一種中空硫化鉬立方體納米電化學信號放大型傳感器及其制備方法與應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及材料科學和分析化學領域，具體為一種中空的硫化鉬立方體納米電化學信號放大型傳感器及其制備方法和在MicroRNA檢測方面的應用。
【背景技術】
[0002]電化學生物傳感器是以生物活性物質為敏感基元，以電化學電極為信號轉換器，對檢測前后電勢、電流或電容的變化加以測量的傳感器。電化學生物傳感技術因操作簡單、選擇性好、靈敏度高等優點而受到生物界和化學界研究者的廣泛關注。
[0003]MicroRNAs (miRNAs)是在真核生物中發現的一類內源性的具有控功能的非編碼RNA，其大小長約20?25個核苷酸，它在基因表達調控過程中起著重要的作用。近年來研究發現，一些重大疾病如癌癥、病毒感染、腫瘤等都與miRNA有關。由于miRNA是小分子蛋白質，因此提高miRNA的檢測靈敏度、選擇性和穩定性研究仍然是一個很棘手的問題。
[0004]近年來，類石墨的層狀過渡金屬二硫化物納米材料逐漸引起了人們的注意。硫化鉬(MoS2)是過渡金屬二硫化物的典型代表，具有和石墨類似的結構，由三個原子層(S-Mo-S)通過范德華力堆積而成，具有比表面積大、分散性好等特點。MoS2暴露在晶體表面的硫原子對金屬尤其是一些貴金屬具有很強的吸附作用。中空的立方體納米材料MoS2具有比片層M0S2更大的比表面積，因此，中空的立方體納米材料M0S2用于新型的電化學生物傳感器的構建有望顯著提高其靈敏度。金納米粒子(AuNPs)具有比表面積大，導電性好、生物兼容性好等特點，在電化學生物傳感器的應用中起到了重要的作用。
[0005]因此，結合中空的M0S2立方體納米材料大的比面積與AuNPs優良的導電性能構建新型的電化學生物傳感器，結合信號放大技術用于miRNA的靈敏檢測，在疾病的臨床診斷等方面具有較好的應用前景。

【發明內容】

[0006]為了克服上述現有技術中的不足，本發明提供了一種能高靈敏、高選擇性的檢測miRNA的電化學生物傳感器的制備方法，使用中空的硫化鉬立方體納米材料和金納米為電極敏感材料。
[0007]本發明的目的是這樣實現的:
一種中空硫化鉬立方體納米電化學信號放大型傳感器，玻碳電極表面涂有敏感膜為中空的硫化鉬立方體納米材料和金納米材料；
所述的中空的硫化鉬立方體納米材的制備方法，具體步驟如下:
(1)將5?10mM MnS04.出0、50?100 mM乙醇加入500?1000 mL三次蒸餾水中經超聲分散得到混合分散液；
(2)將80?100mM ΝΗ4ΗΟ)3加入500?1000 mL三次蒸餾水中經超聲分散得到ΝΗ4ΗΟ)3分散液，隨后加到上述步驟(1)的混合液中，在30?60°C下加熱攪拌5?10 h; (3)溶液自然冷卻到室溫，將得到的白色MnC03沉淀離心、洗滌、干燥；
(4)稱取0.1?0.5g MnC03分散在20?70 mL的三次蒸餾水中，并超聲20?60 min；
(5)稱取0.5?1.0g Na2Mo4 ' 2H20加入上述步驟(4)的混合液中，并超聲5?10 min，隨后加入2.1?3.0 g的L-半胱氨酸，再超聲5?10 min，用三次蒸饋水稀釋到80 mL，轉移至反應釜中進行水熱反應，反應溫度為150?200 °C，反應時間為12?30 h。反應結束后，自然冷卻到室溫，離心、洗滌、干燥，得到黑色的MnS@MoS2固體；
(6)稱取40?100mg的MnS@MoS2固體分散在20?50 mL(0.5-l mol/L)的鹽酸溶液中，在室溫下攪拌12?48 h去除MnS，經離心、洗滌、干燥，得到黑色的MoS2固體。
[0008]所述步驟(1)(2)(4)(5)中超聲的頻率為53 kHz。
[0009]所述步驟(3)(5)中洗滌為分別用三次蒸餾水和乙醇洗滌三次。
[0010]所述步驟(3)(5)中干燥為真空干燥，溫度為50?80 °C，干燥時間為12?24 h。
[0011]所述的以中空的硫化鉬立方體納米材料為電極敏感材料制備信號放大型生物傳感器檢測miRNA的方法，具體步驟如下:
(1)稱取0.5?1.5mg 1032超聲分散于1~2.5 mL水中，取4?10 yL該溶液涂滴于打磨好的玻碳電極表面，自然晾干；
(2)將修飾好的電極于0.1%~1% HAuCU (含0.1?0.5 mol/L ΚΝ03)溶液中電沉積納米金20?60 s；
(3)取4?10pL 5.0 X 10—9 mol/L巰基修飾的一端帶有生物素的probe DNA涂滴于電極表面，室溫反應6?12 h，將其通過Au-S鍵固定于電極表面；
(4)用三次蒸餾水沖洗掉電極表面過量的probeDNA，將4?8 yL 0.5-1.5 m mol/L的巰基己醇(MCH)和4?8 pL 0.5%?2 %的牛血清白蛋白(BSA)分別涂滴于電極表面，放置15?35min，用于除去非特異性吸附；
(5 )用三次蒸餾水沖洗電極表面，隨后，于電極表面滴加不同濃度的MiRNA，50?80 °C水浴中孵育40?75 min；
(6)用三次蒸餾水沖洗電極表面，然后將電極浸入20pL (5-10 m mol/L)的Tris緩沖溶液(含0.1?0.8 m mol/L抗壞血酸憐酸酯和0.5?1.5 mmol/L MgCl2)中20?60 min；
(7)在電極表面滴加4?10pL,0.5-1.5 mg/mL的堿性磷酸酶標記的鏈霉親和素(SA_ALP)放置15?50 min，最后將電極置于含有2.5?5 mmol/L三羧基甲基磷脂(TCEP)和0.5?3mmol/L的二茂鐵甲醇溶液中檢測電化學信號。
[0012]所述步驟(1)中超聲的頻率為53 kHz。
[0013]積極有益效果:
(1)本發明采用的中空的硫化鉬立方體納米材料和納米金相結合作為電極的敏感材料，顯著提高了電極的有效面積和導電性能，可有效提高傳感器的靈敏度和降低方法的檢出限；(2)制備材料為全固態的，不含對人體有毒的、污染環境的無機納米材料；(3)本發明的方法制備得到的生物傳感器結合信號放大技術檢測miRNA，具有靈敏度高和選擇性好的優點；(4)本發明制備的傳感器具有靈敏度高、選擇性好、穩定性好、成本低廉、綠色環保等優點。
【附圖說明】
[0014]圖1為制備的MnC03立方體的掃描電鏡(SEM)圖；
圖2為制備的中空的硫化鉬立方體納米材料的圖；
圖3 A是Q-t的線性圖;8是0^1/2線性方程的斜率，其中a為裸玻碳電極(GCE)，b為GCE上修飾了硫化鉬和金納米；
圖4為不同濃度miRNA的差分脈沖伏安圖。從a到j對應的miRNA的濃度分別是0，1.0 X10—16，1.0 X 10—15，1.0 X 10—14，5.0 X 10—13，1.0 X 10—13，5.0 X 10—12，1.0 X 10—12，1.0 X 10—11，1.0X 10—1(3 mol/L，插圖是峰電流和miRNA的濃度的負對數之間的線性關系。
【具體實施方式】
[0015]下面結合附圖具體實施例，對本發明做進一步的說明:
一種中空硫化鉬立方體納米電化學信號放大型傳感器，玻碳電極表面涂有敏感膜為中空的硫化鉬立方體納米材料和金納米材料；
所述的中空的硫化鉬立方體納米材的制備方法，具體步驟如下:
(1)將5?10mM MnS04.H20、50?100 mM乙醇加入500?1000 mL三次蒸餾水中經超聲分散得到混合分散液；
(2)將80?100mM NH4HC03加入500?1000 mL三次蒸餾水中經超聲分散得到NH4HC03分散液，隨后加到上述步驟(1)的混合液中，在30?60°C下加熱攪拌5?10 h;
(3)溶液自然冷卻到室溫，將得到的白色MnC03沉淀離心、洗滌、干燥；
(4)稱取0.1?0.5g MnC03分散在20?70 mL的三次蒸餾水中，并超聲20?60 min；
(5)稱取0