專利名稱：多功能阿達瑪變換顯微圖像分析儀的制作方法
技術領域：
本發明公開了一種把阿達瑪變換(Hadamard Transform)多通道空間成像技術與顯微技術相結合，用一個檢測器(光電倍增管)獲取微小物體的三維阿達瑪變換顯微熒光、顯微拉曼和顯微光度圖像的新方法及新儀器。且該圖像能精確地提供許多與微小物體有關的定性及定量信息。本發明屬于醫學儀器技術領域、屬于分析測試領域，也屬于生物化學領域。它是光調制技術、儀器制造、計算機及現代儀器分析等多種技術結合的產物。
阿達瑪變換光譜(Hadamard Transform Spectroscopy)是過去二十幾年發展起來的類似與傅立葉變換光譜(Fourier Transform Spectroscopy)的一種光譜調制技術，阿達瑪變換給分析儀器帶來了高的信噪比、多通道同時檢測和成像能力以及能量分布的優點[M.O.Harwit，N.J.A.Sloane，“Hadamard Transform Optics”，AcademicNew York，1980]。阿達瑪變換多通道顯微成像技術是目前國際上前沿研究課題之一。目前，國外已在阿達瑪變換顯微拉曼光譜方面取得了進展[P.J.Treado，A.Govil，M.D.Morris，K.D.Sternitxke and R.L.MccreeryAppl.Spectrosc.，441270，1990]，但迄今為止，尚未見有關阿達瑪變換顯微熒光圖像和顯微光度圖像方面的報道。也未見將這三種圖像技術融合一體的商品化儀器，這是因為在這三種技術中，阿達瑪變換顯微熒光圖像技術是最復雜最難實現的，因為阿達瑪變換多通道圖像技術的實現，要在不同的時間內采集信號的空間調制強度，這就要求為了獲得不失真的微弱熒光圖像，必須保持熒光強度在一定時間內相對穩定，這種相對穩定對于拉曼及吸收光譜來說易于滿足，由于受熒光壽命、熒光衰減的影響，采集熒光圖像確存在一些困難。
顯微鏡在細胞生物學和臨床醫學領域中是一種最基本也是最重要的分析儀器。目前，建立在顯微技術基礎上用于細胞或其他微小物體定性或定量分析的儀器有顯微光度計、顯微熒光計及各種顯微圖像分析儀。前兩種儀器常常被用來對細胞或其他微小物體進行定量分析，而后一類儀器則常常用于細胞或微小物體的圖像分析。這些儀器在定量分析速度、分析精度及分析靈敏度等方面均存在著不足之處，而且常規儀器往往難以同時提供被分析試樣的顯微圖像和定量分析結果。
本發明的目的在于把阿達瑪變換空間成像技術與顯微技術結合起來，以一個靈敏的光電轉換器件(光電倍增管)作檢測器，建立一種能用于顯微拉曼、顯微熒光和顯微光度定量圖像分析和光譜分析等多功能的新儀器;為細胞生物學和臨床醫學分析提供一種快速、準確、靈敏，能提供微小物體的顯微圖像和定量分析結果的新的分析方法。
本發明的目的是這樣實現的本發明所制造的儀器由光源、熒光顯微鏡、光斑壓縮光學系統、阿達瑪變換二維調制模板及二維步進電機驅動系統、單色儀、光電倍增管、CCD攝像機、12位數模轉換板、楨存儲板及微型計算機組成。顯微鏡載物臺上的細胞或其他微小物體在光的照射下(激發光或透射光)產生光信號(熒光信號、拉曼信號、吸收信號)，所產生的光信號由顯微鏡的物鏡所采集，經過全反射鏡反射進入水平光路進行空間調制，或直接成像于CCD攝像機的焦平面上攝取物體的圖像信號。進入水平光路的光信號通過透鏡組成像于二維阿達瑪變換模板上，由阿達瑪變換模板對圖像信號進行空間調制，調制后的信號壓縮后進入光柵單色儀的入射狹縫，經單色儀分光后獲得某一波長的單色光，再由光電倍增管進行光電轉換，電信號經放大電路放大，由計算機AD卡實現模數轉換，數字信號即被儲存于計算機內，完成一個采樣過程，分析熒光試樣時采用計算機軟件對熒光衰減進行同步校正，全部采樣完成后，數字信號經快速阿達瑪變換解碼程序被還原成試樣的三維阿達碼圖像。通過計算機軟件對圖像進行分析處理獲得有關的定量分析結果。與已有技術相比，由于本發明在水平光路上采用了阿達瑪變換模板對圖像信號進行了空間調制，采用了圖像壓縮以及與單色儀光學匹配技術，采用了以理論推導校正公式編寫的軟件，對采樣過程中的衰減進行同步校正，采用光電倍增管作光電轉換器件，使該儀器能用一個檢測器測得空間變換光譜信息，從而在國際上首次獲得了微小試樣的三維阿達瑪變換微弱熒光圖像以及光度圖像，提高了儀器的信噪比、提高了定量分析精度。由于這種多通道檢測能同時檢測出多個分析信號及背景信號的強度，并從分析信號中同步扣除背景信號強度，因而使本方法在分析速度和分析準確度方面明顯優于常規顯微光度分析和顯微熒光分析方法。同時，在垂直方向上，CCD能直接攝取微小物體的圖像，起著顯微圖像分析儀的作用，通過CCD近攝物鏡直接攝取X光片或其他物體，從而使該儀器還具備常規圖像分析儀的功能，進一步拓寬了本儀器的功能和使用范圍。
研制的儀器測量精度比圖像分析儀高16倍(光強分度圖像分析儀為256單位，本儀器為4096單位)，靈敏度比0.02 Lux的CCD攝像機高，測量信噪比較常規儀器高8-20倍，特別適于微弱光信號檢測。對單個細胞的熒光強度及細胞的圖像分析結果重現性好，RSD%低于10%。
下面結合附圖
對本發明作進一步說明圖(1)是多功能阿達瑪變換顯微圖像分析儀的原理圖(結構框圖)。
圖(1)中，1.溴鎢燈，L1…L6透鏡，2.聚焦鏡，由1，L6，2.構成顯微鏡的透射光照明系統，3.載物臺，4.物鏡，5.激發光源(高壓汞燈、氙燈或激光)，M雙色束分光鏡，P全反射鏡，CCDCCD攝像機，6.阿達瑪光欄，7.阿達瑪變換調制模板，8.光柵單色儀，由L1，L2，6，7，L3，L4及8組成水平光路系統，9.光電倍增管，10.信號放大電路，11.12 bit AD/DA模數轉換板，12.計算機，13.阿達瑪變換調制模板機械傳動裝置及計算機接口，14.楨存儲板，15.光柵單色儀掃描自動控制。
圖(1)中，所分析的試樣置顯微鏡載物臺上，分析試樣的圖像信號(透射光、熒光或拉曼圖像)由物鏡(4)所采集，當用激發光照明時，物鏡(4)還起到對激發光聚焦的作用。圖像可直接進入CCD攝像機，由CCD攝像機攝取的圖像經楨存儲板(14)處理后被儲存在計算機(12)內。由軟件對該圖像進行處理能提取直觀試樣的表觀圖像信息。由物鏡采集的圖像信號經全反射鏡(P)反射進入水平光路系統，圖像經透鏡組L1L2清晰成像于阿達瑪變換模板平面上，移動阿達瑪變換模板對圖像信號進行空間調制，阿達瑪變換光欄用來限制圖像空間調制范圍。調制后的圖像信號經透鏡組L3L4壓縮后，進入光柵單色儀(8)，信號經光柵單色儀分光后某一波長的單色光信號由光電倍增管(9)轉換成電信號，電信號經放大電路(10)放大后進入計算機內AD卡進行模數轉換，數字信號被存儲在計算機(12)內，完成一個完整的采樣過程。全部采樣過程完畢后(n＝255時，采255次調制信號)，調制信號經快速阿達瑪變換解調還原成試樣的三維阿達瑪變換顯微圖像，該圖像包含兩個空間維和一個光譜強度維，用軟件對該圖像進行處理就能獲得所需的定性定量信息。
實施例1，阿達瑪變換顯微圖像分析儀如原理圖所示在熒光顯微鏡上安裝一個帶全反射鏡的接口，把全反射鏡插入光路，光線進入水平光路系統，把全反射鏡移出光路，光線進入CCD攝像機并成像于CCD攝像機焦平面。由CCD攝像機、楨存儲板、計算機及圖像處理軟件構成了該儀器的垂直光路系統，垂直光路系統用來獲得試樣的形貌圖像。將由L1，L2，L3，L4組成的透鏡組及阿達瑪變換模板和光欄按圖(1)所示組成儀器的水平光路系統。其中由L1L2組成的透鏡組使試樣成像于模板上，由L3L4組成的透鏡組對經由模板調制的光信號進行壓縮，壓縮后的信號進入光柵單色儀的入射狹縫，與光柵單色儀的光學參數匹配。采取在石英玻璃基片上鍍金屬膜，然后采用光刻技術刻制所需的二維阿達瑪變換模板及光欄，把模板及光欄按圖(1)所示安裝在水平光路系統中，其中光欄固定不動，模板能在二維方向上自如移動，以對光信號進行空間調制。二維模板固定在二維機械傳動裝置上，該裝置是采用步進電機帶動千分尺轉動，通過千分尺把電機轉動變成線性平動，達到推動模板移位設計的。機械傳動裝置由計算機軟件、計算機接口及步進電機功率放大板來控制驅動，該系統能同時控制三臺步進電機自如運轉，其中兩臺電機用于控制模板二維精確移位，一臺用于控制光柵單色儀光譜掃描，把水平光路系統及控制二維模板精確移位的部件按圖(1)安裝調試后，即可用模板對圖像信號進行調制，并可通過計算機自動控制光柵單色儀進行光譜掃描，以獲得試樣的光譜信息。該儀器的分光系統采用商品化的光柵單色儀，檢測器采用光電倍增管，模數轉換采用12 bit模數/數模轉換卡，數據及圖像處理采用80386微型計算機完成，光電倍增管輸出的電信號采用自制的兩級集成運算電路，放大倍數為150-700倍。將以上各種部件按圖(1)組裝后即可組成為阿達瑪變換顯微圖像分析儀。在該儀器上可進行阿達瑪變換顯微熒光圖像及顯微光度圖像分析。當要進行顯微拉曼圖像分析時，需將球形超高壓汞燈激發光源換成氬離子激光光源，即可在該儀器上進行阿達瑪變換顯微拉曼圖像分析。該儀器調試后即可用于實際試樣分析。
實施例2，人乳腺癌細胞的細胞核形貌和DNA含量定量分析表(1)-表(6)分別為湖北省腫瘤醫院用該儀器分析6例人乳腺癌細胞的定量分析數據。6例人乳腺癌患者，每個患者最少分析20個細胞，每個細胞測兩個定量數據DNA的含量(用Au為單位)和細胞核形貌(即面積，用pixels為單位)。表(7)為用該儀器分析洋蔥細胞內DNA含量和細胞核的面積的定量分析數據，比較表(1)-表(6)和表(7)，可明顯發現兩者之間的差別。
權利要求
1.一種把阿達瑪變換多通道空間成像技術與顯微鏡技術相結合，用一個檢測器獲取微小物體(細胞試樣，組織試樣，單晶礦物等)三維阿達瑪變換的顯微熒光、顯微光度和顯微拉曼圖像的多功能阿達瑪變換顯微圖像分析儀。其特征是采用阿達瑪變換方法，以二維阿達瑪變換模板對由顯微鏡物鏡所采集的熒光、透射光或拉曼光信號進行空間調制(二維信號編碼)，調制的信號經單色儀分光后由光電倍增管檢測，采集的系列調制信號由快速阿達瑪變換計算機程序進行解調還原成試樣的圖像，再從圖像中獲取精確的定量信息；
2.按權利要求1所述的多通道空間成像技術的阿達瑪變換模板掩膜光刻制造技術，其特征是在石英玻璃基片上鍍金屬膜，然后采用光刻技術刻制所需模板;全部光學系統采用石英光學元件，因而光譜使用范圍適宜于從紫外可見到紅外;
3.按權利要求1和2所述的多通道空間成像技術的模板二維移動的機械傳動裝置及計算機控制接口和驅動電路，其特征是通過自行設計的接口及驅動電路，能用計算機自如地控制三臺(兩臺用于二維模板移動，一臺用于光譜掃描)步進電機運轉;
4.按權利要求1所述的多功能阿達瑪變換顯微圖像分析儀的水平光路系統，其特征是由全反射鏡P反射的光信號，經透鏡組壓縮并成像于模板上。由模板對圖像信號進行空間調制，調制后的信號再經與單色儀光學匹配的透鏡組壓縮，進入單色儀入射狹縫;
5.按權利要求1所述的快速阿達瑪變換及圖像處理系列軟件，包括熒光衰變校正軟件，其特征是可以對儀器進行自動控制、光譜掃描、圖像生成、圖像處理及定量分析結果統計等。
全文摘要
本發明公開了一種阿達瑪變換空間多通道成像技術與顯微技術相結合，并用一個檢測器(光電倍增管)提供微小物體的圖像和定量分析結果的新方法，依據研制出的多功能阿達瑪變換顯微圖像分析儀可進行三維阿達瑪變換顯微熒光、顯微拉曼和顯微光度圖像分析和光譜分析，并能開展常規圖像分析、顯微圖像分析及顯微光度分析。本發明比常規圖像分析儀測量精度高16倍，測量信噪比高8—20倍，靈敏度比0.02Lux的CCD攝像機高，特別適于微弱光信號檢測。對單個細胞的熒光強度及細胞的圖像，分析結果重現性好，RSD％低于10％。
文檔編號G01J3/42GK1114049SQ9410775
公開日1995年12月27日 申請日期1994年6月23日 優先權日1994年6月23日
發明者陳觀銓, 梅二文 申請人:武漢大學