切開的人類Runxlb蛋白與GFP蛋白連接在一起的全 長膚段）
[0059] 圖4-2中A圖為GFP特異性引物擴增PCR產物檢測結果，B圖為hRurudb特異性引物擴 增口0?產物檢測結果；41，81:^?8-1日1-〇11-6。？-124-11咖^化1165〔旨日11〇1111〇0臟為模板，^ GFP或hRunx化特異性引物擴增的PCR產物;A2，B2:WPB-Tet-on-0EhESCgenomicDNA為模 板，WGFP或hRunx化特異性引物擴增的PCR產物;A3，WPB-Tet-on-OE質粒DNA為模板，WGFP 特異性引物擴增的PCR產物；B3，WPB-Tet-〇n-GFP-T2A-hRurudb質粒DNA為模板，WhRurudb 特異性引物擴增的PCR產物;Ml:肥B化b ladder,M2:肥B IOObp ladder)
[0060] 圖5-1,5-2為本發明中流式細胞檢測結果圖
[0061 ]圖6-1，6-2為轉基因1165(：系向^胚層分化的巧光檢測圖
[0062] 圖 7-l，7-2為轉基因hESC系PB-Tet-on-GFP-T2A-hRunx化（編號96)和PB-Tet-on- 0E(編號53)多能性的巧光檢測圖
[0063] 圖8-1到圖8-7為轉基因hESC系向造血分化過程D4的重要造血分化相關基因qPCR 檢測圖，比較有無hRUNX化過表達對于運些基因轉錄水平表達的影響
【具體實施方式】
[0064] 下面結合附圖和【具體實施方式】對本發明技術方案做進一步詳細描述，其中的分子 克隆步驟參照《分子克隆實驗指南》相關章節進行，試劑盒試劑等相關材料均為市售商品， 具體如下：
[0065] 本發明中W下實施例中所用pTRIPZ及其衍生載體購自漢恒公司，PB513B-1載體購 自SBI公司；限制性內切酶及DNA修飾酶購自肥B公司；
[0066] hESCs細胞系Hl由中國醫學科學院實驗血液學國家重點實驗室于2011年9月提供； mAGM-S3取自小鼠的AGM區，自1998年在本實驗室維持并保持穩定高效的造血能力；
[0067] 其中，試劑：BSA美國Sigma A9418，IMDM培養基美國GIBCO 12440053，DMEM培養基 美國Sigma D5796，F12培養液美國GIBCO 21700-075，KSR美國Gibco N10828-028，mTeSRl STEMCE化 05850，Y-27632(ROCK抑制劑）MERCK 688000,改良型a-MEM美國Hyclone 細3〇265.〇18，非必需氨基酸（肥44)美國6化。〇〇7796，0-琉基乙醇51旨111曰，〇.25%1'巧93111/ EDTA G化CO 25200056,胎牛血清(FBS)Hyclone 0078，bFGF WAKO 060-04543,血管內皮細 胞生長因子(VEGF)WAKO 229-01313，心谷氨酷胺Gibco 25030081，青霉素/鏈霉素Gibco 15070063，May-Giemsa染液德國MERCK,臺吩藍（Tiypan Blue stain)G;Lbco公司，抗壞血酸 (Ascorbic acid)Sigma公司，轉鐵蛋白（Transferrin)Sigma公司，Mahigel 抓公司；實時 巧光定量PCR試劑盒Roche FastS^d Universal SYBR Green Master(R0X)04913914001， 逆轉錄試劑盒Bio-rad iScript TM Cdna Synthesis Kit 170-8891。
[006引實施例1
[0069] 一種帶有標記基因的Tet-on誘導過表達的重組載體，核巧酸序列如SEQ ID NO. I 所示。
[0070] 構建方法，包括如下步驟：
[0071] 步驟一：設計5' 引物GFP-5'-XhoI和3' 引物T2A-3'-SwaI，WPB513B-1 載體（SBI公 司）為模板，PCR擴增出GFP-T2A CDS片段，XhoI和MluI雙酶切后切膠回收;pTRWZ的一個衍 生載體P皿TetOE-puro-Gatal (漢恒公司），也經過化〇1和MluI雙酶切后切膠回收;插入片段 和載體片段WT4 DNA連接酶連接;將連接后的產物轉化感受態細胞DH5a ;并進行酶切鑒定 與基因序列的測定，構建成抑BTet0E-GFP-T2A-C載體；
[0072] 步驟二：設計5' 引物Tet-〇n-5'-PB-LVX和3' 引物Tet-〇n-3'-PBPCR擴增出2.化b長 的Tet-on相關元件，3 '用T4 PNK憐酸化，5 '引入XbaI位點，XbaI酶切后切膠純化;PB513B-1 經過SpeI和化al雙酶切后切膠回收;插入片段和載體片段WT4 DNA連接酶連接;將連接后 的產物轉化感受態細胞D冊a;并進行酶切鑒定與基因序列的測定，構建成PB-Tet-on-OE載 體。
[0073] 所述步驟一中，引物為：
[0074] 5 ' 引物GFP-5 ' -XhoI: 5 ' TTTCCCCTCGAGCCAC CATGGAGAGCGACG 3 ' ； 3 ' 引物124-3'- SwaI:5 ' TTTCCCACGCGTGGCGCGCCGAATTCTTTGGGATTTAAATGGGCCGGGATTCTCCTCCA 3 '。
[0075] 所述步驟一中，擴增程序為:98°C預變性lmin，98°C變性10s，58°C復性30s，72°C延 伸 1111111，35個循環后72°(：1〇111111，4°(：保存。
[0076] 步驟一中反應體系如下表1:
[0077]表1 [007引
[0079] 所述步驟二中，引物為：
[0080] 5'引物16*-〇11-5'斗8-1^￥乂：5乂64661'1'押464〔6461'7^(：1'〔0：3'；3'引物161-〇11- 3'-PB:5'ATTGTT CCAGACGCGAACTCAGG 3'。
[0081 ] 所述步驟二中，擴增程序為:94°C預變性lmin;94°C變性153,60°(：復性3〇3,68°(：延 伸5min，32個循環后72°C10min，4°C保存。
[0082] 步驟二中反應體系如下表2:
[0083] 表 2 「OORAl LUU狀」 買砸例2
[0086] 其它內容如實施例1中的內容，本發明中重組載體包括源于pTRIPZ的Tet-on順式 表達元件和反式表達元件，W實現成功的誘導過表達;所述載體還包含源于PiggyBac載體 骨架，W實現高效的基因整合和方便分子克隆。
[0087] !"61:-011順式表達元件包括TRE調控區域和CMV mini Promotor序列。
[008引 Tet-on反式表達元件包括WJbC啟動子、tTA3 CDSJRES元件、Puromycin抗性基因 W及SV 40 化lyA。
[0089] PiggyBac載體骨架包括邊界與整合元件、隔離子、細菌克隆抗性篩選基因和復制 原點，等。
[0090] 本發明中構建具有帶有標記基因的成熟的Tet-on誘導過表達載體，并利用 PiggyBac載體骨架將其插入人類多能干細胞的基因組，構建能夠持續高效而無滲漏性的外 源基因誘導表達轉基因細胞系。
[00川試驗例：
[0092] 本發明中的試驗例W人類RUNX化誘導過表達的多能干細胞系為例：
[0093] 基于人類RUNXb基因誘導過表達載體PB-Tet-〇n-GFP-T2A-hRunx化的構建：
[0094] 1，如圖1所示，該載體WPB-Tet-on-OE質粒為出發質粒。設計引物Runxla,b-5'- ATG(5'ATGCGTATCCCCGTAGATGCCAG 3'）和Runxlb，c-3'coding(5' TTTAAAGCGGCCGCGAATTCATTAATAGGGCCTCCACACGGCCTCCTC 3 '）（該序列不引入多余的氨基酸 序列到hRUNX化），并WpcDNA3-Rurudb質粒上的人類Rurudb CDS為模板進行PCR擴增反應， 獲得5'端含有ATG起始密碼子和3'端攜帶有EcoRI酶切位點的人類Runxlb編碼區序列 (1359bp)。利用PCR產物回收試劑盒回收PCR產物后用T4PNK進行末端憐酸化并用EcoRI酶 切，PB-Tet-on-OE質粒進行SwaI和EcoRI雙酶切并切膠回收，WT4DNA連接酶連接。將連接后 的產物轉化感受態細胞D冊a,并進行酶切鑒定與基因序列的測定。
[00巧]2,基于Hl的轉基因細胞系PB-Tet-〇n-GFP-T2A-hRunx化及其載體對照PB-Tet-on- OE的建系過程：
[0096] (1)轉染質粒的制備：將含有質粒 PB-Tet-〇n-GFP-T2A-hRurudb和 PB-Tet-on-OE的 D冊a菌株的凍存菌液在含有Amp的固體LB培養基平皿中劃線接種，37°C過夜培養獲得單個 菌落。挑單個菌落到3ml的Amp-LB液體培養基中37 °C 28化pm培養8小時后，1/500接種到含有 Amp的100mL LB液體培養基中，37°C280rpm過夜培養。利用化reLink? HiPure Plasmid Midiprep Kitdnvi化Ogen,cat:K2100-05)制備質粒，并利用分光光度法測定0D260/280及 核酸濃度，-80°C保存備用。
[0097] (2)人類多能干細胞系的細胞培養與傳代
[0098] 本研究中使用的基礎細胞系為人類胚胎干細胞系Hl，培養條件為商品化的mTeSRl 培養基(Stem cell公司）37°C、5%C02的培養箱中培養。在細胞成長匯合至80%后，WD-PBS 洗涂細胞一次，再W專口的商品化酶Re 1 eSR(Stem Ce 11，cat: 05872)37°C消化5分鐘。再W mTeSR培養基將細胞團吹成適當小片，Wl: 3的比例分裝到Matrigel (Invitrogen ,cat: A1413301)打底的培養皿中繼續培養。
[0099] (3)多能干細胞系的轉染和抗性篩選
[0100] 按1:3的培養面積比接種Hl細胞到Ma化igel打底的24孔板中并培養1-2天，當hESC 克隆達到適當大小時，加入脂質體與質粒的混合物進行轉染。具體方法如下:在第一個無菌 的 0.6ml eppendo;rf 管添加SOul 〇pti-MEM@ Medium ,然后加入0.5]ig轉座子載體 transposon(PB-Tet-on-GFP-T2A-hRunxlb或PB-Tet-on-0E)與轉座子輔助載體 transposase(PB200A-l ,SBI公司）的混合物，其mol比為1:3，再加入化 1 LP3000? Reagent， 混合均勻；在第二個無菌的0.6ml eppendoW管添加50]ilOpti-MEM及:Medium,然后加入 0.75]il Lipol'ccUiminc貨3000 Reagent，混合均勻；最后將兩個管中的成分迅速混勻后室溫 解育5min，然后加入到相應的含有50化1 mTeSRl培養基的24孔板的孔中，混合均勻后37°C、 5%C02的培養箱中繼續培養2天，其中第二天添加25化1 mTeSRl培養基;保留一個孔為不加 任何DNA的轉染陰性對照。之后吸去上清，添加新鮮的50化1 mTeSRl培養基，繼續培養2-3 天，每天換液;最后換成含有化g/ml Puromycin的mTeSRl培養基，每天換液，直至所有沒有 被轉染的hESC被殺死而具有化romycin抗性的克隆長到足夠大又不互相融合的時候，挑取 5-10個狀態最好而較大的克隆到Ma1:;rigeI打底的96孔板中用含有Ijig/ml Puromycin的 mTeSRl繼續培養。待其生長匯合之后連續傳代，從96孔板到48孔板，再到24孔板，最后傳到 35-mm培養皿中。運之后再用不含化romycin的mTeSRl培養基繼續擴大培養。最后當hESC生 長匯合后每35-mm培養皿用ReleSR解離后重懸于含有20%DMS0的mTeSRl培養基中并分裝到 2個凍存管中，先放到室溫的凍存盒（Nelgene,Oyo 1 °Cfreezing Container ,cat: 5100- 0001)中，在-80°C低溫冰箱中降溫過夜，然后轉移到液氮罐中永久保存。
[0101] 3,轉染 PB-Tet-〇n-GFP-T2A-hRurudb和 PB-Tet-on-OE 的 Hl 細胞系的轉基因和誘導 過表達鑒定：
[0102] (1)轉基因整合鑒定：培養于35-mm培養皿的轉基因Hl細胞系用QIAamp Blood Mini Kit (Qiagen ,cat :51104)提取基因組 DNA，然后用Runxla，b-5'-ATG/Runxlb，c-3' coding^相應基因組DNA為模板進行PCR擴增人類RUNX化CDS及GFP CDS序列，Wl %瓊脂糖 膠IxTAE電泳系統檢測PCR產物大小，證實其符合預期大小。
[0103] (2)qPCR進行轉錄水平的檢測
[0104] 培養于24孔板的轉基因細胞中加入化g/ml DoxycyclineW誘導GFP及RUNX化過表 達，10小時及24小時后用倒置巧光顯微鏡進行觀察和拍照(如圖2-1，2-2)。用Trizol試劑抽 提0〇巧巧(31;[]16誘導24小時或未誘導的轉基因細胞系總1?酷并用15(31'1口1了^。0臟87]1化6313 Kit (Bio-Rad，cat: 170-8891)逆轉錄成cDNA, WRunxlb/c-EX7B-F( 5 ' TCTGCAGAACTTT CCAGTCG 3'）和Runx化/c-EX8-R(5'GTCGGGGAGTAGGTGAAGG 3'）作為檢測引物，^640口護 EX7-F(5'GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG 3'）和GADPH-EX8-R巧'ACCACCCTGTTGCTGTA GCCAA 3'） 作為內參引物，用I^astStart Universal SYBR Green Master kit(Roche,cat: 04913850001)在巧光定量PCR儀(Bio-rad Q5)上進行實時巧光定量檢測，W確定誘導表達 的hRUNX化含量上升的倍數。
[01 05] qPCR法鑒定過表達水平結果如圖3，PB-Tet-〇n-GFP-T2A-hRunx化（編號為MF96)的 hESC在Doxycycline誘導（D0X+)或不誘導（D0X-)條件下RUNX化表達的轉錄水平比較，前者 是后者的大約37倍。
[0106] (3)Western Blot進行蛋白水平的檢測
[0107] 在培養于35-mm培養皿的轉基因多能干細胞中加入化g/ml DoxycyclineW誘導 hRUNX化過表達，然后用0.5mM抓TA將其消化成單細胞并重懸于D-PBS，離屯、沉淀W后用500 iil RIPA(含有ImM PMSF和Roche的Ix蛋白酶抑制劑)重懸，冰浴30min并震蕩促使其裂解，最 后12000X g 4°C5min沉淀不溶組分，上清按50山分裝并凍存于-80C。用BCA法與標準蛋白進 行比較蛋白樣品濃度，并W此為根據調整上樣樣品的蛋白總量一致。用標準SDS-PAGE(10% 分離膠/5%濃縮膠)在Tis-甘氨酸緩沖電泳體系中分離蛋白樣品，然后轉至PVGF膜上，用鼠 抗人Runxl-抗（DW71,SC-IOl 146 ,Santa cruz公司）或鼠抗人GAPDH-抗（內參對照，KC- 5G4,Kang化en公司）結合目標，然后用Goat Anti-Mouse IgG HfcL(HRP)Preadsorbed二抗 (ab97040，Abcom公司）結合一抗，最后用Amersham? E化? Prime蛋白印跡試劑（RPN2232， GE Healthcare)顯色，用Image如ant LAS 4000 mini拍照記錄結果（如圖4-1，圖4-2)。
[0108] DOX誘導過表達樣品檢測到一個52. Skd的主帶，與人類Runx化蛋白的分子量吻合； 還有一個79. Skd的次帶，應該是未被蛋白酶切開的人類Runxlb蛋白與GFP蛋白連接在一起 的全長膚段，而對照未誘導樣品沒有明顯條帶。
[0109] 4,轉染 PB-Tet-〇n-GFP-T2A-hRurudb和 PB-Tet-on-OE 的 Hl 細胞系的多能性和向 S 胚層分化能力鑒定
[0110] (1)轉基因多能干細胞系的多能性檢測
[0111] 轉基因人類多能干細胞系PB-Tet-on-OE和PB-Tet-〇n-GFP-T2A-hRurudb的克隆細 胞團在0.1%化itonX-100通透后，分別與相應的人類多能干細胞特征性抗體(SSEA4、TRA- l、0ct4和化nog-抗)結合，再與相應的帶切3或FITC巧光標記的二抗結合，最后用核DNA染 料DAPI染色，在巧光顯微鏡下進行巧光檢測，如圖7-1，7-2。
[0112] 檢測結果說明W上兩個細胞系都具有正常的人類多能干細胞特征性基因表達，可 W進一步用于向造血分化的研究。
[0113] (2)轉基因多能干細胞系向S胚層分化能力的檢測
[0114] 轉基因人類多能干細胞系PB-Tet-on-OE和PB-Tet-〇n-GFP-T2A-hRurudb的克隆細 胞團在 Human Pluripotent Stem Cell Functional Identification Kit(C027 ,R&D Systems公司）的誘導下分別向內胚層，中胚層和外胚層分化。在化iton X-IOO通透后,分別 與相應的特征抗體(S0X17 ,Brachyury和0TX2-抗)結合，再與相應的帶切3巧光標記的二抗 結合，最后用核DNA染料DAPI染色，在巧光顯微鏡下進行巧光檢測，如圖6-1，6-2。
[0115] 檢測結果說明W上兩個細胞系都具有正常的向=胚層分化的能力，可W進一步用 于向造血分化的研究。
[0116] 5,共培養系統檢測hRUNX化過表達對于人類多能干細胞向造血分化過程的效應。
[0117] (1)轉基因hESCs(PB-Tet-〇n-GFP-T2A-hRunx化和 PB-Tet-on-OE)維持未分化培養 采用無基質細胞培養方法，根據W上描述的方法進行培養和傳代；
[0118] (2)mAGM-S3基質細胞的準備
[0119] 復蘇液氮凍存的mAGM-S3細胞株于明膠包被的IOOmrn培養皿中，培養基為含有5% 胎牛血清的MEM ALPHA M孤(S冊0265.Ol ,Hyclone公司），37°C，5%C02培養至細胞完全匯合 之后，用0.05%膜酶消化重懸，用冰的D-PBS和培養基終止消化，傳代至明膠包被的12孔板 中，輕柔搖勻，37°C5%C02培養1-2天。當細胞融合度不低于90%時（約2 X 105細胞/孔），13 Gray X射線福照處理后再換新鮮mAGM-S3細胞培養基備用。
[0120] (3化ESCs與mAGM-S3共培養產生造血干/祖細胞并誘導hRUNX化過表達
[0121] 用2(K)化槍頭槍尖在顯微鏡下將轉基因hESCs未分化集落劃分成0.5-1 X IO3細胞 的小集落片，W35個集落/12孔板每孔（約2 X 105hESCs/孔）的密度接種集落于福照過的 mAGM-S3細胞上，加1.5ml hESCs未分化細胞維持液，輕柔搖勻，37°C5%C〇2培養3天，然后換 成造血誘導分化液（IMDM 515ml，去補體化FBS 60ml(終濃度10%)，肥AA 5111^心谷氨酷胺 10ml，50mg/ml AA 60化1，轉鐵蛋白40山，VEGF 10yg，2-ME扣1)再培養14天(從運一天開始 計算開關W后的天數，記為DX)，并從DO開始加或不加Doxycycline來比較有無hRUNX化過表 達對于造血分化的影響，每天換液(D6W后根據細胞培養情況可一天換液2次），至D14將產 生大量造血干/祖細胞，收集細胞備用。
[0122] (4)流式分析
[0123] 共培養開關后14天(D14)的共培養細胞用D-PBS洗涂2遍，用槍頭刺破造血克隆后 用0.25%1'巧93111/邸14 37°(：處理5-7111111，冰0斗85及含血清培養液終止膜酶作用，用11111槍 頭反復吹打直至無大細胞團塊凝集，收集到離屯、管中，13(K)rpm室溫離屯、5min，棄上清，重懸 于SM buffer(含有2%FBS的D-PBS)，70皿濾膜過濾。大約每0.5ml加入普通兔血清5-lOul混 勻，置于冰上封閉20分鐘，阻斷抗體抗原非特異性結合位點，再加入特異性抗體(CD34-APC、 CD45-PE各化1)，震蕩混勻，冰上避光反應20-30min，lml SM buffer洗涂1次，400xg室溫離 屯、5min，棄上清，SM buffer液20化1重懸于流式上樣管中，用抓化nt〇n流式細胞儀進行檢 測，實驗數據使用FlowjolO軟件進行分析。
[0124] 分別針對GFP+和GFP-兩個亞群進行CD34+/CD45+細胞群統計分析，發現對于DOX誘 導過表達的PB-Tet-on-OE而言，GFP+和GFP-兩個亞群中CD34+/CD45+是接近的；但在DOX誘 導過表達的PB-Tet-〇n-GFP-T2A-hRurudb hES cell line中，CD34+/CD45+細胞群的含量在 GFP-中比GFP+要高出10倍W上。由于人類Rurudb基因和GFP是共表達的，W上檢測結果很清 楚的表明Rurudb的過表達對于CD34+/CD45+細胞群的產生具有強烈的抑制作用。（如圖5-1， 圖 5-2)
[0125] (5)qPCR分析造血分化早期hRUNXlB過表達對于造血分化相關基因表達的影響（如 圖8-巧Ij圖8-7)
[0126] A，總RNA 抽提
[0127] 用W上的方法來培養和獲得PB-Tet-〇n-GFP-T2A-hRunx化和PB-Tet-on-OE開關后 D4的共培養細胞，400xg室溫離屯、5min，棄上清，采用化izol提取總RNA，凍存于-80°C儲存， 實時巧光定量PCR方法檢測目標基因的表達；
[012引 B，逆轉錄cDNA
[01巧]逆轉錄20]iL反應體系：
[0130]
[0131] 反應程序：251：5111111;421：3〇111111;851：5111111;4°(：保存。獲得的。0魁樣本分裝后-80 °C儲存；
[0132] C，qPCR 分析
[0135] GAPDH(管家基因）引物序列：[0136] GADPH-EX7-F 5'GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG 3'
[0133] WF'astStart Universal SYBR Green Master kit(cat:04913850001 ,Roche)進 如 T A祐^ 歷"c 玄I1、
[0134]
[0137] GADPH-EX8-R 5'ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA 3'
[013引 Gatal引物序列：
[0139] Gatal-E^-F5'CACGACACTGTGGCGGAGAAAT3'
[0140] Gatal-Ex6-R 日'TTCCAGATGCCTTGCGGTTTCG 3'
[0141] GATA3引物序列：
[0142] GATA3-EXN1-F 5'GCGAGACAGAGCGAGCAA 3'
[0143] GATA-3-EXN2-R 5'ACTGGGTACGGCAGAATAAAA 3'
[0144] LMO巧I物序列：
[0145] LM02-EX2-F 5'GCGCCTCTACTACAAACTGGGC 3'
[0146] LM02-EX3-R 5，CTCATAGGCACGAATCCGCTTG 3，
[0147] PC畑I巧I物序列：
[0148] PCDH12-EX3-F 5，GACCTCTCTGTGAAGCAACTGC 3，
[0149] PCDH12-EX4-R 5'CACATTGTCACGGTAGTTGGTGG 3'
[0150] Runxla 引物序列：
[0151] Runxla-Ex6-F 5'ACAGCCATGAGGGTCAGC 3'
[0152] Runxla-Ex7A-R 5'ATCTCCAGGGTGCTGTGTCT 3'
[0153] SPIl引物序列：
[0154] SPI1-EX2-F 5'GACACGGATCTATACCAACGCC 3'
[0155] SPI1-EX3-R 5'CCGTGAAGTTGTTCTCGGCGAA 3'
[0156] vWF引物序列：
[01 巧]VWF-EX27-F 5'CCTTGAATCCCAGTGACCCTGA 3'
[0158] VWF-EX28-R 5'GGTTCCGAGATGTCCTCCACAT 3'
[0159] 如圖8-巧^圖8-7結果顯示，包括GATA1，GATA3，LM02，PCDH12(VE-CAD)，抓NXla (Runxl的另一種重要剪切體），SPIl，vWF等造血相關重要基因，相比PB-Tet-on-OE(編號 MF53)，在PB-Tet-〇n-GFP-T2A-hRunx化（編號MF96)過表達的D4共培養細胞中被大幅下調， 運可能是其向造血分化被抑制的直接原因。
[0160] W下試驗例中主要溶液的配制如下：
[0161] (1)人源化ESC培養基配制
[0162] ml'eSRTMlBasal Medium 400mL
[0163] ml'eSRTMl 放 Supplement IOOmL
[0164] 共500ml，混勻，置于4°C冰箱備用。
[0165] (2)AGM培養液配制
[0166] Q-MEM SOOmL
[0167] FBS(去補體化） 25mL
[0168] 共525ml，混勻，0.22皿濾器過濾，置于4°C冰箱備用。
[0169] (3化ESC未分化細胞維持液配制
[0170]
[0171]
[0172]
[0173]
[0174] ... 。
[01巧]共590ml，混勻，0.22皿濾器過濾，置于4。(：冰箱備用。
[0176] W上所述僅為本發明的較佳實施例而已，并不用W限制本發明，凡在本發明的精 神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。
【主權項】
1. 帶有標記基因的Tet-On誘導過表達的重組載體，其特征在于：核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。2. 根據權利要求1所述的所述帶有標記基因的Tet-on誘導過表達的重組載體，其特征 在于:所述重組載體包括源于PTRIPZ的Tet-on順式表達元件和反式表達元件，還包括源于 PB513B-1的PiggyBac載體骨架、標記基因 GFP及T2A序列。3. 根據權利要求2所述的所述帶有標記基因的Tet-on誘導過表達的重組載體，其特征 在于:所述Tet-on順式表達元件包括TRE調控區域和CMV mini Promoter序列。4. 根據權利要求2所述的所述帶有標記基因的Tet-on誘導過表達的重組載體，其特征 在于:所述Tet-on反式表達元件包括hUbC啟動子、tTA3 Q)S、IRES元件、Puromycin抗性基因 以及SV 40 PolyA。5. 根據權利要求2所述的所述帶有標記基因的Tet-on誘導過表達的重組載體，其特征 在于:所述PiggyBac載體骨架包括邊界與整合元件、隔離子、細菌克隆抗性篩選基因和復制 原點。6. -種帶有標記基因的Tet-on誘導過表達的重組載體的構建方法，其特征在于:包括 如下步驟： 步驟一： 設計5 '引物GFP-5 ' -XhoI和3 '引物T2A-3 ' -SwaI，以13B-1載體為模板，PCR擴增出 GFP-T2A CDS片段，XhoI和MluI雙酶切后切膠回收;pTRIPZ的一個衍生載體pHBTetOE-puro-Gatal，也經過XhoI和MluI雙酶切后切膠回收；插入片段和載體片段以T4 DNA連接酶連 接;將連接后的產物轉化感受態細胞DH5a;并進行酶切鑒定與基因序列的測定，構建成 pHBTetOE-GFP-T2A-C 載體； 步驟二： 設計5' 引物Tet-〇n-5'-PB-LVX和3' 引物Tet-〇n-3'-PB PCR擴增出2.7kb長的Tet-on相 關元件，3 '用T4 PNK磷酸化，5 '引入XbaI位點，XbaI酶切后切膠純化;PB513B-1經過SpeI和 HpaI雙酶切后切膠回收;插入片段和載體片段以T4 DNA連接酶連接;將連接后的產物轉化 感受態細胞DH5a;并進行酶切鑒定與基因序列的測定，構建成PB-Tet-on-OE載體。7. 根據權利要求6所述的一種帶有標記基因的Tet-on誘導過表達的重組載體的構建方 法，其特征在于:所述步驟一中，引物為： 5'引物 GFP-5'-XhoI: 5'TTTCCCCTCGAGCCACCATGGAGAGCGACG 3'； 3'引物 T2A-3'-SwaI : 5. TTTCCCACGCGTGGCGCGCCGAATTCTTTGGGATTTMATGGGCCGGGATTCTCCTC CA 3 '。8. 根據權利要求6所述的一種帶有標記基因的Tet-on誘導過表達的重組載體的構建方 法，其特征在于:所述步驟二中，引物為： 5 ' 引物Tet-on-5 ' -PB-LVX: 5 ' CGAGGTTCTAGACGAGTTTACTCCC 3 ' ； 3 ' 引物丁〇卜〇11-3'-PB:5' ATTGTTCCAGACGCGAACTCAGG 3'。9. 根據權利要求6所述的一種帶有標記基因的Tet-on誘導過表達的重組載體的構建方 法，其特征在于：所述步驟一中，擴增程序為：98 °C預變性Imin，98 °C變性IOs，58 °C退火 30s，72°C 延伸 lmin，35 個循環后 72°C 10min，4°C 保存； 所述步驟二中，擴增程序為：94 °C預變性Imin ; 94 °C變性15s，60 °C退火30s，68 °C 延伸5 min, 32個循環后72°C 10 min，4°C保存。
【文檔編號】C12N15/85GK105925609SQ201610552748
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年7月14日
【發明人】陳波, 馬峰, 周涯
【申請人】中國醫學科學院輸血研究所