一種靶向乳腺癌干細胞的雙特異性嵌合抗原受體基因修飾的t淋巴細胞的制備方法及其產品的制作方法
【專利摘要】本發明提供了一種靶向乳腺癌干細胞的雙特異性嵌合抗原受體基因修飾的T淋巴細胞的制備方法，其中包括如下特征：整合素相關蛋白(CD47)和轉錄共激活因子(TAZ)兩者均在乳腺癌組織中高表達，尤其在乳腺癌干細胞中表達特異升高；通過建立的CD47和TAZ過表達乳腺癌細胞，其表現出更強的增殖和轉移能力以及腫瘤干細胞特征；本發明靶向該兩者乳腺癌干細胞抗原CD47和TAZ胞外域，免疫產生特異性結合的單克隆株，通過基因重組獲得與兩者特異結合的單鏈抗體，因而構建成含抗人CD47和TAZ的雙特異嵌合抗原受體基因重組到病毒載體上并轉染人T淋巴細胞，高表達該雙特異性嵌合抗原受體基因，可特異結合表達人CD47和TAZ的乳腺癌干細胞，激活第一信號和共刺激信號而引發抗乳腺癌毒性活性，在體內體外試驗抗腫瘤具有很強殺傷活性。
【專利說明】
一種靶向乳腺癌干細胞的雙特異性嵌合抗原受體基因修飾的 T淋巴細胞的制備方法及其產品
技術領域
[0001] 本發明涉及一種靶向乳腺癌干細胞的嵌合抗原受體基因修飾的T淋巴細胞的制備 方法，其中包括如下特征：乳腺癌組織和乳腺癌干細胞特異性高表達整合素相關蛋白 (⑶47)和轉錄共激活因子(TAZ)，構建的⑶47和TAZ過表達乳腺癌細胞表現出更強的增殖、 轉移能力以及腫瘤干細胞特征;本發明靶向乳腺癌干細胞抗原CD47和TAZ胞外域，獲得與兩 者特異結合的單鏈抗體，構建成含抗人CD47和TAZ的雙特異嵌合抗原受體基因 （double chimeric antigen receptor，Di-CAR)，重組到病毒載體上并轉染人T淋巴細胞，可特異結 合表達人CD47和TAZ的乳腺癌干細胞，在體內體外試驗激活免疫信號而引發強大的抗乳腺 癌毒性;本發明還提供了一種含通過上述方法而得到的自體T淋巴細胞制備的試劑盒，可用 于制備靶向乳腺癌殺傷的嵌合抗原受體基因修飾的T淋巴細胞。
【背景技術】
[0002] 淋巴細胞免疫技術在國內外已經用于臨床治療惡性腫瘤，并取得一些臨床療效， 主要包括細胞因子誘導殺傷細胞、細胞毒性T淋巴細胞和浸潤性T淋巴細胞等，但其為非特 異性免疫作用，由于腫瘤細胞本身免疫逃逸和抗原隱蔽性，其對體內腫瘤細胞清除還非常 有限。
[0003] 嵌合抗原受體基因修飾淋巴細胞技術的出現為臨床治療癌癥提供了新的方向，其 技術在體內能激活自身免疫系統，持續性地靶向腫瘤細胞進行殺傷，最終達到完全清除惡 性腫瘤細胞的目的，因而該技術給癌癥臨床治療提供更好的應用平臺。但是由于在實體瘤 方面腫瘤抗原發現有限，而且很多腫瘤抗原除了在腫瘤細胞本身表達，也在正常組織中表 達，因而無法對腫瘤細胞產生很好的特異性，殺傷腫瘤細胞同時也損傷了正常組織和器官， 找到具有特異性的腫瘤抗原是該技術應用的關鍵。
[0004] 本發明提供了在乳腺癌組織和乳腺癌干細胞特異性高表達整合素相關蛋白 (CD47)和轉錄共激活因子(TAZ)，CD47和TAZ過表達乳腺癌細胞表現出更強的增殖、轉移能 力以及腫瘤干細胞特征，以結合腫瘤細胞特異表達的CD47和TAZ的雙特異嵌合抗原基因重 組到病毒載體上并轉染人T淋巴細胞，高表達該雙特異性嵌合抗原受體基因，可特異結合表 達CD47和TAZ的乳腺癌細胞，特別是乳腺癌干細胞;激活第一信號和共刺激信號而體內體外 引發抗乳腺癌細胞毒性活性，將有效地清除體內惡性腫瘤細胞和延長患者生存期。

【發明內容】

[0005] 本發明針對現有臨床應用T淋巴細胞技術靶向腫瘤細胞殺傷特異性差；以及在體 內激活患者自身免疫作用抗腫瘤不足，特別對具有高耐藥性、自我更新和成瘤性等的乳腺 癌干細胞無殺傷作用，造成大多數惡性腫瘤臨床治療有限。本發明在前期研究工作中發現 乳腺癌組織、乳腺癌細胞和乳腺癌干細胞均特異表達的兩個腫瘤抗原CD47和TAZ。同時我們 通過構建的CD47和TAZ過表達慢病毒載體，包裝成病毒后轉染乳腺癌細胞，發現其具有更強 的增殖和轉移能力，并表現出腫瘤干細胞表型，和體內成瘤實驗具有腫瘤干細胞特征。
[0006] 本發明根據該兩個腫瘤抗原CD47和TAZ的胞外區通過雜交瘤技術獲得與兩者特異 性結合反應的單克隆細胞株和單克隆抗體，蛋白測序確定單克隆抗體的重鏈和輕鏈的可變 區，利用基因 PCR技術將重鏈和輕鏈通過鏈接子(linker)連接產生單鏈抗體(single chain antibody fragment，scFv)，在酶聯免疫法和細胞流式檢測該兩個scFv能特異結合⑶47和 TAZ兩個腫瘤抗原，這兩個scFv可以作為結合CD47和TAZ兩個腫瘤抗原的抗體。
[0007] 本申請發明人利用DNA修飾酶-1011易位甲基胞嘧啶雙加氧酶2(teneleven translocation methylcytosine dioxygenase 2，TET2)可抑制介素6(interleukin 6，IL_ 6)轉錄表達，我們發現將TET2在T淋巴細胞中高表達可抑制IL-6基因表達和分泌，從而阻止 了T淋巴細胞分泌IL-6而產生的"免疫因子風暴"。因而我們根據這些科研結果，構建成含特 異結合⑶47以及TAZ的雙特異嵌合抗原受體基因，并引入TET2以及⑶28、⑶137和⑶3ζ胞內 信號區的基因片段，重組到病毒載體上并轉染人Τ淋巴細胞，高表達該雙特異性嵌合抗原受 體基因，體內體外試驗抗腫瘤具有很強殺傷毒性。
[0008] 本發明涉及一種靶向乳腺癌干細胞的嵌合抗原受體基因修飾的Τ淋巴細胞的制備 方法，其特征在于，CD47和ΤΑΖ兩者均在乳腺癌組織中高表達，尤其在乳腺癌干細胞中表達 特異升高;通過建立的CD47和ΤΑΖ過表達乳腺癌細胞，其表現出更強的增殖和轉移能力以及 腫瘤干細胞特征;本發明靶向該兩者乳腺癌干細胞抗原CD47和ΤΑΖ胞外域，免疫產生特異性 結合的單克隆株，通過基因重組獲得與兩者特異結合的單鏈抗體，因而構建成含抗人CD47 和ΤΑΖ的雙特異嵌合抗原受體基因重組到病毒載體上并轉染人Τ淋巴細胞，高表達該雙特異 性嵌合抗原受體基因，可特異結合表達人CD47和ΤΑΖ的乳腺癌干細胞，激活第一信號和共刺 激信號而引發抗乳腺癌毒性活性，在體內體外試驗抗腫瘤具有很強殺傷活性。
[0009] 所述雙特異性嵌合抗原受體(Di-CAR)基因的cDNA構建在病毒載體中，并轉染Τ淋 巴細胞，再將T淋巴細胞培養到第14天，獲得Di-CAR-T細胞;通過熒光定量PCR技術檢測，轉 染了Di-CAR病毒載體的T淋巴細胞其表達Di-CAR基因高于未轉染的T淋巴細胞為50倍以上；
[0010] 所獲得的T淋巴細胞，高表達該雙特異性嵌合抗原受體基因，可特異結合表達CD47 和TAZ的乳腺癌干細胞，同時激活第一信號和共刺激信號而引發抗腫瘤細胞毒性活性，體內 體外試驗抗腫瘤具有很強殺傷毒性;其高表達其特異標志物CD3+/CD8+，陽性率高于90 %以 上，而調節性T淋巴細胞⑶4+/⑶25+/Foxp3+陽性率低于5%以下。
[0011] 本發明所述的⑶47和TAZ基因和蛋白質在乳腺癌組織中高表達，通過熒光定量PCR 檢測，與正常乳腺組織相比，兩者在乳腺癌組織中表達分別為89.00和134.55倍；蛋白印跡 分析檢測，兩者在乳腺癌組織中表達分別為正常乳腺組織的23.49和35.67倍。
[0012] 優選地，所述的CD47和TAZ基因和蛋白質在乳腺癌干細胞中高表達，體外培養獲得 的CD44+CD24-乳腺癌干細胞熒光定量PCR檢測，與乳腺癌細胞相比，兩者在乳腺癌組織中表 達分別為23.45和54.33倍;蛋白印跡分析檢測，兩者在乳腺癌干細胞中表達分別為乳腺癌 細胞的11.56和25.61倍。
[0013] 本發明還通過構建CD47和TAZ兩個慢病毒載體，分別包裝后轉染乳腺癌細胞，其高 表達CD47和TAZ基因與蛋白；體外細胞增殖培養分析，該兩種CD47和TAZ病毒轉染的乳腺癌 細胞在第7天增殖倍數分別為未轉染的乳腺癌細胞增殖的9.44和12.56倍;Transwell細胞 迀移實驗中，該兩種細胞發生了明顯的迀移，而未轉染的乳腺癌細胞迀移不明顯。而且CD47 和TAZ兩個慢病毒轉染的乳腺癌細胞通過流式細胞儀檢測，發現兩者表達CD44+CD24-表型 明顯高于未轉染的乳腺癌細胞，即該兩種乳腺癌細胞的CD44+CD24-陽性率分別為67.56 % 和78.90%，而未轉染的乳腺癌細胞僅為1.45%。
[0014] 裸鼠體內成瘤實驗中，僅100個CD47和TAZ病毒轉染的乳腺癌細胞接種時，在第7天 就形成腫瘤，而未轉染的乳腺癌細胞接種1〇 6數量級時方形成腫瘤，表明高表達了 CD47和 TAZ的乳腺癌細胞具有腫瘤干細胞的表型和特性。
[0015] 本發明所述的含特異結合CD47的特異嵌合抗原受體基因，包括特異結合CD47的單 鏈抗體并串聯了兩個共刺激分子胞內域(CD28和CD137)和CD3G胞內信號區的基因片段，可 激活第一信號和共刺激信號，即激活機體免疫應答而引發抗腫瘤細胞毒性活性和腫瘤凋亡 作用。
[0016] 本發明所述的TAZ的特異嵌合抗原受體基因，包括TAZ的單鏈抗體并鏈接了抑制 IL-6基因轉錄的TET2基因片段，抑制T淋巴細胞分泌IL-6而防止了 "免疫因子風暴"。
[0017] 同時所述雙特異性嵌合抗原受體基因之間鏈接了弗林蛋白酶切割位點，其在細胞 內蛋白翻譯后可產生兩個獨立發揮功能的嵌合抗原受體。
[0018] 本發明所述方法中τ淋巴細胞來源于自體靜脈血、自體骨髓、臍帶血和胎盤血等的 單個核細胞。優選地，來源于癌癥患者手術一個月后、放化療一個月后采集的新鮮外周血或 骨髓。
[0019] 本發明所述將人IFNy-信號肽-scFv(CD47)-CD8a鉸鏈區-CD28-CD137-CD3G胞內 區，以及scFv(TAZ)-IgD鉸鏈區-TET2通過Furin切割位點和連接序列連接在一起，形成重組 基因序列，基因序列通過化學合成獲得，形成完整的雙特異性嵌合抗原受體基因的cDNA，即 Di-CAR〇
[0020] 將Di-CAR構建在病毒載體中，并轉染患者自體T淋巴細胞，再將T淋巴細胞培養到 第14天，獲得Di-CAR-T淋巴細胞。通過熒光定量PCR技術檢測，轉染了Di-CAR病毒載體的T淋 巴細胞其表達Di-CAR基因高于未轉染的T淋巴細胞為50倍以上。蛋白印跡技術檢測其Di-CAR融合蛋白表達水平，可表達scFv(CD47)-CAR 53kDa和scFv(TAZ)-CAR 42kDa的融合蛋 白。
[0021] 本發明所述方法中來源50ml外周血單個核細胞誘導培養獲得T淋巴細胞，增殖倍 數達1000倍以上，培養到14天T淋巴細胞數達3 X109以上。
[0022]本發明所述方法中培養獲得的T淋巴細胞，高表達其特異標志物⑶3+/CD8+，陽性 率高于90%以上，而調節性T淋巴細胞⑶4+/CD25+/Foxp3+陽性率低于5%以下，體內體外試 驗具有很強抗腫瘤殺傷毒性。
[0023]本發明使用的T淋巴細胞激活培養器為使用小鼠抗人⑶3單克隆抗體(0KT3)包被 的培養器，包括細胞培養板、培養皿和培養瓶等，優選地為細胞培養皿。
[0024]本發明使用的細胞培養基為淋巴細胞無血清培養基加入含l-500ng/mll-500ng/ ml IL-la、10-2000活性單位(IU)/ml IL-2和5% (體積比）自體血清或胎牛血清，如CellGro SCGM、A頂-V、X-VIV0和GT-T551等商品化產品。
[0025]本發明還提供了一種制備靶向乳腺癌干細胞的嵌合抗原受體基因修飾的T淋巴細 胞的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括：
[0026] (1)獲得如上所述的穩定表達Di-CAR的病毒載體；
[0027] (2)T淋巴細胞因子，包括IL-la和IL-2;
[0028] (3)0ΚΤ3 包被 75cm2 培養瓶；
[0029] (4)淋巴細胞培養基，包括無血清培養基；
[0030] (5)淋巴細胞分離液；
[0031] (6)生理鹽水；
[0032] (7)使用說明書；
[0033] 其中，所述使用說明書包括如上所述的方法。
[0034] 本發明還提供了上述方法及其試劑盒制備T淋巴細胞，可用于乳腺癌的臨床免疫 治療。
【附圖說明】
[0035] 圖1中表示為⑶47和TAZ基因在乳腺癌組織和正常乳腺組織中表達水平
[0036]圖2表示為蛋白印跡技術檢測⑶47和TAZ蛋白在乳腺癌患者和正常乳腺組織中表 達水平
[0037]圖3表示為CD47和TAZ基因在乳腺癌干細胞和乳腺癌細胞中表達水平
[0038]圖4表示為蛋白印跡技術檢測CD47和TAZ蛋白在乳腺癌干細胞和乳腺癌細胞中表 達水平
[0039] 圖5表示為MTT法檢測效果例三中制備的CD47-MCF7、TAZ-MCF7和MCF-7細胞增殖活 性曲線
[0040] 圖6表示為效果例三中制備的CD47-MCF7、TAZ-MCF7和MCF-7細胞流式細胞檢測 [00411圖7表示為Di-CAR慢病毒轉染T淋巴細胞后經培養后的表達水平
[0042]圖8表示為蛋白印跡技術檢測Di-CAR融合蛋白在Di-CAR慢病毒轉染乳腺癌患者來 源的T淋巴細胞表達水平
[0043]圖9表示為實施例一制備的乳腺癌患者Di-CAR慢病毒轉染T淋巴細胞流式細胞結 果圖
[0044] 圖10表示為乳腺癌患者來源Di-CAR慢病毒轉染T淋巴細胞(Di-CAR-T)對MCF-7和 BSC的殺傷活性曲線圖
[0045] 圖11表示為Di-CART細胞治療乳腺癌鼠模型的腫瘤大小變化曲線
【具體實施方式】
[0046] 本發明發現乳腺癌組織、乳腺癌細胞和乳腺癌干細胞均特異表達的兩個腫瘤抗原 ⑶47和TAZ。同時我們通過構建的⑶47和TAZ過表達慢病毒載體，包裝成病毒后轉染乳腺癌 細胞，發現其具有更強的增殖和轉移能力，并表現出腫瘤干細胞表型，和體內成瘤實驗具有 腫瘤干細胞特征。將該兩個特異結合CD47以及TAZ的雙特異嵌合抗原受體基因重組到病毒 載體上并轉染人T淋巴細胞，高表達該雙特異性嵌合抗原受體基因，可特異結合表達CD47以 及TAZ的乳腺癌細胞和乳腺癌干細胞，激活第一信號和共刺激信號而體內體外試驗中引發 抗腫瘤細胞毒性活性。
[0047] 通過采集乳腺癌患者腫瘤組織(通過倫理委員會備案和與患者簽署知情同意書）， 對CD47和TAZ基因和蛋白質在乳腺癌組織中進行檢測分析，焚光定量PCR檢測發現，與正常 乳腺組織相比，兩者在乳腺癌組織中表達分別為89.00和134.55倍;蛋白印跡分析檢測，兩 者在乳腺癌組織中表達分別為正常乳腺組織的23.49和35.67倍。
[0048] 本發明體外培養獲得的CD44+CD24-乳腺癌干細胞，熒光定量PCR檢測，CD47和TAZ 基因和蛋白質在乳腺癌干細胞中高表達，與乳腺癌細胞相比，兩者在乳腺癌組織中表達分 別為23.45和54.33倍;蛋白印跡分析檢測，兩者在乳腺癌干細胞中表達分別為乳腺癌細胞 的 11.56 和 25.61 倍。
[0049] 另外通過構建CD47和TAZ兩個慢病毒載體，分別包裝后轉染乳腺癌細胞，其高表達 CD47和TAZ基因與蛋白；體外細胞增殖培養分析，該兩種CD47和TAZ病毒轉染的乳腺癌細胞 在第7天增殖倍數分別為未轉染的乳腺癌細胞增殖的9.44和12.56倍;Transwell細胞迀移 實驗中，該兩種細胞發生了明顯的迀移，而未轉染的乳腺癌細胞迀移不明顯。
[0050] CD47和TAZ兩個慢病毒轉染的乳腺癌細胞通過流式細胞儀檢測，發現兩者表達 ⑶44+⑶24-表型明顯高于未轉染的乳腺癌細胞，即該兩種乳腺癌細胞的⑶44+⑶24-陽性率 分別為67.56 %和78.90 %，而未轉染的乳腺癌細胞僅為1.45 %。裸鼠體內成瘤實驗中，僅 100個CD47和TAZ病毒轉染的乳腺癌細胞接種時，在第7天就形成腫瘤，而未轉染的乳腺癌細 胞接種1〇 6數量級時方形成腫瘤，表明高表達了CD47和TAZ的乳腺癌細胞具有腫瘤干細胞的 表型和特性。
[0051] 對本發明涉及的一種靶向乳腺癌干細胞的嵌合抗原受體基因修飾的T淋巴細胞的 制備方法進行具體說明。
[0052]本發明涉及一種靶向乳腺癌干細胞的嵌合抗原受體基因修飾的T淋巴細胞的制備 方法，其特征在于，構建成含特異結合CD47以及TAZ的雙特異嵌合抗原受體基因重組到病毒 載體上并轉染人T淋巴細胞，高表達該雙特異性嵌合抗原受體基因，可特異結合表達CD47以 及TAZ的乳腺癌細胞和乳腺癌干細胞，激活第一信號和共刺激信號而體內體外試驗中引發 抗腫瘤細胞毒性活性。
[0053]本發明所述的含特異結合CD47的特異嵌合抗原受體基因，包括特異結合CD47的單 鏈抗體并串聯了兩個共刺激分子胞內域(CD28和CD137)和CD3G胞內信號區的基因片段，可 激活第一信號和共刺激信號，即激活機體免疫應答而引發抗腫瘤細胞毒性活性和腫瘤凋亡 作用。
[0054] 本發明所述的TAZ的特異嵌合抗原受體基因，包括TAZ的單鏈抗體并鏈接了抑制 IL-6基因轉錄表達的TET2基因片段，抑制T淋巴細胞分泌IL-6而防止了治療中"免疫因子風 暴"的產生。
[0055] 同時所述雙特異性嵌合抗原受體基因之間鏈接了弗林蛋白酶切割位點，其在細胞 內蛋白翻譯后可產生兩個獨立發揮功能的嵌合抗原受體。
[0056] 本發明所述將人IFNy-信號肽-scFv(CD47)-CD8a鉸鏈區-CD28-CD137-CD3G胞內 區，以及scFv(TAZ)-IgD鉸鏈區-TET2通過Furin切割位點和連接序列(Linker)連接在一起， 形成重組基因序列，基因序列通過化學合成獲得，形成完整的雙特異性嵌合抗原受體基因 的cDNA，BPDi-CAR。
[0057] 將兩個特異性嵌合抗原受體基因，即人IFNy-信號肽-ScFv(CD47)-CD8a鉸鏈區-CD28-CD137-CD3G胞內區，以及scFv(TAZ)-IgD鉸鏈區-TET2通過Furin切割位點和連接序列 連接在一起，形成重組基因序列，序列通過化學合成獲得，形成完整的雙特異性嵌合抗原受 體基因的cDNA，即Di-CAR;
[0058] 將Di-CAR的目的DNA片段和pUC229載體Hind III/BamHI雙酶切后，在T4DNA連接酶 作用下，將兩者于4°C、12小時連接反應制備克隆連接液，轉化大腸桿菌感受態細胞DH5a后 進行陽性克隆PCR鑒定和測序鑒定;PCR產物凝膠電泳檢測和測序鑒定符合Di-CAR大小和序 列后，將測序正確的菌液轉接于l〇ml含相應抗生素的LB液體培養基中，37°C培養過夜，用北 京天根生物無內毒素質粒小提中量試劑盒進行質粒抽提，抽提合格的重組質粒放置_80°C 超低溫冰箱中長期保存；
[0059] 將Di-CAR的目的DNA片段和pFLAG-CMV-2載體Hind III/BamH I雙酶切后，在T4DNA 連接酶作用下，將兩者于37°C、12小時連接反應制備克隆連接液，轉化大腸桿菌感受態細胞 DH5a后進行陽性克隆PCR鑒定和測序鑒定；
[0060] 取細胞狀態良好，處于對數生長期的293FT細胞，細胞計數后，按照每個10cm的培 養皿6X 106個細胞數接種于培養皿中，37°C，5%C02的培養箱中培養過夜;第二天轉染前移 去培養液，換5ml Opti-MEM培養液；取9yg包裝混合液和3yg慢病毒表達質粒加入1.5ml Opti-MEM中，輕輕混勻，取36μ1 lipofectamine2000加入 1.5ml Opti-MEM中，輕輕混勻，室 溫放置5min;混合質粒溶液和1 ipofectamine 2000稀釋液，置室溫20min;混合液緩慢滴加 至293FT細胞的培養液中，混勻，于37°C、5 %C02細胞培養箱中培養;培養6h后棄去含有轉染 混和物的培養基，加入l〇ml的roS液清洗一次，輕柔晃動培養皿以洗滌殘余的轉染混和物后 倒棄；緩慢加入含10 %血清的細胞培養基20ml，于37 °C、含5 %⑶2培養箱內繼續培養48-72h；
[00611 根據細胞狀態，收集轉染后48h的293FT細胞上清液;于4°C，4000g離心10min，除去 細胞碎片；以0.45μπι濾器過濾上清液于40ml超速離心管中；分別配平樣品，將帶有病毒上清 液的超速離心管逐一放入至Beckman超速離心機內，設置離心參數為25000rpm，離心時間為 2h，離心溫度控制在4°C;離心結束后，棄去上清，盡量去除殘留在管壁上的液體，加入病毒 保存液，輕輕反復吹打重懸;經充分溶解后，高速離心lOOOOrpm，離心5min后，取上清熒光法 測定滴度，病毒按照50μ1 2E+8TU/ml分裝，保存于-80°C超低溫冰箱。
[0062]本發明所述方法中T淋巴細胞來源于自體靜脈血、自體骨髓、臍帶血和胎盤血等的 單個核細胞。優選地，來源于癌癥患者手術一個月后、放化療一個月后采集的新鮮外周血或 骨髓。
[0063]采集來源于乳腺癌患者自體外周血50-100ml，經淋巴細胞分離液分離純化得到單 個核細胞后，用無血清培養基重懸并稀釋到2-5 X 106細胞/ml，并補充l-500ng/ml IL-la、 10-2000IU/ml IL-2和5%自體血清，取10ml加入到鼠抗人CD3(0KT3)包被的75cm2培養瓶 中，于37°C、含5%C0 2培養箱培養到第3天;第3天離心收獲T淋巴細胞，并通過苔盼蘭計數。 [0064]第3天收獲的T淋巴細胞用無血清培養基重懸為5-10 X106細胞/ml，取6ml加入到 0KT3包被的75cm2培養瓶中，并加入100μ1 lE+7TU/ml重組Di-CAR慢病毒，體系為6ml，混勻， 37 °C、5 %⑶:^的培養箱中孵育8-12個小時后，更換無血清培養基10ml，所述完全培養液優選 含l-500ng/ml IL-la、10-2000IU/ml IL-2和5 %自體血清；當T淋巴細胞生長密度達到10 X 1〇6細胞/ml時，轉入新的75cm2培養瓶中生長，并補充完全無血清培養液到50ml培養體系；于 37°C、含5 %C02培養箱內培養到第14天，期間根據T淋巴細胞密度和培養基顏色變化補充含 10-2000IU/ml IL-2和5%自體血清新鮮完全無血清培養液，或擴瓶到175cm2培養瓶中或轉 移到1-3L培養袋中生長；
[0065]培養到第14天的T淋巴細胞通過熒光定量PCR技術檢測，轉染了Di-CAR病毒載體的 T淋巴細胞其表達Di-CAR基因高于未轉染的T淋巴細胞為50倍以上；蛋白印跡技術檢測其 Di-CAR融合蛋白表達水平，可表達scFv (CD47) -CAR 53kDa和scFv (TAZ) -CAR 42kDa的融合 蛋白。
[0066]本發明所述方法中來源50ml外周血單個核細胞誘導培養獲得T淋巴細胞，增殖倍 數達1000倍以上，培養到14天Τ淋巴細胞數達3 Χ109以上。
[0067]本發明所述方法中培養獲得的Τ淋巴細胞，高表達其特異標志物⑶3+/CD8+，陽性 率高于90%以上，而調節性Τ淋巴細胞CD4+/⑶25+/Foxp3+陽性率低于5%以下，所述的Τ淋 巴細胞體內體外試驗具有很強抗腫瘤殺傷毒性。
[0068]本發明使用的T淋巴細胞激活培養器為使用小鼠抗人⑶3單克隆抗體(0KT3)包被 的培養器，包括細胞培養板、培養皿和培養瓶等，優選地為細胞培養皿。
[0069]本發明使用的細胞培養基為淋巴細胞無血清培養基加入含l-500ng/mll-500ng/ ml IL-la、10-2000活性單位(IU)/ml IL-2和5% (體積比）自體血清或胎牛血清，如CellGro SCGM、A頂-V、X-VIV0和GT-T551等商品化產品。
[0070]本發明還提供了一種制備靶向乳腺癌干細胞的嵌合抗原受體基因修飾的T淋巴細 胞的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括：
[0071 ] (1)獲得如上所述的穩定表達Di-CAR的病毒載體；
[0072] (2)T淋巴細胞因子，包括IL-la和IL-2;
[0073] (3)0KT3 包被 75cm2 培養瓶；
[0074] (4)淋巴細胞培養基，包括無血清培養基；
[0075] (5)淋巴細胞分離液；
[0076] (6)生理鹽水；
[0077] (7)使用說明書；
[0078] 其中，所述使用說明書包括如上所述的方法。
[0079 ]作為本發明T淋巴細胞增殖培養中使用的細胞培養板、細胞培養皿、培養瓶、細胞 培養袋，可例舉為75cm2細胞培養瓶、175cm2細胞培養瓶、225cm2細胞培養瓶、1L或2L細胞培 養袋等細胞培養用器材(容器），均可用于本發明，優選細胞培養袋。
[0080]本發明的制造方法中對T淋巴細胞進行凍存，對凍存液無特殊限制，但優選例如為 50 %小牛血清、40 %細胞培養液和10 %二甲基亞砜，其中細胞培養液更優選為T淋巴細胞培 養液。
[0081 ]在培養基中可以添加血清或血漿進行培養。它們在培養基中的添加量不受特殊限 制，如大于〇容量％至20容量％，且可以根據不同的培養階段而改變血清或血漿的用量，優 選為5% (體積比）。例如，可以階段性減少血清或血漿濃度來使用。另外，作為血清或血漿的 來源，可以是自己（意味著與所培養的細胞來源相同）或非自己（意味著與所培養的細胞的 來源不同）中的任一種，從安全性的觀點出發，優選自己來源的血清或血漿。另外，也可以添 加如人血清白蛋白之類經分離純化的血清成分。
[0082]本發明的自體T淋巴細胞增殖的制備使用上述各種成分及培養基來實施。本發明 中使用的培養培養條件也沒有特殊限制，可以使用通常的細胞培養中使用的條件。例如，可 在37°C、5%C02等條件下培養。還可以實施如下等操作：間隔適當的時間添加新鮮培養基來 稀釋細胞培養液，或更換培養基，或更換細胞培養用器材等。
[0083] 本發明還提供T淋巴細胞在臨床應用中多次的抗乳腺癌治療，更好地在生物體內 發揮抗腫瘤免疫應答，達到很好的治療效果。此外，上述T淋巴細胞還具有如下優點，多次T 淋巴細胞治療將更好地引發T淋巴細胞殺瘤活性，激活機體自身免疫應答，產生高效、長效 地抗腫瘤免疫效應，因此非常利于乳腺癌患者療效的提高和生存期的延長。
[0084] 以下，結合實施例對本發明做更具體的描述，但本發明不限于此。
[0085]效果例一整合素相關蛋白（⑶47)和轉錄共激活因子(TAZ)在乳腺癌組織中高表達 [0086] 采集100例乳腺癌患者腫瘤組織和50例志愿者正常乳腺組織(通過倫理委員會備 案和與患者簽署知情同意書），取lg組織在液氮中研磨，后用Trizol-步法提取總RNA，取2μ g逆轉錄合成模板cDNA。取2μ1逆轉錄產物進行PCR反應以檢測靶基因的mRNA表達水平。按美 國Invitrogen公司熒光定量PCR試劑盒說明書，建立終體積為20μ1的PCR反應體系，2μ1逆轉 錄產物、10μ1 SYBR Green Mix、上下游引物（ΙΟμ mol/L)各O.SyhPCR熱循環參數為：95°C 5min，然后94°C變性30s、60°C退火30s，進行45個循環。引物序列如下：
[0087] TAZ正義鏈：5，-GTGTCCAATCACCAGTCCTG-3，，
[0088] 反義鏈：5 ' -GCTGAAGAAGTGGGAGTGTAGC-3 ' ；
[0089] CD47正義鏈：5，-GTGGTTGTTGGAGCCATCCT-3，，
[0090] 反義鏈：5 ' -TGCCATGATGCAGAGACACA-3 ' ；
[0091] 看家基因 NADPH正義鏈:5' -GACCCCTTCATTGACCTCAAC-3'，
[0092] 反義鏈：5' -CGCTCCTGGGAAGATGGTGAT-3'。
[0093]經美國ABI 7500熒光定量PCR儀上機檢測，結果采用法進行計算。圖1中為 ⑶47和TAZ基因在乳腺癌組織和正常乳腺組織中表達水平，結果顯示兩者在乳腺癌組織中 表達均值分別為正常乳腺組織的75.1和92.34倍;表明⑶47和TAZ基因在乳腺癌組織中高表 達。
[0094]乳腺癌患者和正常健康人lg組織經勻漿裂解后進行蛋白凝膠電泳。根據目的蛋白 的分子量，配制10%分離膠，濃縮膠濃度為5%。待檢測蛋白樣品上樣量:20yg/孔。電泳條 件:濃縮膠恒壓90V，約20分鐘;分離膠恒壓120V，通過標準分子量預染蛋白來確定電泳停止 時間。濕轉法，轉膜條件:300mA恒流;0.45μηι孔徑PVDF膜，轉膜時間80分鐘。轉膜完成后麗春 紅染色試劑對膜進行染色，觀察轉膜效果。封閉:將膜完全浸沒于5 % (mg/mL)牛血清白蛋白 (BSA)的轉膜緩沖液(含體積比3 %吐溫-20，TBST)中，室溫下水平搖床孵育1小時。一抗孵 育：5 % (mg/mL)BSA-TBST稀釋小鼠抗人CD47和TAZ單抗1:2000，購自美國Santa公司；4°C水 平搖床孵育過夜。次日，洗膜:TBST洗3次，每次10分鐘。滴加辣根過氧化酶標記的二抗到膜 孵育lh，化學發光顯色。
[0095]膠片用掃描儀掃描為大于300DPI的TIF格式圖片，使用Quantity One分析軟件 (Bio-Rad公司）進行灰度分析，圖2為蛋白印跡技術檢測CD47和TAZ蛋白在乳腺癌患者和正 常乳腺組織中表達水平，即western blotting灰度結果圖，兩者在乳腺癌組織中表達灰度 均值分別為1.96和2.88，而正常乳腺組織分別為0.11和0.10; CD47和TAZ蛋白在乳腺癌組織 中表達為正常乳腺組織的17.36和29.65倍，表明⑶47和TAZ蛋白兩者均在乳腺癌組織中高 表達。
[0096] 效果例二⑶47和TAZ乳腺癌干細胞中特異高表達。
[0097] 同樣來自上述100例乳腺癌患者新鮮腫瘤組織，經消化獲得的腫瘤單細胞懸液使 用含20ng/ml重組人表皮生長因子、20ng/ml重組人成纖維生長因子、10ng/ml人胰島素和1 X無血清培養添加物B27的DMEM/F12( 1:1)培養基進行培養，具體方法詳見Piscitelli E等 2015年在《分子生物學方法》雜志中發表的《成乳腺球的乳腺癌干細胞的培養與特征》，即 Piscitelli E et al.Culture and characterization of mammary cancer stem cells in mammospheres .Methods Mol Biol .2015; 1235:243-62.獲得的乳腺癌干細胞經流式細 胞儀檢測⑶44+⑶24-率為69.45 %，通過流式細胞儀分選獲得⑶44+⑶24-的乳腺癌干細胞。 乳腺癌細胞和正常乳腺細胞分別來源新鮮腫瘤組織和正常乳腺組織，通過含10%胎牛血清 的DMEM(高糖)培養基培養獲得。
[0098] 采用熒光定量PCR檢測⑶47和TAZ基因在乳腺癌干細胞和乳腺癌細胞中表達水平 (具體方法見效果例一），圖3中結果顯示兩者在乳腺癌干細胞和乳腺癌細胞中表達均值分 別為正常乳腺細胞的112.09與159.76，23.89與45.66倍;表明CD47和TAZ基因在乳腺癌干細 胞中表達比乳腺癌細胞更高。
[0099]通過蛋白印跡技術檢測CD47和TAZ蛋白在乳腺癌干細胞和乳腺癌細胞中表達水平 并測定灰度(具體方法見效果例一），圖4中結果顯示兩者在乳腺癌干細胞和乳腺癌細胞中 表達灰度均值分別為2.44與3.3，1.56與1.88，而正常乳腺細胞分別為0.09和0.08; CD47和 TAZ蛋白在乳腺癌干細胞和乳腺癌細胞中表達為正常乳腺細胞的26.32與42.74倍，16.79和 24.38倍，表明CD47和TAZ蛋白兩者均在乳腺癌干細胞和乳腺癌細胞中高表達，而在乳腺癌 干細胞中表達高于乳腺癌細胞。
[0100]效果例三⑶47和TAZ過表達乳腺癌細胞更強的增殖和轉移能力 [0101] 將人CD47和TAZ基因片段設計含EcoR I/Hind III引物，通過PCR分別從人外周血 中擴增獲得，pET-llc載體EcoR I/Hind III雙酶切后，在T4DNA連接酶作用下，將CD47和TAZ PCR產物分別與酶切后的pET-llc于4°C、12小時連接反應制備克隆連接液，轉化大腸桿菌感 受態細胞DH5a后進行陽性克隆PCR鑒定和測序鑒定;PCR產物凝膠電泳檢測和測序鑒定符合 CD47和TAZ大小和序列后，將測序正確的菌液轉接于10ml含相應抗生素的LB液體培養基中， 37°C培養過夜，用北京天根生物無內毒素質粒小提中量試劑盒進行質粒抽提，抽提合格的 重組質粒放置-80°C超低溫冰箱中長期保存;所述⑶47和TAZ大小分別為887bp和1208bp;
[0102] 將CD47和TAZ的目的DNA片段和GV358載體Pst I/Pst I雙酶切后，在T4DNA連接酶 作用下，將兩者于37°C、12小時連接反應制備克隆連接液，轉化大腸桿菌感受態細胞DH5a后 進行陽性克隆PCR鑒定和測序鑒定；
[0103] 取細胞狀態良好，處于對數生長期的293T細胞，細胞計數后，按照每個10cm的培養 皿6X 106個細胞數接種于培養皿中，37°C，5%C02的培養箱中培養過夜;第二天轉染前移去 培養液，換5ml Opti-MEM培養液;取9yg包裝混合液和3yg慢病毒表達質粒加入1.5ml Opti-MEM中，輕輕混勻，取36μ1 lipofectamine2000加入1.5ml Opti-MEM中，輕輕混勻，室溫放置 5min;混合質粒溶液和1 ipofectamine 2000稀釋液，置室溫20min;混合液緩慢滴加至293T 細胞的培養液中，混勻，于37 °C、5 % C02細胞培養箱中培養;培養6h后棄去含有轉染混和物 的培養基，加入1 〇ml的PBS液清洗一次，輕柔晃動培養皿以洗滌殘余的轉染混和物后倒棄； 緩慢加入含10 %血清的細胞培養基20ml，于37°C、含5 % C02培養箱內繼續培養72h。
[0104] 根據細胞狀態，收集轉染后48h的293T細胞上清液;于4°C，4000g離心10min，除去 細胞碎片；以〇.45μπι濾器過濾上清液于40ml超速離心管中；分別配平樣品，將帶有病毒上清 液的超速離心管逐一放入至Beckman超速離心機內，設置離心參數為25000rpm，離心時間為 2h，離心溫度控制在4°C;離心結束后，棄去上清，盡量去除殘留在管壁上的液體，加入病毒 保存液，輕輕反復吹打重懸;經充分溶解后，高速離心lOOOOrpm，離心5min后，取上清熒光法 測定滴度，病毒按照50μ1 2E+8TU/ml分裝，保存于-80 °C超低溫冰箱，即制備成了 CD47和TAZ 兩種慢病毒。
[0105] 以3X106細胞/ml乳腺癌細胞MCF-7加入到六孔培養板，每孔為2ml RPMI 1640培 養基(含10%胎牛血清），于37°C、含5%⑶2培養箱內培養過夜。第6天將20μ1 lE+7TU/ml重 組⑶47和TAZ慢病毒分別加入到的六孔培養板中，體系為lml，混勻，37°C、5%⑶2的培養箱 中孵育8-12個小時后，更換完全培養液RPMI 1640 2ml;當MCF-7生長融合達到90%時，將 MCF-7細胞轉移到75cm2培養瓶，補充完全培養液RPMI 1640到10ml培養體系進行擴增培養。 在通過熒光定量PCR試劑盒按照使用說明書（美國Invitrogen公司）檢測，培養到第10代的 MCF-7細胞通過熒光定量PCR技術檢測，轉染了⑶47和TAZ病毒轉染MCF-7細胞其表達目的基 因分別高于未轉染的MCF-7為289.9和320.87倍。⑶47-MCF7淋巴為⑶47慢病毒轉染的MCF-7 細胞，TAZ-MCF7為TAZ慢病毒轉染的MCF-7細胞。
[0106] CD47-MCF7、TAZ-MCF7和MCF-7細胞以5X107/L密度接種于96孔板，每組設6個復 孔。各組于實驗結束前4h加入5g/L的ΜΤΤ 20μ1，培養4h棄去培養液，各孔加入150μ1二甲基 亞砜(DMS0)，室溫振蕩15min，酶標儀于波長490nm處測吸光度(Α)值表示細胞活性。以上實 驗重復3次。圖5中MTT法檢測乳腺癌細胞增殖活性曲線，CD47-MCF7和TAZ-MCF7兩者增殖速 率明顯高于MCF-7，并具有統計學意義(P<0.01)，表明高表達⑶47和TAZ促進了乳腺癌細胞 增殖生長。
[0107] 采用24孔板Transwell小室進行。小室孔徑8μηι，上室用100μ1 Matrigel膠包被后 紫外線照射211。0)47-10^7、了42-10^7和10^-7細胞以1\106/1111的密度接種于6孔板，2411后， 各組分別吸取2001細胞接種于上層小室并置于24孔板中，下室加含10%胎牛血清的 RMPI1640培養液培養24h。棉簽擦掉上室面的Matrigel膠和細胞，甲醇固定10min，結晶紫染 色后高倍鏡下隨機計數5個視野中的細胞數，實驗重復3次。侵襲抑制率（％ ) = ( 1-實驗組侵 襲細胞的數量/對照組侵襲細胞的數量）X 100%。
[0108] 表1高表達⑶47和TAZ對乳腺癌細胞MCF-7侵襲迀移能力的作用
[0110] 從表1中可以看到高表達⑶47和TAZ的乳腺癌細胞MCF-7具有很強侵襲迀移能力， 顯著高于MCF-7細胞。
[0111] 效果例四⑶47和TAZ過表達乳腺癌細胞具有腫瘤干細胞特性
[0112] 效果例三中制備的1 X 106CD47-MCF7、TAZ-MCF7和MCF-7細胞，進行流式抗體染色 檢測分析，實驗組分別為20yL鼠抗人CD24-FITC和20yL鼠抗人CD44-PE;同型對照組為20yL mlgGl-FITC和20yL mlgGl-PE;放置4°C冰箱染色30分鐘后用PBS洗滌3次，然后在FACS Calibur儀器(美國BD公司）上機檢測和分析。
[0113] 圖6為效果例三中制備的CD47-MCF7、TAZ-MCF7和MCF-7細胞流式細胞檢測，三者細 胞的CD44+CD24-百分比分別為42 · 00 %、70 · 54% 和 13 · 62% ; CD47-MCF7和TAZ-MCF7乳腺癌 干細胞表型CD44+CD24-百分比明顯高于MCF-7細胞，表明高表達CD47和TAZ的MCF-7具有乳 腺癌干細胞表型。
[0114] 45 只 8周 SCID 裸鼠腹部側翼皮下注射 lO^lO^lO'H^PHy^OMT-MCFTJAZ-MCF? 和MCF-7細胞，體積為100μΙ，每個注射劑量3只裸鼠，連續飼養30天并觀察成瘤情況，具體見 表2。
[0115]表2接種乳腺癌細胞裸鼠體內成瘤情況
[0117] 注為未成瘤，+、++和+++不同的成瘤程度，腫瘤大小越大。
[0118] 從表2中可以看到CD47-MCF7和TAZ-MCF7接種了 100個在第7天既成瘤了，而MCF-7 在106數量級才成瘤和104數量級在第14天成瘤;表明極少數CD47-MCF7和TAZ-MCF7在體內可 成瘤，具有腫瘤干細胞特性。
[0119] 實施例一雙特異性嵌合抗原受體基因修飾的Τ淋巴細胞的制備
[0120] 將人IFNy-信號肽-scFv(CD47)-CD8a鉸鏈區-CD28-CD137-CD3G胞內區，以及scFv (TAZ)-IgD鉸鏈區-TET2通過Furin切割位點和連接序列的基因片段構成。
[0121] 將人IFNy-信號肽-scFv(CD47)-CD8a鉸鏈區-CD28-CD137-CD3G胞內區，以及scFv (TAZ)-IgD鉸鏈區-TET2通過Furin切割位點和連接序列（Linker)連接在一起，形成重組基 因序列，基因序列通過化學合成獲得，形成完整的雙特異性嵌合抗原受體基因的cDNA，即 Di-CAR;Di-CAR慢病毒載體構建和包裝方法與效果例三所述的方法一樣，獲得Di-CAR慢病 毒取上清熒光法測定滴度，病毒按照50μ1 2E+8TU/ml分裝，保存于-80°C超低溫冰箱，即制 備成Di-CAR慢病毒。
[0122] 采集乳腺癌患者患者50ml(與其簽署知情同意書），加入等量lXroS稀釋，沿離心 管管壁輕輕疊加于淋巴細胞分離液上，形成明顯界面，室溫下2000rpm離心20min，吸取界面 層的PBMC，用1 xroS(pH值為7.4)洗滌兩次。苔盤蘭計數后，用VIV0-15無血清培養基重懸并 稀釋到3 X 106細胞/ml，并補充50ng/ml IL-Ια、500IU/ml IL-2和5 %自體血清，取10ml加入 到鼠抗人⑶3 (0KT3)包被的75cm2培養瓶中，于37 °C、含5 % C02培養箱培養到第3天;第3天離 心收獲T淋巴細胞，并通過苔盼蘭計數。
[0123] 第3天收獲的T淋巴細胞用無血清培養基重懸為5-10 X106細胞/ml，取6ml加入到 0KT3包被的75cm2培養瓶中，并加入100μΙ lE+7TU/ml重組Di-CAR慢病毒，體系為6ml，混勻， 37 °C、5 %⑶:^的培養箱中孵育8-12個小時后，更換無血清培養基10ml，所述完全培養液優選 含50ng/ml IL-la、500IU/ml IL-2和5%自體血清；當T淋巴細胞生長密度達到10X106細 胞/ml時，轉入新的75cm2培養瓶中生長，并補充完全無血清培養液到50ml培養體系；于37 °C、含5%C0 2培養箱內培養到第14天，期間根據T淋巴細胞密度和培養基顏色變化補充含 50011]/111111^-2和5%自體血清新鮮完全無血清培養液，轉移到21^培養袋中生長；
[0124] 圖7為Di-CAR慢病毒轉染T淋巴細胞后經培養后的表達水平。通過熒光定量PCR技 術檢測培養到第14天的T淋巴細胞，轉染了Di-CAR病毒載體的T淋巴細胞其表達Di-CAR基因 高于未轉染的T淋巴細胞為125.6倍。
[0125] 實施例二雙特異性嵌合抗原受體基因修飾的T淋巴細胞蛋白印跡和流式細胞檢 測
[0126] 取實施例一制備的晚期乳腺癌患者和正常健康人來源第14天培養獲得的T淋巴細 胞各1 X 106,通過超聲破碎后進行western blotting蛋白印跡分析，所述方法見效果例一。
[0127] 圖8為蛋白印跡技術檢測Di-CAR融合蛋白在Di-CAR慢病毒轉染乳腺癌患者來源的 T淋巴細胞，以及Di-CAR融合蛋白大腸桿菌中表達水平（陽性對照），即western blotting結 果圖，在兩例患者中均出現兩條帶，其中一條為CD47-CAR，約為479氨基酸殘基，分子量約 53kD;另一條為TAZ-CAR，約417氨基酸殘基，分子量約為46kD。第1條帶為Di-CAR慢病毒轉染 乳腺癌T淋巴細胞，第2條帶為Di-CAR融合蛋白大腸桿菌中表達，條帶分子量約為99kD，即 CD47-CAR和TAZ-CAR分子量之和。
[0128] 取實施例一制備的乳腺癌患者來源第14天培養獲得的IX 106T淋巴細胞，進行流 式抗體染色檢測分析。Τ淋巴細胞第一組分別為20yL鼠抗人CD3-FITC、20yL鼠抗人CD4-PE和 20yL鼠抗人CD8-PerCP;第二組分別為20yL鼠抗人FoxP3-FITC、20yL鼠抗人CD4-PE和20yL鼠 抗人CD25-PerCP;同型對照組為20yL mIgGl-FITC、20yL mlgGl-PE和20yL mlgGl-PerCP;放 置4°C冰箱染色30分鐘后用roS洗滌3次，然后在FACS Calibur儀器(美國BD公司）上機檢測 和分析。
[0129]圖9為實施例一制備的乳腺癌患者Di-CAR慢病毒轉染T淋巴細胞流式細胞檢測，該 Τ淋巴細胞CD3和CD8陽性率為91.09 %，CD4+CD25+FoxP3+陽性率為2.71 %。
[0130] 實施例三
[0131 ]雙特異性嵌合抗原受體基因修飾的Τ淋巴細胞體外殺瘤試驗
[0132] 分別以乳腺癌細胞系MCF-7和效果例二中制備的CD44+CD24-的乳腺癌干細胞 (Breast stem cells，BSC)為靶細胞，以實施例二中制備的Di-CAR慢病毒轉染Τ淋巴細胞作 為效應細胞，按效靶比40:1、20:1、10:1、5:1和2.5:1分別加入96孔培養板中，然后置于37 °C、5 % C02條件下培養4h，均設3個復孔。采用LDH細胞毒實驗法測定T淋巴活性:吸取上清液 50yL，置于96孔板中，加入LDH基液50yL，室溫避光30min，加入50yL終止液終止反應，490nm 波長處測吸光度(0D)值。按下列公式分別計算PC-3和MCF-7細胞的殺傷率:殺傷率=(實驗 組0D值-效應細胞自然釋放組0D值-靶細胞自然釋放組0D值)/(靶細胞最大釋放組0D值-靶 細胞自然釋放組0D值）X 100 %。
[0133] 圖10為乳腺癌患者來源Di-CAR慢病毒轉染T淋巴細胞(Di-CAR-T)對MCF-7和BSC的 殺傷活性，隨著效靶比提高，細胞毒性活性也不斷提高，Di-CAR慢病毒轉染乳腺癌患者T淋 巴細胞殺傷MCF-7和BSC殺傷毒性顯著高于未轉染的T淋巴細胞，p值為0.016，而且Di-CAR-T 殺傷MCF-7和BSC相比較無差異。
[0134] 實施例五
[0135] 雙特異性嵌合抗原受體基因修飾的T淋巴細胞體內殺瘤實驗中的作用
[0136] 取效果例四中使用⑶47-MCF7、TAZ-MCF7和MCF7建立的裸鼠模型，上述三種細胞接 種建立的乳腺癌裸鼠模型進行分組，A組為實施例一制備的Di-CAR慢病毒轉染乳腺癌患者T 淋巴細胞治療組;B組為實施例一制備的未轉染的乳腺癌患者T淋巴細胞治療組;C組為生理 鹽水安慰劑組。A組在Di-CAR慢病毒轉染乳腺癌患者T淋巴細胞培養到第14天和第16天尾靜 脈注射2 X104細胞/克，B組C組在未轉染乳腺癌患者T淋巴細胞培養到第14天和第16天尾靜 脈注射2X10 4細胞/克，C組與A和B治療組同時間，尾靜脈注射同體積的生理鹽水，各lmL。治 療后分別于7d、14d、21d和28d拉頸處死，取乳腺癌SCID鼠模型腫瘤組織，計算鼠模型腫瘤大 小。
[0137] 圖11 CD47-MCF7、TAZ-MCF7和MCF7的SCID鼠模型T淋巴細胞治療完之后腫瘤大小 變化曲線，生理鹽水組C和Di-CART細胞治療組A、T淋巴細胞治療組B相比，治療組A和B中乳 腺癌腫瘤大小縮少，但治療組A與治療組B相比乳腺癌腫瘤大小縮少明顯，p值分別為0.004， 其中抗⑶47-MCF7和TAZ-MCF7建立的鼠模型更為明顯，而治療組B殺傷該兩種鼠模型效果十 分不明顯，表明Di-CAR慢病毒轉染乳腺癌患者T淋巴細胞對乳腺癌細胞和乳腺癌干細胞均 可以引發了強大的殺瘤作用。
【主權項】
1. 一種靶向乳腺癌干細胞的雙特異性嵌合抗原受體基因修飾的T淋巴細胞的制備方 法，其特征在于，靶向乳腺癌干細胞抗原CD47和TAZ胞外域，免疫產生特異性結合的單克隆 株，通過基因重組獲得與兩者特異結合的單鏈抗體，構建成含抗人CD47和TAZ的雙特異嵌合 抗原受體基因 （double chimeric antigen receptor，Di_CAR)，重組到病毒載體上并轉染 人T淋巴細胞，可特異結合表達人CD47和TAZ的乳腺癌干細胞； 所述雙特異性嵌合抗原受體(Di-CAR)基因的cDNA構建在病毒載體中，并轉染T淋巴細 胞，再將T淋巴細胞培養到第14天，獲得Di-CAR-T細胞;通過熒光定量PCR技術檢測，轉染了 Di-CAR病毒載體的T淋巴細胞其表達Di-CAR基因高于未轉染的T淋巴細胞為50倍以上； 所獲得的T淋巴細胞，高表達該雙特異性嵌合抗原受體基因，可特異結合表達CD47和 TAZ的乳腺癌干細胞，同時激活第一信號和共刺激信號而引發抗腫瘤細胞毒性活性，體內體 外試驗抗腫瘤具有很強殺傷毒性;其高表達其特異標志物CD3+/CD8+，陽性率高于90%以 上，而調節性T淋巴細胞⑶4+/⑶25+/Foxp3+陽性率低于5%以下。2. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，將人IFN γ -信號肽-scFv(⑶47)-⑶8a鉸鏈 區-CD28-CD 137-〇)3ζ胞內區，以及ScFv(TAZ)-IgD鉸鏈區-TET2通過Furin切割位點和連接 序列連接在一起，形成重組基因序列，基因序列通過化學合成獲得，形成完整的雙特異性嵌 合抗原受體基因的cDNA，即D i -CAR; 所述的CD47和TAZ基因和蛋白質在乳腺癌組織中高表達，通過熒光定量PCR檢測，與正 常乳腺組織相比，兩者在乳腺癌組織中表達分別為89.00和134.55倍;蛋白印跡分析檢測， 兩者在乳腺癌組織中表達分別為正常乳腺組織的23.49和35.67倍。3. 根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的CD47和TAZ基因和蛋白質在乳腺 癌干細胞中高表達，體外培養獲得的CD44+CD24-乳腺癌干細胞熒光定量PCR檢測，與乳腺癌 細胞相比，兩者在乳腺癌干細胞中表達分別為23.45和54.33倍;蛋白印跡分析檢測，兩者在 乳腺癌干細胞中表達分別為乳腺癌細胞的11.56和25.61倍。4. 根據權利要求1-3任一項所述的方法，其特征在于，通過構建CD47和TAZ兩個慢病毒 載體，分別包裝后轉染乳腺癌細胞，其高表達CD47和TAZ基因與蛋白；體外細胞增殖培養分 析，該兩種CD47和TAZ病毒轉染的乳腺癌細胞在第7天增殖倍數分別為未轉染的乳腺癌細胞 增殖的9.44和12.56倍;Transwell細胞迀移實驗中，該兩種細胞發生了明顯的迀移，而未轉 染的乳腺癌細胞迀移不明顯。5. 根據權利要求1-4任一項所述的方法，其特征在于，CD47和TAZ兩個慢病毒轉染的乳 腺癌細胞通過流式細胞儀檢測，發現兩者表達CD44+CD24-表型明顯高于未轉染的乳腺癌細 胞，即該兩種乳腺癌細胞的CD44+CD24-陽性率分別為67.56%和78.90%，而未轉染的乳腺 癌細胞僅為1.45 %; 裸鼠體內成瘤實驗中，僅100個CD47和TAZ病毒轉染的乳腺癌細胞接種時，在第7天就形 成腫瘤，而未轉染的乳腺癌細胞接種106數量級時方形成腫瘤，表明高表達了CD47和TAZ的 乳腺癌細胞具有腫瘤干細胞的表型和特性。6. 根據權利要求1-5任一項所述的方法，其特征在于，所述的雙特異性嵌合抗原受體含 有CD47和TAZ嵌合抗原受體基因，包括CD47的單鏈抗體并鏈接了特異結合IL-6基因轉錄抑 制劑DNA修飾酶的基因片段，可抑制IL-6基因的表達;特異結合TAZ的單鏈抗體并串聯了兩 個共刺激分子胞內域和CD3G胞內信號區的基因片段;所述兩個共刺激分子為CD28和CD137; 雙特異性嵌合抗原受體基因之間鏈接了弗林蛋白酶切割位點，其在細胞內蛋白翻譯后可產 生兩個獨立發揮功能的嵌合抗原受體。7. 根據權利要求1至6中任一項所述的方法，其特征在于， 采集來源于乳腺癌患者自體外周血50-100ml，經淋巴細胞分離液分離純化得到單個核 細胞后，用無血清培養基重懸并稀釋到2-5 X IO6細胞/ml，并補充l-500ng/ml IL-Ια、10-2000IU/ml IL-2和5%自體血清，取IOml加入到鼠抗人CD3(OKT3)包被的75cm2培養瓶中，于 37°C、含5 % CO2培養箱培養到第3天;第3天離心收獲T淋巴細胞，并通過苔盼蘭計數； 第3天收獲的T淋巴細胞用無血清培養基重懸為5-10 X IO6細胞/ml，取6ml加入到0KT3包 被的75cm2培養瓶中，并加入100μΙ 1E+7 TU/ml重組Di-CAR慢病毒，體系為6ml，混勻，37°C、 5%C02的培養箱中孵育8-12個小時后，更換無血清培養基10ml，所述完全培養液優選含1_ 500即/111111^-1€[、10-200011]/111111^-2和5%自體血清 ；當1'淋巴細胞生長密度達到10\106 細胞/ml時，轉入新的75cm2培養瓶中生長，并補充完全無血清培養液到50ml培養體系；于37 °C、含5%C0 2培養箱內培養到第14天，期間根據T淋巴細胞密度和培養基顏色變化補充含 10-2000IU/ml IL-2和5%自體血清新鮮完全無血清培養液，或擴瓶到175cm2培養瓶中或轉 移到1-3L培養袋中生長； 培養到第14天的T淋巴細胞通過熒光定量PCR技術檢測，轉染了Di-CAR病毒載體的T淋 巴細胞其表達Di-CAR基因高于未轉染的T淋巴細胞為50倍以上；蛋白印跡技術檢測其Di-CAR融合蛋白表達水平，可表達scFv(CD47)-CAR 53kDa和scFv(TAZ)-CAR 42kDa的融合蛋 白。8. -種靶向乳腺癌干細胞的雙特異性嵌合抗原受體基因修飾的T淋巴細胞的制備方 法，其特征在于， 將人IFN γ -信號肽-scFv(CD47)-CD8a鉸鏈區-CD28-CD137-CD3G胞內區，以及scFv (TAZ)-IgD鉸鏈區-TET2通過Furin切割位點和連接序列的基因片段構成。 將人IFN γ -信號肽-scFv(CD47)-CD8a鉸鏈區-CD28-CD137-CD3G胞內區，以及scFv (TAZ)-IgD鉸鏈區-TET2通過Furin切割位點和連接序列（Linker)連接在一起，形成重組基 因序列，基因序列通過化學合成獲得，形成完整的雙特異性嵌合抗原受體基因的cDNAJP Di-CAR 5Di-CAR慢病毒載體構建和包裝方法與效果例三所述的方法一樣，獲得Di-CAR慢病 毒取上清熒光法測定滴度，病毒按照50μ1 2E+8 TU/ml分裝，保存于-80°C超低溫冰箱，即制 備成Di-CAR慢病毒； 采集乳腺癌患者患者50ml，加入等量IXPBS稀釋，沿離心管管壁輕輕疊加于淋巴細胞 分離液上，形成明顯界面，室溫下2000rpm離心20min，吸取界面層的PBMC，用I XI3BS洗滌兩 次；苔盤蘭計數后，用VIV0-15無血清培養基重懸并稀釋到3 X IO6細胞/ml，并補充50ng/ml IL-la、500IU/ml IL-2和5%自體血清，取IOml加入到鼠抗人CD3(0KT3)包被的75cm2培養瓶 中，于37°C、含5 % CO2培養箱培養到第3天;第3天離心收獲T淋巴細胞，并通過苔盼蘭計數； 第3天收獲的T淋巴細胞用無血清培養基重懸為5-10 X IO6細胞/ml，取6ml加入到0KT3包 被的75cm2培養瓶中，并加入100μΙ 1E+7 TU/ml重組Di-CAR慢病毒，體系為6ml，混勻，37°C、 5%C02的培養箱中孵育8-12個小時后，更換無血清培養基10ml，所述完全培養液優選含 50ng/ml IL-la、500IU/ml IL-2和5%自體血清；當T淋巴細胞生長密度達到10父106細胞/ ml時，轉入新的75cm2培養瓶中生長，并補充完全無血清培養液到50ml培養體系；于37°C、含 5. CO2培養箱內培養到第14天，期間根據T淋巴細胞密度和培養基顏色變化補充含500IU/ ml IL-2和5%自體血清新鮮完全無血清培養液，轉移到2L培養袋中生長； 通過熒光定量PCR技術檢測培養到第14天的T淋巴細胞，轉染了Di-CAR病毒載體的T淋 巴細胞其表達Di-CAR基因高于未轉染的T淋巴細胞為125.6倍； 其中，所述Di-CAR慢病毒載體構建和包裝方法如下， 將人⑶47和TAZ基因片段設計含EcoR I/Hind III引物，通過PCR分別從人外周血中擴 增獲得，ρΕΤ-llc載體EcoR I/Hind III雙酶切后，在T4DNA連接酶作用下，將CD47和TAZ PCR 產物分別與酶切后的ρΕΤ-llc于4 °C、12小時連接反應制備克隆連接液，轉化大腸桿菌感受 態細胞DH5a后進行陽性克隆PCR鑒定和測序鑒定;PCR產物凝膠電泳檢測和測序鑒定符合 CD47和TAZ大小和序列后，將測序正確的菌液轉接于IOml含相應抗生素的LB液體培養基中， 37°C培養過夜，用北京天根生物無內毒素質粒小提中量試劑盒進行質粒抽提，抽提合格的 重組質粒放置-80°C超低溫冰箱中長期保存;所述⑶47和TAZ大小分別為887bp和1208bp; 將CD47和TAZ的目的DNA片段和GV358載體Pst I/Pst I雙酶切后，在T4DNA連接酶作用 下，將兩者于37°C、12小時連接反應制備克隆連接液，轉化大腸桿菌感受態細胞DH5a后進行 陽性克隆PCR鑒定和測序鑒定； 取細胞狀態良好，處于對數生長期的293T細胞，細胞計數后，按照每個IOcm的培養皿6 X IO6個細胞數接種于培養皿中，37°C，5%C02的培養箱中培養過夜;第二天轉染前移去培養 液，換5ml Opti-MEM培養液;取9yg包裝混合液和3yg慢病毒表達質粒加入1.5ml Opti-MEM 中，輕輕混勻，取36μ1 lipofectamine2000加入1.5ml Opti-MEM中，輕輕混勻，室溫放置 5min;混合質粒溶液和I ipofectamine 2000稀釋液，置室溫20min;混合液緩慢滴加至293T 細胞的培養液中，混勻，于37 °C、5 % CO2細胞培養箱中培養;培養6h后棄去含有轉染混和物 的培養基，加入I Oml的PBS液清洗一次，輕柔晃動培養皿以洗滌殘余的轉染混和物后倒棄； 緩慢加入含10 %血清的細胞培養基20ml，于37°C、含5 % CO2培養箱內繼續培養72h; 根據細胞狀態，收集轉染后48h的293T細胞上清液;于4°C，4000g離心10min，除去細胞 碎片；以0.45μπι濾器過濾上清液于40ml超速離心管中；分別配平樣品，將帶有病毒上清液的 超速離心管逐一放入至Beckman超速離心機內，設置離心參數為25000rpm，離心時間為2h， 離心溫度控制在4°C;離心結束后，棄去上清，盡量去除殘留在管壁上的液體，加入病毒保存 液，輕輕反復吹打重懸;經充分溶解后，高速離心lOOOOrpm，離心5min后，取上清熒光法測定 滴度，病毒按照50μ1 2E+8 TU/ml分裝，保存于-80°C超低溫冰箱，即制備成了CD47和TAZ兩 種慢病毒； 所述Di-CAR慢病毒轉染T淋巴細胞流式細胞檢測，該T淋巴細胞CD3和CD8陽性率為 91 · 09 %，CD4+CD25+FoxP3+ 陽性率為2 · 71 %。9. 一種制備靶向乳腺癌干細胞的雙特異性嵌合抗原受體基因修飾的T淋巴細胞的試劑 盒，其特征在于，所述試劑盒包括： (1) 獲得權利要求1-8任一項所述的穩定表達Di-CAR的病毒載體； (2) T淋巴細胞因子，包括IL-Ia和IL-2; (3) 0ΚΤ3包被75cm2培養瓶； (4) 淋巴細胞培養基，包括無血清培養基； (5) 淋巴細胞分離液； (6) 生理鹽水； (7) 使用說明書； 其中，所述使用說明書包括權利要求1-8中任一項所述的方法。10.-種權利要求1-9中任一項所述靶向乳腺癌干細胞的雙特異性嵌合抗原受體基因 修飾的T淋巴細胞的用途。
【文檔編號】A61K35/17GK105950561SQ201610353118
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年5月26日
【發明人】王錦杰, 宋現讓
【申請人】江蘇杰晟生物科技有限公司