β－1，3－葡聚糖酶、多核苷酸、重組載體、轉化體、β－1，3－葡聚糖酶的制造方法、酶制劑 ...的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及分解裸藻淀粉的新型的β-1，3-葡聚糖酶、多核苷酸、重組載體、轉化 體、β-1，3-葡聚糖酶的制造方法、酶制劑及低分子化裸藻淀粉的制造方法。
【背景技術】
[0002] β-1，3 -葡聚糖是以葡萄糖的β-1，3-鍵作為主鏈的多糖，是作為在褐藻、海帶 屬中大量含有的褐藻淀粉、土壤細菌(Alcaligenes faecal is)的突變株在細胞外形成的可 得然膠的主結構存在的物質。另外，還已知有糧谷的細胞壁中所含的胼胝質（加一只）。
[0003] 雖然β-1，3-葡聚糖在以β-1，3-結構為主鏈這一點上是共同的，然而根據其來 源等，分支的側鏈的有無和位置、β-1，4一鍵、β-1，6-鍵的組合、分子的大小等不同，分別 具有不同的結構、性質。
[0004] β- 1，3-葡聚糖酶是將這些β-1，3-葡聚糖水解的酶，除了用于改善家畜的生 長、飼料利用率的飼料的添加劑、糕點/面包等的物性改善劑或口感改良劑、酵母提取物的 提取效率改良劑、啤酒的過濾效率的改善劑外，還被用于各種用途中。
[0005] 作為β- 1，3-葡聚糖酶，有各種來源、底物特異性的β- 1，3-葡聚糖酶，已知有對 褐藻淀粉、可得然膠、或酵母細胞壁、香菇菌糸、パス卜yッ等顯示出分解活性的β-1，3-葡 聚糖酶(專利文獻1~3)。
[0006] 現有技術文獻
[0007] 專利文獻
[0008] 專利文獻1:日本特開2005 - 34146號公報 [0009] 專利文獻2:日本特開2005 - 224230號公報 [0010] 專利文獻3:日本特表平10 - 507078號公報
[0011]然而，還不知道有對于作為β-1，3-葡聚糖的一種的、來自于裸藻屬的裸藻淀粉 顯示出分解活性的分解酶。
[0012] 裸藻淀粉在β-葡聚糖中，具有僅由β-1，3 -鍵構成的特征。另外，裸藻淀粉在所 有的種、變種的裸藻細胞內作為顆粒存在，其個數、形狀、粒子的均勻性根據種不同而具有 特征。雖然可以期待與其他的β-葡聚糖同樣地具有功能性，然而其作用機理有很多未知的 方面。
[0013] 此外，無論是分解裸藻淀粉的分解酶，還是分解裸藻淀粉而得的組合物都不為人 所知。
[0014] 另外，作為可以替代石油之類的耗竭性資源的非耗竭性資源，利用了屬于地域性 未利用資源的生物質等的能源供給體制的強化得到推進。
[0015]所謂生物質，被定義為可以再生的、來自于生物的有機性資源，且為除去化石資源 以外的資源。是由生物使用太陽能合成的物質，是只要存在有生命和太陽就不會枯竭的資 源，是指即使焚燒等也不會增加大氣中的二氧化碳的碳中性的資源。
[0016] 作為利用了生物質的能源之一，生物乙醇的開發正在推進之中。生物乙醇是通過 如下操作而制造，即，對甘蔗/玉米等的糖、或將米/麥/玉米等淀粉系原料用酶糖化了的物 質、或將間伐材/建筑廢料/稻草/甘蔗渣等的纖維素系原料用加壓熱水/酸/堿進行前處理、 并用糖化酶等糖化了的物質，進行乙醇發酵、蒸餾、脫水，由此可以制造(農林水產省生物質 事業化戰略(平成24年9月6日）參考資料主要技術的概要）。
[0017] 石油等化石燃料儲量多，被全球性地穩定供給。與之不同，生物乙醇由于原料不能 與糧食競爭、耕地面積不能侵犯糧食用的耕地等涉及可持續性的要求，多使用廢料等作為 原料，在現實狀況下，很難取得可以全球性地、或者一國整體性地穩定供給的供給量。由此， 一般而言，按照地域進行利用了生物質等的能源供給的對策受到推進。
[0018] 生物乙醇在一部分地域中已經被實用化，然而與石油等化石燃料相比價格競爭力 差，另外，在穩定供給、可持續性的方面存在有問題，因此現實狀況是，在日本國內還沒有充 分地普及，希望開發出在成本方面、穩定供給/可持續性的方面能夠實用化的生物乙醇的原 料。
[0019] 另一方面，裸藻雖然過去被認為難以大量培養，然而近年來，由于本發明人等的深 入研究，確立了大量培養技術，開辟出裸藻淀粉的大量供給的道路。由此，希望開發出來自 于已經能夠大量供給的裸藻的功能性物質。

【發明內容】

[0020] 發明所要解決的問題
[0021] 本發明是鑒于上述的問題而完成的，本發明的目的在于，提供對來自于裸藻屬的 裸藻淀粉顯示出分解活性的β-1，3-葡聚糖酶。
[0022] 本發明的另一個目的在于，提供可以作為將來自于裸藻屬的裸藻淀粉轉變為生物 乙醇原料的裸藻淀粉分解酶利用的β-1，3-葡聚糖酶。
[0023] 本發明的另一個目的在于，開發來自于已經能夠大量供給的裸藻的新的功能性物 質。
[0024] 用于解決問題的方法
[0025] 本發明人等進行了深入研究，結果發現，可以由裸藻屬得到具備裸藻淀粉分解活 性的新型的β-1，3-葡聚糖酶，從而完成了本發明。
[0026] 如前所述，蓄積裸藻淀粉的裸藻過去被認為難以大量培養，然而近年來，根據本發 明人等的深入研究，確立了大量培養技術，開辟出裸藻淀粉的大量供給的道路。另外，裸藻 淀粉的大量生產可以在裸藻的培養槽中進行，不像甘蔗/玉米等那樣需要廣大的農地，此 外，由于不是現在的糧食，因此在可持續性的方面也沒有問題。而且，由于裸藻的生產效率 好，因此被期待供給穩定性也能夠得到保證，作為生物乙醇的原料的候補受到期待。
[0027] 另外，由于裸藻淀粉是僅由β- 1，3-鍵構成的直鏈狀的多糖，因此與纖維素系原 料相比，可以簡化糖化工序。
[0028] 所述問題通過來自于裸藻(Euglena)屬、顯示出以下的性質的β- 1，3 -葡聚糖酶 解決。
[0029] (1)作用:水解0-1，3 -葡聚糖的0-1，3 -鍵。
[0030] 也可以采用還顯示出以下的性質的β-1，3-葡聚糖酶。
[0031] (2)底物特異性:至少分解裸藻淀粉。
[0032] (3)分解活性:裸藻淀粉分解活性相對于海帶多糖分解活性的比率為20%以上。
[0033] (4)最適 ρΗ:3·7 ~7.0。
[0034] (5)最適溫度：30 ~70°C。
[0035] (6)分解活性:裸藻淀粉分解活性相對于堿溶脹裸藻淀粉分解活性的比率為25% 以上。
[0036] 由于發現了來自于因近年來的本發明人等的研究而能夠大量供給的裸藻的新型 的β-1，3-葡聚糖酶，而開辟出裸藻的新的有效利用的道路。已知β-葡聚糖酶的底物特異 性等性質根據其來源而不同，由于發現了來自于裸藻的β-1，3-葡聚糖酶，而開辟出新型 的低分子化葡聚糖和其制造方法，進而開辟出使用了新型的低分子化葡聚糖的通向新型的 生物乙醇原料的供給的道路。
[0037] 也可以除了分解所述裸藻淀粉以外，還具有將堿溶脹裸藻淀粉及海帶多糖分解的 底物特異性，1小時以內的反應時間對應的最適溫度為50°C以上，從1小時到2小時的反應時 間對應的最適溫度為40°C以上，20小時以上的反應時間對應的最適溫度為60°C以下。
[0038] 另外，所述問題可以利用包含下述(a)或(b)的任意一個的氨基酸序列的β-1，3 - 葡聚糖酶解決。
[0039] (a)以序列編號2、4或6表示的氨基酸序列；
[0040] (b)在以序列編號2、4或6表示的氨基酸序列中，缺失、取代或附加了 1個或多個氨 基酸、且具有β- 1，3 -葡聚糖的β- 1，3 -鍵的水解活性的氨基酸序列。
[0041] 另外，所述問題可以利用包含以下的(a)或(b)的堿基序列的多核苷酸解決。
[0042] (a)以序列編號1、3或5表示的堿基序列；
[0043] (b)在以序列編號1、3或5表示的堿基序列中，缺失、取代或附加了1個或多個堿基、 且將具有β-1，3-葡聚糖的β-1，3 -鍵的水解活性的蛋白質編碼的堿基序列。
[0044] 此時，也可以是包含所述多核苷酸的重組載體。
[0045] 另外，也可以是具有所述重組載體的轉化體。
[0046] 另外，也可以是一種β-1，3 -葡聚糖酶的制造方法，其特征在于，在培養基中培養 所述轉化體，使培養物中生成蓄積所述β- 1，3-葡聚糖酶，從所述培養物中采集所述β- 1， 3-葡聚糖酶。
[0047] 也可以是用于將裸藻淀粉低分子化的酶制劑，其特征在于，含有所述β- 1，3-葡 聚糖酶。
[0048] 也可以是一種低分子化裸藻淀粉的制造方法，其特征在于，使所述β- 1，3-葡聚 糖酶作用于裸藻淀粉，生成低分子化裸藻淀粉。
[0049] 此時，也可以使葡糖苷酶與所述β- 1，3 -葡聚糖酶一起作用于所述裸藻淀粉，作 為所述低分子化裸藻淀粉的主生成產物，生成葡萄糖。
[0050] 發明效果
[0051] 根據本發明，可以將裸藻淀粉水解，得到包含直鏈寡糖、具有功能性的新型的低分 子化裸藻淀粉。
[0052] 另外，根據本發明，由于可以將包括裸藻淀粉在內的β-1，3-葡聚糖水解，因此通 過將本發明的低分子化裸藻淀粉的制造方法作為生物乙醇的糖化工序使用，就可以將裸藻 淀粉等β- 1，3-葡聚糖作為生物乙醇的原料。
【附圖說明】
[0053] 圖1是表示裸藻破碎溶液的借助疏水柱的海帶多糖分解活性部分的分離的圖表。
[0054] 圖2是表示裸藻破碎溶液的借助凝膠過濾柱的海帶多糖分解活性部分的分離的圖 表。
[0055] 圖3是表示裸藻破碎溶液的借助陰離子交換柱的海帶多糖分解活性部分的分離的 圖表。
[0056] 圖4是裸藻破碎溶液的海帶多糖分解活性部分的SDS-PAGE的凝膠的銀染色。
[0057] 圖5是重組EgCe 117Α的SDS-PAGE的凝膠的CBB染色圖像。
[0058]圖6是表示作為本發明的一個實施例的酶EgCe 117A的底物特異性的圖表。
[0059]圖7是表示作為本發明的一個實施例的酶EgCe 117A的最適溫度的圖表。
[0060]圖8是表示將作為本發明的一個實施例的酶EgCell7A在30 - 70°C溫育1 一 20小時 的情況下的海帶多糖分解活性的圖表。
[0061]圖9是表示作為本發明的一個實施例的酶EgCe 117A的最適pH的圖表。
[0062]圖10是表示木霉纖維素酶標準品與作為本發明的一個實施例的酶EgCell7A的裸 藻淀粉分解活性的圖表。
[0063]圖11是表示枯草菌葡聚糖酶與作為本發明的一個實施例的酶EgCell7A的裸藻淀 粉分解活性的圖表。
[0064]圖12是表示BSA添加量對作為本發明的一個實施例的酶EgCell7A的活性造成的影 響的圖表。
[0065]圖13是表示金屬添加量對作為本發明的一個實施例的酶EgCe 117A的活性造成的 影響的圖表。
[0066]圖14是表示裸藻的堿處理的條件對作為本發明的一個實施例的酶EgCell7A的活 性造成的影響的圖表。
[0067] 圖15是表示氯化鈉的添加量對作為本發明的一個實施例的酶EgCell7A的活性造 成的影響的圖表。
[0068] 圖16是紙層析的結果，表示作為本發明的一個實施例的酶EgCell7A對海帶多糖和 海帶寡糖的分解活性及轉糖基活性。
[0069]圖17是表示向堿溶脹裸藻淀粉中添加 EgCell7A、MoCel3A而使之反應的反應產物 的HPLC的結果的圖表。
[0070]圖18是薄層層析的結果，表示作為本發明的一個實施例的酶EgCell7A對海帶寡糖 的分解活性及轉糖基活性。
[0071 ] 圖19是表示重組EgCel81A的免疫印跡(western-blot)的結果的圖像。
[0072]圖20是表示重組EgCelSlA的各多糖的水解活性測定試驗的結果的圖表。
【具體實施方式】
[0073]以下，對本發明進行詳細說明。
[0074]本發明涉及來自于裸藻(Euglena)屬的β-1，3-葡聚糖酶。
[0075]在本發明的β-1，3-葡聚糖酶中，包含具有裸藻屬所產生的裸藻淀粉的分解活性 的蛋白質。
[0076]裸藻淀粉(Paramylon)是約700個葡萄糖利用β- 1，3-鍵聚合而得的高分子體 ⑴一 1，3 -葡聚糖），是裸藻屬所含有的貯藏多糖。裸藻淀粉粒子是扁平的回轉橢圓體粒子， 是β- 1，3-葡聚糖鏈以螺旋狀纏繞而形成。
[0077] 裸藻淀粉粒子被從所培養的裸藻屬中以任意的合適方法分離并純化為微粒狀，通 常被作為粉末體提供。
[0078] 例如，裸藻淀粉粒子可以通過（1)在任意的合適培養基中的裸藻細胞的培養；（2) 裸藻細胞從該培養基中的分離；（3)裸藻淀粉從分離出的裸藻細胞中的分離；（4)被分離出 的裸藻淀粉的純化；以