一種控制人神經細胞重編程的信號通路及其應用
【專利摘要】本發明公開了一種控制人神經細胞重編程的信號通路及其應用。所述nPTB?BRN2?miR?9信號通路為：nPTB的下調誘導BRN2活化；被激活的BRN2上調miR?9；miR?9下調nPTB。該應用為一種誘導神經細胞成熟的方法，包括如下步驟：激活未成熟的神經細胞中的nPTB?BRN2?miR?9信號通路。本發明的信號通路、以及激活信號通路的方法和物質在制備神經類疾病,特別是神經退行性疾病和腦腫瘤的藥物中具有重要應用價值。
【專利說明】
一種控制人神經細胞重編程的信號通路及其應用
技術領域
[0001] 本發明涉及一種控制人神經細胞重編程的信號通路及其應用。
【背景技術】
[0002] 神經系統從最初的形態發生到隨后發育形成不同的細胞亞型過程中，經歷了一系 列的細胞重編程事件[1， 2]。這些循序性事件可能被特異的形態發生信號誘導，并被細胞自主 基因表達程序誘導分步活化或抑制，這些事件發生過程中往往存在譜系特異的轉錄因子的 表達波 [3]和它們不同的功能[4]。在哺乳動物中，我們對于神經發生的大部分知識來自于遺 傳追蹤系統，尤其是小鼠，然而我們對于人類的神經發生過程了解較少，小鼠和人類在腦的 大小和神經發育所需的時間完全不同，因而有不同的調節機制參與神經發育 [5]，理解這些 關鍵的差異對于使用小鼠作為研究人神經發育和神經退行性疾病的模型十分重要[6, 7]。
[0003] 近年來，再生醫學通過使用患者來源的細胞研究具體的人類疾病取得了巨大的突 破，通過重編程[8#]，例如人成纖維細胞可轉化為誘導性多能干細胞 [11，12]，這些誘導性多 能干細胞能夠再分化為特定類型的細胞，如神經元。另外，異位表達神經元特異的轉錄因子 也能夠將成纖維細胞直接轉分化為神經元 [&17]。許多研究已證實這種轉分化的方法在小 鼠和人胚胎成纖維細胞中具有可行性，但是普遍的共識認為人體細胞更難以轉分化，尤其 是來自老年患者的細胞 [18]，這表明直接用病人來源的成纖維細胞研究疾病發生機制存在 顯著的障礙。
[0004] 大多數細胞分化和轉分化程序的建立在誘導多能干細胞定向分化的基礎上，多能 干細胞分化到定向的目的細胞能夠表達一系列特異的轉錄因子 [19]，然后利用這些特異的 轉錄因子或轉錄因子組合嘗試轉分化，雖然最近的一些研究通過推斷關鍵的發育調控基因 網絡尋找可行性的方法 [2()，21]，但是這些方法在很大程度上是嘗試-錯誤的反復過程。原則 上，任何細胞重新編程需要退出現有的穩態程序并隨之建立一個新的自我維持的程序，其 中可能涉及不同的反饋控制中的連續開關。值得注意的是，一些特異的小分子抑制劑能夠 替代轉錄因子誘導細胞重編程 [22,23]。然而，我們對大部分的多能性誘導或轉分化的機制知 之甚少。
[0005] 研究發現改變調節性RNA和RNA結合蛋白的表達通常伴隨著特異性轉錄因子表達 的轉換，提示調節性RNA和RNA結合蛋白在細胞重編程過程中具有重要的功能 [24'25]。事實 上，一些特定的microRNA，如miR-124已被證實能夠促進特定的轉錄因子介導的成纖維細胞 轉分化為神經元 [26,27]。我們之前建立了一個調節環路，轉錄抑制因子REST抑制miR-124， miR-124反過來抑制REST復合物中的多個關鍵組份，并且RNA結合蛋白PTB既作為miR-124 的底物又是miR-124對靶位點識別的關鍵抑制因子。我們的結果表明PTB敲低能夠強有力的 激活該通路并且將小鼠成纖維細胞轉分化為功能性的神經元 [28]。

【發明內容】

[0006] 本發明發現了與神經細胞成熟相關的信號通路，進一步的本發明還發明了基于該 信號通路的一系列應用和相應的產品，如調控神經細胞成熟的方法、基于該信號通路的體 細胞重編程獲得神經細胞的方法等。任何基于本發明的信號通路的關于神經細胞成熟的發 明都屬于本發明的保護范圍。
[0007] 本發明中所述的信號通路為nPTB-BRN2-miR-9信號通路，其為:nPTB的下調誘導 BRN2活化;被激活的BRN2上調miR-9 ;miR-9下調nPTB。
[0008] 進一步對所述nPTB-BRN2-miR-9信號通路的解釋為:nPTB的下調誘導BRN2活化;被 激活的BRN2誘導miR-9轉錄水平提高，表達量增加的miR-9反過來又可下調nPTB的mRNA和/ 或蛋白質水平。
[0009] 上述信號通路中，"nPTB的下調誘導BRN2活化"中的"nPTB的下調"指從DNA水平、 RNA水平和/或蛋白水平下調;所述"下調"可以是降低或者完全抑制。如在DNA水平進行基因 敲除、在RNA水平或蛋白水平進行表達量的抑制。
[0010] 上述信號通路中，"BRN2活化"是指轉錄因子BRN2的RNA7K平或是蛋白水平的提高。 [0011] 上述信號通路中，"被激活的BRN2上調miR-9"中的"上調miR-9"是指使miR-9的編 碼基因轉錄出更多的miR-9。
[0012] 上述信號通路中，"miR-9下調nPTB"中的"下調nPTB"是指從RNA水平和/或蛋白水 平下調，所述"下調"可以是降低或者完全抑制。
[0013 ]本發明提供了誘導神經細胞成熟的方法。
[0014] 本發明所提供的誘導神經細胞成熟的方法，包括如下步驟:激活未成熟的神經細 胞中的nPTB-BRN2-miR-9信號通路；所述nPTB-BRN2-miR-9信號通路為:nPTB的下調誘導 BRN2活化;被激活的BRN2上調miR-9 ;miR-9下調nPTB。
[0015] 上述誘導神經細胞成熟的方法中，所述未成熟的神經細胞為具有如下至少一種特 征的細胞：
[0016] (1)具備神經元細胞類似的細長突觸；
[0017] (2)表達神經元細胞早期標志物Tujl，不表達成熟神經元相關標志物，如Map2、 NeuN 和 NF 等；
[0018] (3)不具備神經細胞特異的動作電位和鈉離子電流。
[0019] 上述誘導神經細胞成熟的方法中，所述激活未成熟的神經細胞中的nPTB-BRN2-miR-9信號通路的方法為如下至少一種：
[0020] (1)下調 nPTB;
[0021] (2)活化 BRN2;
[0022] (3)上調miR-9。
[0023] 上述激活未成熟的神經細胞中的nPTB-BRN2-miR-9信號通路的方法中，"下調nPTB 基因"指從DNA水平、RNA水平和/或蛋白水平下調;所述"下調"可以是降低或者完全抑制。如 在DNA水平進行基因敲除或敲低、在RNA水平或蛋白水平進行表達量的抑制。
[0024] 上述激活未成熟的神經細胞中的nPTB-BRN2-miR-9信號通路的方法中，當敲低或 敲除nPTB基因時，使用的質粒為如下任一種：
[0025] (1)將序列1所示DNA片段插入ptripz質粒的EcoRI和Xhol位點中間，即得shnptb質 粒1;
[0026] (2)將序列2所示DNA片段插入ptripz質粒的EcoRI和Xhol位點中間，即得shnptb質 粒2;
[0027] (3)將序列3所示DNA片段插入ptripz質粒的EcoRI和Xhol位點中間，即得shnptb質 粒3;
[0028] (4)將序列4所示DNA片段插入ptripz質粒的EcoRI和Xhol位點中間，即得shnptb質 粒4;
[0029] (5) shnptb 質粒 1、shnptb 質粒 2、shnptb 質粒 3 和shnptb 質粒 4 的混合物。
[0030]上述激活未成熟的神經細胞中的nPTB-BRN2-miR-9信號通路的方法中，所述"活化 BRN2"可以利用本領域技術人員所熟知的常規技術手段實現，以達到活化BRN2的目的。所述 技術手段具體可以是是BRN2在蛋白水平或RNA水平表達量提高或者利用CRISPR等基因編輯 手段激活轉錄。
[0031 ] 上述激活未成熟的神經細胞中的nPTB-BRN2-miR-9信號通路的方法中，所述活化 BRN2的方法為過表達BRN2。
[0032] 上述激活未成熟的神經細胞中的nPTB-BRN2-miR-9信號通路的方法中，所述過表 達BRN2的過程中使用如下重組載體:在骨架載體pTRIPZ的Xho I至EcoR 1位點間插入序列5 所示DNA，得到中間載體;再向中間載體的Agel至Clal位點間用BRN2的編碼基因取代RFP，即 得重組載體。
[0033] 上述誘導神經細胞成熟的方法中，所述成熟神經細胞是按照本領域技術人員的常 識判斷的，具體可為具有如下至少一種特征的細胞：
[0034] (1)表達成熟神經元的標志物蛋白Map2、NeuN、Synl、vGLUTl、NF、NCAM等；
[0035] (2)具備神經細胞特異的鈉離子電流和動作電位；
[0036] (3)與膠質細胞共培養后能夠形成突觸后電流。
[0037] 上述誘導神經細胞成熟的方法中還包括細胞培養的步驟，細胞培養過程中使用下 述任一小分子化合物：（1)SB431542; (2)CHIR99021; (3)Db-cAMP; (4)SB431542、CHIR99021 和Db-cAMP。
[0038] 本發明還提供了一種將人體細胞重編程得到成熟神經細胞的方法。
[0039] 本發明所提供的將人體細胞重編程得到成熟神經細胞的方法，包括如下步驟：
[0040] (1)將所述人體細胞重編程得到未成熟的神經細胞；
[0041] (2)按照上述任一所述誘導神經細胞成熟的方法，將所述未成熟的神經細胞轉變 為成熟神經細胞。
[0042] 上述將人體細胞重編程得到成熟神經細胞的方法中，所述將所述人體細胞重編程 得到未成熟的神經細胞的方法為:下調所述人體細胞中的PTB基因。
[0043] 其中，"下調PTB基因"指從DNA水平、RNA水平和/或蛋白水平下調;所述"下調"可以 是降低或者完全抑制。如在DNA水平進行基因敲除、在RNA水平或蛋白水平進行表達量的抑 制。
[0044] 上述將人體細胞重編程得到成熟神經細胞的方法中，所述下調PTB是指敲低或敲 除PTB基因。
[0045] 可以通過本領域技術人員所掌握的手段來達到下調PTB的目的。具體的，可使用如 下（1)或（2)所示重組載體：（1)在骨架載體pTRIPZ的Xho I至EcoR 1位點間插入序列5所示 DNA，得到中間載體;再向中間載體的Age 1至Cla 1位點間用BRN2的編碼基因取代RFP，即得重 組載體。（2)在骨架載體plko. 1-hygromycin的Age I至EcoR I位點間插入序列5所示DNA得 到的重組載體。
[0046] 上述將人體細胞重編程得到成熟神經細胞的方法中，所述未成熟的神經細胞為具 有如下至少一種特征的細胞：
[0047] (1)具備神經元細胞類似的細長突觸；
[0048] (2)表達神經元細胞早期標志物Tujl，不表達成熟神經元相關標志物，如Map2、 NeuN 和 NF 等；
[0049] (3)不具備神經細胞特異的動作電位和鈉離子電流。
[0050] 上述將人體細胞重編程得到成熟神經細胞的方法中，所述成熟神經細胞是按照本 領域技術人員的常識判斷的，具體可為具有如下至少一種特征的細胞：
[0051 ] (1)表達成熟神經元的標志物蛋白Map2、NeuN、Synl、vGLUTl、NF、NCAM等；
[0052] (2)具備神經細胞特異的鈉離子電流和動作電位；
[0053] (3)與膠質細胞共培養后能夠形成突觸后電流。
[0054] 上述將人體細胞重編程得到成熟神經細胞的方法中，所述人體細胞為人的非神經 細胞，具體為人成纖維細胞。所述人體細胞可為離體的人體細胞。
[0055] 上述將人體細胞重編程得到成熟神經細胞的方法中還包括細胞培養的步驟，細胞 培養過程中使用下述任一小分子化合物：（1)SB431542; (2)CHIR99021; (3)Db-cAMP; (4) SB431542、CHIR99021和Db-cAMP。
[0056] 本發明的將人體細胞重編程得到成熟神經細胞的具體一個例子是：（1)敲低/敲除 人成纖維細胞中的PTB基因，培養，得到未成熟的神經細胞；（2)再將步驟（1)所得未成熟的 神經細胞中的nPTB基因敲低/敲除，培養，得到成熟的神經細胞。
[0057] 該具體例子中，所述步驟（1)中敲低/敲除人成纖維細胞中的PTB基因中使用如下 (1)或（2)所示重組載體：（1)在骨架載體pTRIPZ的Xho I至EcoR 1位點間插入序列5所示 DNA，得到中間載體;再向中間載體的Age 1至Cla 1位點間用BRN2的編碼基因取代RFP，即得重 組載體；（2)在骨架載體plko. Ι-hygromycin的Age I至EcoR I位點間插入序列5所示DNA得 到的重組載體；
[0058]該具體例子中，所述步驟（2)中敲低/敲除nPTB基因時使用的質粒為如下任一所 示：
[0059] (1)將序列1所示DNA片段插入ptripz質粒的EcoRI和Xhol位點中間，即得shnptb質 粒1;
[0060] (2)將序列2所示DNA片段插入ptripz質粒的EcoRI和Xhol位點中間，即得shnptb質 粒2;
[0061 ] (3)將序列3所示DNA片段插入ptripz質粒的EcoRI和Xhol位點中間，即得shnptb質 粒3;
[0062] (4)將序列4所示DNA片段插入ptripz質粒的EcoRI和Xhol位點中間，即得shnptb質 粒4;
[0063] (5) shnptb 質粒 1、shnptb 質粒 2、shnptb 質粒 3 和shnptb 質粒 4 的混合物。
[0064] 該具體例子中，所述步驟(1)中未成熟的神經細胞具有如下特征中至少一種：
[0065] (1)形態上已經具有神經元類似的細長和發散型的突觸；
[0066] (2)表達神經元細胞早期標志物1\1]_1，不表達成熟神經元相關標志物如1&^|2、如1^ 和NF等
[0067] (3)不具備神經細胞特異的動作電位和鈉離子電流。
[0068] 該具體例子中，所述步驟(1)中培養的時間為3天。
[0069] 本發明的另一個將人成纖維細胞重編程得到成熟神經細胞的具體例子是如下（1) 或(2)所示：
[0070] (1)敲低/敲除人成纖維細胞中的PTB基因，培養，得到未成熟的神經細胞;再在未 成熟的神經細胞中過表達BRN2，培養，得到成熟的神經細胞；
[0071] (2)在人成纖維細胞中同時敲低/敲除PTB基因和過表達BRN2,得到成熟的神經細 胞。
[0072]在先敲低/敲除PTB基因再過表達BRN2的例子中：敲低/敲除人成纖維細胞中的PTB 基因的過程中使用如下重組載體:在骨架載體plko. 1-hygromycin的Age I至EcoR I位點間 插入序列5所示DNA得到的重組載體;過表達BRN2使用如下重組載體:在骨架載體pTRIPZ的 Xho I至EcoR 1位點間插入序列5所示DNA，得到中間載體;再向中間載體的Age 1至Cla 1位點 間用BRN2的編碼基因取代RFP，即得重組載體。
[0073]在人成纖維細胞中同時敲低/敲除PTB基因和過表達BRN2的例子中，所述方法中使 用如下重組載體:在骨架載體pTRIPZ的Xho I至EcoR 1位點間插入序列5所示DNA，得到中間 載體;再向中間載體的Agel至Clal位點間用BRN2的編碼基因取代RFP，即得重組載體。
[0074]上述將人成纖維細胞重編程得到成熟神經細胞的具體例子中，所述步驟（1)中未 成熟的神經細胞具有如下特征中至少一種：
[0075] (1)形態上已經具有神經元類似的細長和發散型的突觸；
[0076] (2)表達神經元細胞早期標志物1\1]_1，不表達成熟神經元相關標志物如1&^|2、如1^ 和NF等
[0077] (3)不具備神經細胞特異的動作電位和鈉離子電流。
[0078] 上述兩個具體例子中，還包括細胞培養的步驟，細胞培養過程中使用下述小分子 化合物：SB431542、CHIR99021 和 Db-cAMP。
[0079] 本發明提供了將人體細胞重編程得到成熟神經細胞過程中使用的產品，為如下 (A)或⑶：
[0080] (A)如下任一種敲低或敲除nPTB基因時使用的質粒：
[0081 ] (1)將序列1所示DNA片段插入ptripz質粒的EcoRI和Xhol位點中間，即得shnptb質 粒1;
[0082] (2)將序列2所示DNA片段插入ptripz質粒的EcoRI和Xhol位點中間，即得shnptb質 粒2;
[0083] (3)將序列3所示DNA片段插入ptripz質粒的EcoRI和Xhol位點中間，即得shnptb質 粒3;
[0084] (4)將序列4所示DNA片段插入ptripz質粒的EcoRI和Xhol位點中間，即得shnptb質 粒4;
[0085] (5)shnptb 質粒 1、shnptb 質粒 2、shnptb 質粒 3 和 shnptb 質粒 4 的混合物；
[0086] (B)敲低/敲除PTB基因和過表達BRN2時使用的質粒：
[0087] 在骨架載體pTRIPZ的Xho I至EcoR 1位點間插入序列5所示DNA，得到中間載體； 再向中間載體的Agel至Clal位點間用BRN2的編碼基因取代RFP，即得重組質粒。
[0088] 由上述任一所述方法得到的成熟神經細胞也屬于本發明的保護范圍。
[0089] 如下任一所述應用也屬于本發明的保護范圍：
[0090] (1 )nPTB-BRN2-miR-9信號通路在誘導神經細胞成熟中的應用，或nPTB-BRN2-miR-9信號通路作為靶標在制備誘導神經細胞成熟的產品中的應用；
[0091 ] (2)激活nPTB-BRN2-miR-9信號通路的物質在誘導神經細胞成熟中的應用，或激活 nPTB-BRN2-miR-9信號通路的物質在制備誘導神經細胞成熟的產品中的應用；
[0092] (3)下調nPTB的物質在誘導神經細胞成熟中的應用，或下調nPTB的物質在制備誘 導神經細胞成熟中的應用；
[0093] (4)活化BRN2的物質在誘導神經細胞成熟中的應用，或活化BRN2的物質在制備誘 導神經細胞成熟中的應用；
[0094] (5)上調miR-9的物質在誘導神經細胞成熟中的應用，或上調miR-9的物質在制備 誘導神經細胞成熟中的應用；
[0095] (6)下調nPTB的物質在誘導BRN2活化中的應用，或下調nPTB的物質在制備誘導 BRN2活化的產品中的應用；
[0096] (7)被激活的BRN2在誘導miR-9轉錄中的應用，激活BRN2的物質在誘導miR-9轉錄 中的應用，或激活BRN2的物質在制備誘導miR-9轉錄的產品中的應用；
[0097] (8)miR-9在下調nPTB中的應用，或miR-9在制備下調nPTB的產品中的應用。
[0098] 上述任一應用均指在人體細胞中的應用，具體是非神經體細胞，再具體可為人成 纖維細胞。
[0099] 本發明還提供了用于提高體細胞向神經細胞轉分化效率的產品，為如下至少一 種；
[0100] (DSB431542；
[0101] (2)CHIR99021；
[0102] (3)Db_cAMP(N6，2'-〇-Dibutyryladenosine 3' ，5'-cyclic monophosphate sodium salt)。
[0103] (4)SB431542、CHIR99021 和Db-cAMP^e，〗'-O-Dibutyryladenosiru^ ,5'-cyclic monophosphate sodium salt)。
[0104] (5)shPTB和SB431542;
[0105] (6)shPTB和CHIR99021;
[0106] ( 7 ) shPTB和Db-cAMP (N6，2'-〇_D ibutyry 1 adeno s ine 3'，5'_cy c 1 i c monophosphate sodium salt)。
[0107] (8)81^了8和58431542、〇111?99021和013-。厶103(冊，2 /-0-0113扯7巧13(1611〇81116 3/， 57-cyclic monophosphate sodium salt)。
[0108] shPTB按照如下方法構建:在骨架載體plko.l-hygromycin的Age I至EcoR I位點 間插入序列5所示DNA得到的重組載體shPTB。
[0109] SB431542是一種強效的小分子抑制劑，選擇性抑制轉化生長因子i3((TGF-i3))I型 受體活化素受體樣激酶ALK5，ALK4和ALK7。所述CHIR99021是肝糖原合成激酶3i3(GSK3i3)受 體的選擇性抑制劑。所述Db-cAMP的化學名為N6-2'-0-雙丁酰-3'，5'-環磷酸腺苷，別稱二 丁酰環磷腺苷鈣。
[0110] 本發明還提供了一種用于提高體細胞向神經細胞轉分化效率的方法，包括如下步 驟:在由體細胞向未成熟神經細胞轉分化過程中向使用的培養基中添上述用于提高體細胞 向神經細胞轉分化效率的產品中的小分子化合物，和在由未成熟神經細胞向成熟神經細胞 轉化過程中向使用的培養基中添加用于提高體細胞向神經細胞轉分化效率的產品中的小 分子化合物。
[0111] 上述用于提高體細胞向神經細胞轉分化效率的方法中，由體細胞向未成熟神經細 胞轉分化中，先利用shPTB將體細胞中的ΡΤΒ基因敲除或敲低，然后再進行培養得到未成熟 神經細胞。
[0112] 上述任一所述方法、由上述任一所述方法獲得的成熟神經細胞、任一所述應用、任 一所述的產品在治療神經類疾病中的應用也屬于本發明的保護范圍。
[0113] 所述神經類疾病為神經退行性疾病和腦腫瘤。其中所述神經退行性疾病包括阿茲 海默病，肌肉萎縮性側索硬化癥，帕金森氏病等;其中腦腫瘤主要包括腦膠質瘤等。
[0114] 本發明的發明人在研究過程中發現，敲除PTB能夠將人成纖維細胞有效地轉化為 具有復雜形態的神經元樣細胞，尤其是當與一些小分子抑制劑聯用時，但是所有誘導得到 的神經元都是未成熟的，提示PTB敲低足以激活小鼠完整的神經元程序，但是在人類中不能 夠完全激活。進一步的，本發明的發明人揭示了人類細胞中促進神經成熟的第二條環路，這 個環路包含PTB的旁系同源基因 nPTB;另一個神經元特異性的miRNA，miR-9;轉錄活化劑 BRN2。在這個環路中，BRN2轉錄激活的miR-9，miR-9反過來轉錄后減少nPTB。試驗證明，該環 路調控人的神經細胞的重編程。本發明的信號通路、以及激活信號通路的方法和物質在制 備神經類疾病，特別是神經退行性疾病和腦腫瘤的藥物中具有重要應用價值。
【附圖說明】
[0115] 圖1為人成熟纖維母細胞中shPTB和小分子抑制劑介導的定量神經誘導。（a)左，應 答PTB減少的EdU脈沖標記;右，EdU信號定量(shCtrl組、shPTB組）（b)PTB抑制（人成熟纖維 母細胞系在N3培養基培養14天）（c)PTB抑制的同時篩選在人成熟纖維母細胞轉分化為類神 經細胞過程中的小分子抑制劑小分子抑制劑：CHIR，SB，dibutyryl cyclin AMP，FSK，Ng， LDN(D)人成熟纖維母細胞對照shRNA，shPTB分別處理三天后額外添加3SM處理3小時，6小 時，9小時，18小時，36小時，72小時，168小時Tujl/紅，纖維母細胞標記分子-纖連蛋白（綠）， DAPI(藍）（e)不同時間點Tujl和纖連蛋白陽性細胞百分比。
[0116] 圖2為HAF細胞通過連續地敲低PTB和PTB產生功能神經元。（a)HAF細胞經過PTB敲 低誘導產生的神經類似細胞中Tujl (紅)高表達而MAP2(綠)幾乎不表達。n = 3次獨立的生物 學重復。細胞核染色染料為DAPI (藍）。（13，〇)在PTB敲除處理的MEFs(b)HAFs(C)中利用 we s tern-blot對nPTB表達量隨時間變化的分析· PTB和nPTB通過we stern-blot檢測，β-act in作為上樣對照；η =兩次獨立實驗。所有未處理的原始western-blot版本在 Supplementary Figure 7中.（d)通過連續的敲低PTB和nPTB的重編程策略:HAFs首先被包 含有表達shnPTB和紅色熒光蛋白（RFP)的可誘導性慢病毒以及shPTB表達型慢病毒感染。經 過潮霉素篩選后，用3種小分子處理細胞。shnPTB的表達是通過在不同時間向培養基中添加 強力霉素誘導的。FGF2:纖維母細胞生長因子2;NTF:神經營養因子。（e)HAFs中不同時間點 nPTB敲低誘導的神經樣細胞代表圖；頂端，不同時間強力霉素處理細胞;在第14天Tujl(綠） 染色。底端，在2-9天用強力霉素處理細胞;在第14天MAP2(綠)染色。紅色熒光蛋白信號表明 慢病毒成功感染細胞。兩次生物學重復展現出相似的結果。（f)頂端，在電壓鉗記錄模式下 的全細胞電流代表曲線。經典的電壓依賴性Na+通道被可逆的抑制通過鈉離子通道抑制劑 TTX(中間）；在藥物洗脫后部分的恢復(底端）。10個被檢測的細胞均呈現出記錄活性。（g)電 流注入誘導的持續動作電位的代表曲線。11個被檢細胞中8個呈現出記錄活性。(h)GABAA受 體--通過GABA的聚焦應用介導電流引起的反應（藍），可以被GABAA受體特異性封閉物 PiTX完全封閉。10個被檢測的細胞均呈現出記錄活性（i-k)自發的突觸后電流(PSCs)記錄 紅色熒光蛋白標記的神經元和綠色熒光蛋白標記的神經膠質細胞.（i)快速動力突觸后電 流。EPSCs被NBQX+APV封閉（j )GABA誘導型抑制PSCs，被PiTX封閉。11個被檢細胞中9個呈現 出記錄活性。
[0117] 圖3為PTB敲除和Brn2表達可促進轉分化的神經細胞成熟。（a)敲低PTB之后，RT-qPCR檢測主要的轉錄因子的mRNA表達量(b)依次敲低PTB和nPTB之后，誘導BRN2的表達量 (c)強力霉素誘導的PTB敲低和BRN2高表達系統(上）；成熟神經細胞相關標志物的免疫熒光 檢測（下），BRN2 (紅），NCAM(紅），vGlut 1 (綠），NeuN(綠）and MAP2 (綠）.Nuclei were stained with DAPI(藍）.（d)誘導得到的神經元具備鈉離子電流。（e)通過電流誘導得到的 神經元重復性的動作電位。（f)檢測到自發的動作電位。（g)EPSCs的代表蹤跡。(h)強力霉素 誘導的神經元與GFP誘導的神經膠質共培養50天。（i-k)神經膠質共培養的神經元檢測到自 發的突出后電流，（i)檢測AMPA電流的動力學。（j)20yM NBQX和50μΜ APV阻斷AMPA電流。 (k)在此基礎上，50μΜ PiTX進一步阻斷ΑΜΡΑ電流。。
[0118] 圖4為BRN2對hNPCs神經元成熟和激活成熟神經元特異的miRNA是很關鍵的。（a) BRN2敲低的hNPCs分化形成的神經元免疫熒光分析，細胞核由DAPI染色(藍色敲 除的hNPCs中S0X2表達（白色），而MAP2不表達(綠色），細胞核由DAPI染色(藍色）。（(3)左側： hNPCs分化形成的神經元(表達和不表達BRN2)整個細胞的電流記錄;右側:在敲低BRN2和分 化前(上面)后（下面)產生電流細胞所占比率。（d)hNPCs分化前后，BRN2ChIP_seq在MIR124-3和MIR9-2位點具有代表性的信號。兩種anti-BRN2抗體（小鼠單克隆抗體IgG B-2和山羊 IgG C-20)用于構建ChIP-seq文庫。（e)hNPCs分化前后，ChIP-qPCR分析BRN2與MIR124位點 (上面)和MIR9位點（下面）的結合（IgG作為陰性對照）。（f)RT-qPCR分析在shPTB處理的HAFs 誘導表達BRN26天(上面)和12天（下面)時miR-124和miR-9的表達情況，U6作為內參。（g)在 HAF分化形成的神經元中連續敲低PTB和nPTB之后，運用RRN2的ChIP-qPCR分析MIR124和 MIR9位點的富集情況（IgG作為陰性對照）。（h)在連續敲低PTB和nPTB的HAFs中，運用RT-qPCR分析miR-124和miR-9的表達，U6作為內參。。
[0119] 圖5為在神經元分化過程中特異的miRNAs抑制nPTBjahiR-g和miR-124在nPTB 3'UTR區的把位點。舉例推測堿基配對可能性、自由能的計算、和特異突變位點的誘導（綠 色）。（13，〇)通過RT-qPCR(頂部部)和免疫印跡法（IB，底部)檢測nPTB在應答miR-124(b)或者 miR-9(c)轉染HAFs過程中的表達量變化。GAPDH and^-actin(ACTB)作為對照。（d，e)在分化 了的hNPCs中通過過表達miR-124(d)or miR-9(e)來觀察nPTB蛋白（頂部)和表達量的改變 的應答反應。GAPDH作為對照。（f)頂部，nPTB表達應答在shPTB和BRN2表達誘導的HAF源的神 經元中過表達miR-124或者miR-9的反應。GATOH作為上樣對照;Kd，敲除。底部為定量結果。 (g)熒光素酶報告基因活性應答HEK293T細胞共轉染野生型和突變型miRNAAPTBP〗或者 mPTBP2,熒光素酶報告基因分別包含人源或者鼠源nPTB 3'UTR區。NC，非特異性對照組。（h) PTB敲除或者PTBP1和nPTB連續敲除及異位表達含有抗shRNA和Flag標簽的nPTB的HAF源的 神經元中MAP2和NeuN的表達。。
[0120] 圖6為成人成纖維細胞中PTB敲低后抑制細胞增殖并且細胞轉分化為神經元譜系。 (a)通過免疫熒光染色鑒定HAFs中各種細胞類型的標記物，結果顯示HAFs細胞中只有成纖 維細胞相關標記物Fibronectin和Vimentin為陽性。角質細胞標記物K5和P63,黑素細胞標 記物MITF和P75,以及神經元的標記物都為陰性。（b)流式細胞術分析EdU標記的PTB敲除及 對照組HAFs細胞，DAPI染色細胞核，Alexa Fluor 647染色EdU陽性細胞。（c)TUJl陽性細胞 (綠色)EdU(紅色)染色則為陰性。（d)免疫熒光顯示PTB單獨敲除或與特異的小分子抑制劑 聯用誘導的神經元樣細胞。紅色:TUJ1，藍:DAPI。比例尺:20微米(e)相襯圖像顯示PTB敲除 組和對照組細胞與小分子化合物聯用處理不同時間點的HAFs細胞。（f)PTB敲除誘導的神經 元細胞，免疫熒光標記神經嵴相關標記物Nestin和Sox2。比例尺:100微米。
[0121] 圖7為實時定量熒光PCR和蛋白印跡效驗nPTB抑制效率。（a)不同時間PTB抑制細胞 NeuN，NF免疫染色；（b)RNA-seq檢測由人成熟纖維母細胞轉分化的神經細胞中ΡΤΒ,ηΡΤΒ表 達量；（c，d)nPTB mRNA和蛋白表達水平，通過時定量熒光PCR檢測shPTB處理的人成熟纖維 母細胞強力霉素處理4天誘導shnPTB的表達。
[0122] 圖8為通過ChIP-qPCR分析在shPTB和多種神經系統特異性的轉錄因子誘導的神經 細胞中REST的靶點和對于膜去極化應答鈣流入的特性。(a)ChlP-qPCR分析在人成熟纖維母 細胞中REST結合在神經轉錄因子的啟動子和miRNA的基因位點(b)PTB抑制的人成熟纖維母 細胞中篩選能促進MAP2表達的轉錄因子(c)由人成熟纖維母細胞通過shPTB和BRN2共同誘 導產生的神經細胞中的鈣流入。
[0123] 圖9為BRN2通過調節不同的靶標來控制神經元的成熟。（a)免疫染色揭示hNPCs特 征，Nestin(綠色），BRN2(紅色)和S0X2(紅色ha^NPCs分化形成神經元BRN2敲低后的免疫 熒光分析。（c)hNPCs分化形成神經元BRN2敲低后對MAP2(綠色)和S0X2(紅色)表達的影響。 (d)PTB，PTB和BRN2敲低后的BRN2和NeuN免疫染色。（e)hNPCs分化形成神經元BRN2敲低后對 鈉離子流(紅色）和鉀離子流(藍色）的損傷。（f)分化的hNPCs中MAP2，Tu j 1和BRN2的蛋白印 跡分析，GATOH作為內參。（g)免疫沉淀反應測試4中商業化可用的BRN2抗體。C-20和B-2被用 于ChIP-seq文庫構建。GAPDH作為陽性對照。（h，i)BRN2靶基因的G0分析。生物過程(h)和生 物組分（i)的G0分析表明BRN2對于神經元的成熟時很重要的。背景為hNPCs表達的所有基 因。
[0124] 圖10為BRN2對nPTB的調節。（a)hNPC分化的神經元在BRN2去除后的PTB和nPTB表達 量的western blot分析。β-actn作為上樣對照。（b)BRN2異常表達后的nPTB表達量的 western blot分析。β-actn作為上樣對照。
【具體實施方式】
[0125] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0126] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0127] 實驗方法：
[0128] 細胞培養，病毒包裝及感染：
[0129] 實驗中共用到兩株原代人成纖維細胞，一株購買于ATCC，這株細胞源于一位42歲 的男性;另一株由Dr. John Ravi ts博士饋贈，源于一位86歲的女性。
[0130] 原代人皮膚成纖維細胞購買于4了0：，源于一位42歲的男性。可在01^1/^12(含20% 胎牛血清，IX青霉素/鏈霉素)或成纖維細胞培養基(DMEM/F12,含5ng/ml重組堿性成纖維 細胞生長因子，lyg/mL氫化可的松，50μg/ml抗壞血酸，5μg/ml重組人胰島素，2%胎牛血清） 中擴大培養。
[0131] 原代人成纖維細胞由Dr.John Ravits博士饋贈，源于一位86歲的女性。
[0132] HEK293細胞培養在DMEM(含10%胎牛血清、100U青霉素/鏈霉素)培養液中。人神經 前體細胞（Human neural progenitor cells,hNPC)在神經生長培養基（DMEM/F12， Glutamax，0 · 5 X N2，0 · 5 X B27和1 X青霉素/鏈霉素）中擴大培養，用Accutase酶(購于Life Technologies)分離hNPCs。用于培養NPC細胞的培養板依次用10ug/ml多聚賴氨酸處理過 夜，2.5ug/ml層黏連蛋白處理3小時。
[0133] 包含轉錄因子 ASCL1，Brn2，mytll和NeuroDICDS序列的質粒購于addgene(#27150， 27151，27152,30129)。將轉錄因子Neurog2(Ngn2)編碼序列插入tet-o-eGFP編碼區的EcoRI 位點。這幾個質粒在圖8b的篩選中用到，發現只有BRN2能夠促進神經成熟。
[0134] 用于敲除人PTB基因[28]的重組載體:在骨架載體plko · l_hygromycin(addgene，# 24150)的Agel至EcoRI位點間插入序列5所示DNA(shPTB的革E序列)得到的重組載體，記作重 組載體 plko.l/shPTB。
[0135] 為了實現神經細胞重編程，首先用重組載體plko.l/shPTB慢病毒感染成人成纖維 細胞16小時，利用hygromycin篩選3天，隨后將細胞培養介質更換為N3培養液(DMEM/F12中 加25μg/ml胰島素，50ug/mL轉鐵蛋白、30nm亞硒酸鈉，20nm孕酮，100nm的putrescrine)培養 2周，誘導細胞出現神經元形態。
[0136] 用小分子增加轉分化效率的方法（即人成纖維細胞中敲除PTB的方法）：①用上述 重組載體plko. Ι/shPTB感染成人成纖維細胞16小時;利用hygromycin篩選3天。②將細胞培 養在N3/基礎培養基（1:1混合的DMEM/F12培養液和Neurobasal，25μg/ml胰島素，50ug/mL轉 鐵蛋白、30nm亞硒酸鈉，20nm孕酮，100nm putrescrine，0 · 4%B27)中培養2天。③在加入小 分子lum CHIR99021、10um SB431542、10ng/mlFGF2和ImM Db-cAMP的N3/基礎培養基中培養 2天。④將細胞培養至包含lum CHIR99021、10um SB431542、lmM Db-cAMP、10ng/ml FGF2、 lOng/ml BDNF、10ng/ml ⑶NF、10ng/ml NT3、10ng/ml CNTF和2%FBS的N3/basal培養基中 培養。每隔一天換一次液。
[0137] 用于敲除nPTB的重組載體：將序列1-4所示DNA(靶序列）分別插入ptripz質粒的 EcoRI和Xhol位點中間，得到四個重組載體，記作ptripz/shnPTBl、ptripz/shnPTB2、 ptripz/shnPTB3、ptripz/shnPTB4〇
[0138] 連續敲除PTB和nPTB的方法:①將上述重組載體ptripz/shnPTBl-4等比例混合，再 和psPAX2和pMD.2G質粒在293T細胞中包裝成可表達shnPTB的可誘導性慢病毒，然后感染 人成纖維細胞得到可誘導敲低nPTB的細胞系;②再用重組載體plko.l/shPTB感染細胞16小 時，并利用hygromycin篩選3天;③在N3/FGF2/3SM培養基中培養2天;④在N3/FGF2/3SM/2% serum培養基中培養5天，期間在不同的時間點進行強力霉素誘導（不同的實驗組誘導時間 點不同）；⑤在N3/FGF2/NTF/B27/Db-Camp/2 % serum培養基中培養7天。
[0139] 其中，N3/FGF2/3SM培養基:N3培養液(DMEM/F12中加25μg/ml胰島素，50ug/mL轉鐵 蛋白、30nm亞硒酸鈉，20nm孕酮，100nm的putrescrine，10ng/ml FGF2，lum CHIR99021、10um SB431542、10ng/ml FGF2、lmM Db-cAMP)。
[0140] N3/FGF2/3SM/2% serum培養基：加入小分子lum CHIR99021、10um SB431542、 lOng/ml FGF2、lmM Db-cAMP的N3/基礎培養基，S^FBS。^/基礎培養基（1:1混合的DMEM/ ?12培養液和此111'<^3831，25以8/1111胰島素，5(^8/1111^轉鐵蛋白、3〇111]1亞硒酸鈉，2〇111]1孕酮， lOOnm putrescrine,0.4%B27)
[0141] N3/FGF2/NTF/B27/Db-Camp/2%serum培養基：加 lum CHIR99021、10um SB431542、 ImM Db-cAMP、10ng/ml FGF2、10ng/ml BDNF、10ng/ml ⑶NF、10ng/ml NT3、10ng/ml CNTF和 2%FBS 的 N3/basal 培養基。
[0142] 敲除PTB再過表達Brn2中使用的載體的構建：用于敲除PTB和過表達BRN2的強力霉 素-依賴性重組載體:在出發載體pTRIPZ的Xho I至EcoR 1位點間插入序列5所示DNA(shPTB 的靶序列），得到中間載體;再向中間載體的Agel至Clal位點間用BRN2的編碼基因取代RFP， 即得重組載體，記作重組載體PTRIPZ/APTB/BRN2。
[0143] 敲除PTB再過表達Brn2的方法:①用上述重組載體pTRIPZ/APTB/BRN2感染成人成 纖維細胞16小時;②利用puromycin在含有強力霉素的成纖維細胞培養基中篩選3天得到可 同時敲低PTB和過表達BRN2的可誘導細胞系；③將細胞培養在N3/基礎培養基（1:1混合的 DMEM/F12培養液和Neurobasal，25μg/ml膜島素，50ug/mL轉鐵蛋白、30nm亞砸酸納，20nm孕 酮，100nm putrescrine，0.4%B27)中 2 天。④在加入小分子 lum CHIR99021、10um SB431542、10ng/mlFGF2和ImM Db-cAMP的N3/基礎培養基中培養2天。⑤將細胞培養至包含 lum CHIR99021、10um SB431542、lmM Db-cAMP、10ng/ml FGF2、10ng/ml BDNF、10ng/ml ⑶NF、1 Ong/ml NT3、1 Ong/ml CNTF和2 % FBS的N3/basal培養基中培養。每隔一天換一次液。
[0144] 單獨使用重組載體pTRIPZ/APTB/BRN2時PTB的敲除效率只能達到70%。如果先用 plko.l/shPTB慢病毒處理一下細胞，則PTB的敲除效率更好。
[0145] 為了測量突觸電流，誘導的神經元被接種到鋪有單層膠質細胞(來自于P1代GFP轉 基因大鼠）的培養板中培養2 - 3周。為了將hNPC分化為皮層神經元，將FGF2從NG培養液去除， 然后用10uM ROCK抑制劑Y27632處理24小時，將細胞培養在NG培養液中2-6個星期。將收集 的病毒上清在sw-28貝克曼轉子內以20000轉離心濃縮2小時產生病毒顆粒，然后加入NG培 養液中，同時加入終濃度為lyg/mL的polybrene。
[0146] 小分子抑制劑的滴定測量:為了增強nPTB敲除引起的重編程效率，我們檢測了幾 個利于神經元分化的小分子以不同濃度和不同組合帶來的影響。SB431542是ALK5特定的抑 制劑，我們檢測了SB431542四種不同濃度的影響（lum，2um，4um，10um)，發現10uM為最適濃 度，與文獻中報道的濃度基本一致 [29]<XHIR99021是糖原合成酶激酶3?CGSK-3⑩)最特異 的抑制劑。我們選擇了四種不同濃度(0 · 5um，lum，2um，4um)，結果發現luM為最適濃度，略低 于文獻中報道的最適濃度[3() '32 ]。Db-cAMP和毛喉素是cAMP依賴的蛋白激酶(PKA)特異性的 激動劑，我們選擇了四個濃度(〇. lmM，〇. 2mM，0.5mM，ImM)，發現最適工作濃度為ImM。同時， 我們測試了三種不同濃度（5um，10um和20um)的毛喉素，發現最佳工作濃度為20uM，這與文 獻中報道的工作濃度略有不同。Noggin是BMP-4的拮抗劑，但它也可以調節其他BMPs的活 力，包括81^-2、-7、-13、-14。而且我們發現這種抑制劑在任何濃度（50叫/1111，10〇1^/1111， 200ng/ml，500ng/ml)都無法增強神經細胞重編程效率。LDN-193189是ALK2和ALK3的拮抗 劑，我們在不同的測試濃度(〇. 〇5mM，0.1 mM，0.2mM，0.5mM)沒有觀察到任何影響。在單獨測 量以上抑制劑影響的基礎上，我們發現同時加入lum CHIR99021，10uM SB431542和ImM db-cAMP能達到最佳的重編程效率。此處三個小分子是在PTB敲低后，轉分化為初始神經元細胞 階段加入。
[0147] 雙熒光素酶檢測、Western blot和實時熒光定量PCR:為了構建特定的miRNA的熒 光素酶報告載體，我們克隆了小鼠和人nPTB的31TR區域，將其插入psicheck2質粒的Xhol 和Notl位點之間。將l-5ng的報告載體和30pm的miRNA mimics共轉染24小時后，用雙螢光素 酶檢測試劑盒(Promega)檢測螢光素酶活力。為了檢測蛋白表達情況，用不含溴酚藍的SDS 裂解緩沖液裂解細胞，定量后，加入溴酚藍至終濃度為〇. 1 %，25ug總蛋白在10%Bis-Tris 膠中被分離，同時利用以下抗體檢測蛋白表達：鼠抗-ptbpl (單克隆抗體BB7，ATCC，crl-2501)，兔抗-ptbp2IS2(由 UCLA 的 Dr .Douglas Black 贈予）[35]、ptbp2 單克隆抗體(M01， Abnova)，鼠 ptbp2單克隆抗體（ab57619，Abcam)，兔抗_BRN2(Cell Signaling Technology， 12137)和抗GAFOiK 14cl0，Cell Signaling Technology)，抗Flag(Sigma，F3165)和鼠抗-ACTB(A2228，Sigma)。利用Trizol法提取總RNA(Life Technology)，同時可以加入lOug/ml 糖原于沉淀豐富的小RNAs。提取的總RNA首先用DNase I (Promega)處理，然后用反轉錄試劑 盒(Life Technology)進行反轉錄。最后利用基因特定的引物及SYBR Green(Roche)染料， 通過Step-One Plus PCR(Applied Biosystems)儀檢測基因表達。三次重復實驗的t檢驗計 算統計學差異。質粒構建和PCR反應的所有引物如下。
[0149] 電生理實驗：根據文獻報道利用全細胞膜片鉗進行電生理實驗。唯一不同之處在 于培養的細胞必須在37 °C含氧（95 %氧，5 %二氧化碳）的人工腦脊液（150mM NaCl，5mM KCl，lmM CaCl2,2mM MgCl2，10mM glucose，10mM HEPES，pH 7.4)中培養30分鐘。電生理實驗 在電位-75mV條件下進行，移液管阻力為5-8M Ω。在膜片鉗記錄模式下通過逐步注入去極化 電流檢測動作電位，吸液管溶液含有150mM KCl，5mM NaCl，lmM MgC12,2mM EGTA，lmM Mg-ATP,和lOmM HEPES(pH 7.2,用KOH調PH值hlmM GABA用來誘導產生GABA電流。本實驗中使 用了以下濃度的通道抑制劑：TTX: luM; PiTX: 50uM; NBOX: 20uM; APV: 50uM。所有實驗均在室 溫下進行(20-22 °C)。
[0150] 免疫細胞化學：細胞接種于特殊的蓋玻片上(BD，356234)培養，然后用4%多聚甲 酸（Electron Microscopy Sciences)室溫固定 15分鐘，隨后在PBST(0.1%Triton X-100 roS)中冰上通透15分鐘。PBS洗兩次，細胞在含3 %牛血清白蛋白的PBS室溫封閉lh。以下這 些一抗加入細胞中孵育1小時：兔抗-切]_1((：〇￥&1^6，11^-435?，1:1，000)，鼠抗-切]_1 (Covance，MMS-435P，1:1，000)，鼠抗-MAP2 (Mi 11 ipore，MAB3418，1:1，000)、鼠抗NeuN (Millipore，MAB377，1:200)，兔抗synapsin I (Synaptic Systems，106001，1: 5，000)，兔 抗-vglutl (Synaptic Systems，135-303，1:200)，兔抗GABA(Sigma，A2052，1:1000)，兔抗-brn2(Cell Signaling Technology，12137，1:500)，鼠抗纖維連接蛋白（DSHB, 13G3B7,1: 500)、鼠抗丫;[1116111:;[11-594(八130&1113?1?3776，1:1，000)，鼠抗卩63(1'1161'1]1〇?181161'，]\^1-21871， 1:300)，羊抗MITF(Santa Cruz，sc-10999,1:100)，兔抗-k5(Thermo Fisher，RM2106S0，1: 300)，兔抗NGF受體p75 (Mi 11 ipore，AB 1554，1:100)，山羊抗-sox2 (Santa Cruz，sc-17319， 1: 200)，鼠抗-pax3(DSHB，PAX3，1: 250)，鼠抗-pax7(DSHB，PAX7-C，1: 250)，鼠抗-nkx2 · 2 (DSHB，74 · 5A5，1:100)，鼠抗NCAM(DSHB，5A5-c，1:100)，鼠抗01 igl (Neuromab，75-180，1: 100)，鼠抗GFAP (Neuromab，75-240，1:100)，兔抗-吐『1(]\^111口〇代，厶810554，1:300)，鼠抗 0卩卩（1^1^16。1111。1。8168，厶-11120，1:400)，兔抗-8(?10(厶匕86111:，厶？5854。，1:50)，兔抗-brn3a(Bioss USA,bs_3669R, 1:50)。焚光標記的二抗和DAPI分別（Life Technologies，A-21207，A-21202，A-21203，and A-21206)孵育細胞lh和20分鐘。PBS洗六次，用fluoromount-g封片劑封片，最后在奧林巴斯F1 uoVi ew FV1000顯微鏡下拍照統計。
[0151] ChIP-seq鑒定BRN2靶基因：首先，將人NPC細胞用1 %甲醛交聯，然后用2.5M甘氨酸 終止交聯。用預冷的PBS洗三次，將細胞從培養皿上刮下于離心管中，2500rpm離心收集細 胞，細胞沉淀重懸在lml細胞裂解液中，混勻，冰上孵育10-15分鐘，每兩分鐘顛倒一下。3， 500rpm離心5分鐘，棄上清，將沉淀重懸到500ul核裂解液中（l%SDS，10mM EDTA，50mM Tris-Cl，pH 8.1，蛋白酶抑制劑），冰上孵育10分鐘。將重懸液按最大功率超聲(Branson， Sonifer cell disruptor 185)破碎7次，間隔為 1〇8。4°〇，14,000印111離心10分鐘，收集上清 于 15ml離心管中。取上清用緩沖液（l%TritonX-100,2mMEDTA，150mMNaCl，20mMTris-Cl，pH 8.1，蛋白酶抑制劑)稀釋10倍產生可溶性染色質，每個染色質免疫共沉淀反應需要 100-200ug。裂解液中加入20ul蛋白A/G磁珠(？丨從沈，88802)，4°(：旋轉孵育1小時。加5呢抗 Brn-2抗體于裂解上清中，4 °C孵育過夜。同時，將蛋白A/G磁珠加入含有5mg/ml BSA-fraction V的PBS中4°C孵育4小時。通過磁力架收集磁珠，于4°C按如下順序清洗磁珠： 0.7ml TSEl(0.1%SDS,l%Triton X-100,2mM EDTA,20mM Tris-HCl,pH 8.1,150mM NaCl) 兩次；TSEII兩次（0·l%SDS，l%Trit。nX-100,2mMEDTA，20mMTris-HCl，pH8·l，500mM NaCl)；buffer 111(0.25M LiCl,1%NP-40,1%deoxycholate,ImM EDTA,10mM Tris-HCl, pH 8.0)兩次；lml TE buffer兩次。最后，清洗過的磁珠用150ul洗脫緩沖液(TE buffer, 1 % SDS)在70°C，1，OOOrpm振動洗脫兩次，離心10分鐘取上清。將洗脫液置于65°C孵育過夜 解交聯。150ul可溶性染色質作為陽性對照，利用QIAquick(Qiagen，CA)PCR回收試劑盒回收 DNA〇
[0152] 構建ChlP-seq文庫的試劑盒為TruSeq ChIP Sample Prep Kit(Illumina)。為了 獲取spike-in的嚴格對照，在免疫共沉淀步驟中，分別加700ng果繩的可溶性染色體至 200ug hNPC分化前后的可溶性染色體中。隨后加入5ug Brn2抗體和lug果蠅特異性的H2AV 抗體(Active Motif ,39716)。高通量測序后，果繩的測序tag被用來作為spike-in對照。 ChlP-seq所得的數據被比對到人的genome上，利用SAM工具去掉重復及低質量的reads，通 過MACS軟件 [54]識別結合區域，由此得到的BRN2靶基因數據。
[0153] 統計分析:用SigmaPlot 12軟件中的雙尾T檢驗來評估統計學差異，將第一組實驗 次數加上第二組的實驗次數再減去2定義為自由度。兩組數據之間的方差是接近的，數據的 分布符合正態分布，但是沒有被檢驗過。所有的數據采集和分析都是嚴格按照不同處理條 件來區分。圖像在20倍鏡下隨機采集獲取，本研究并未采用統計方法確定樣本大小，但我們 的樣本規格符合本領域通常采用的標準。
[0154] 結果：
[0155] 人源細胞神經轉化的起始障礙物
[0156] 我們前期的研究發現一旦敲除PTB便可激活自立的PTB-miR124-REST環路，由于這 個環路是保守的，我們利用相同的策略嘗試重編程兩株分別來源于42歲男性和86歲女性皮 膚的成纖維細胞。這兩株細胞系都表達？；[131'0116(31：；[11、？3?1和￥；[1116111：；[11等成纖維細胞標志 物，而不表達神經元、神經嵴和神經嵴來源的細胞標志物（圖6a) 1TB敲除后可高效的使這 些細胞停止增殖并使細胞周期停滯在G2期（圖la和圖6b)，9-15%的細胞轉變為神經細胞特 異的形狀并且表達Tujl，該轉化效率與我們在鼠成纖維細胞MEF中觀測到的效率類似 [28]。
[0157] 為了增加轉分化的效率，我們嘗試添加已經報道過的可增加神經細胞轉分化的小 分子化合物來測試[29_ 33]。這些小分子化合物單獨處理細胞并不能引起神經細胞轉分化，可 是當把它們和PTB敲低同時處理的話發現有幾個小分子可促進轉分化，我們進而通過組合 優化篩選發現了三個小分子化合物組合可顯著的提高神經細胞轉分化的效率。通過監測轉 化動力學，發現PTB敲低3天后，三個小分子(3SM)能夠提升TUJ1陽性細胞的數量，最早3小時 即可觀測到TUJ1，1天后達到頂峰，而纖維原細胞標志物fibronectin逐漸下降，4天后幾乎 檢測不到，并取得了超高效的轉化率(90%)。對于對照shRNA處理的細胞，3SM沒有任何效 果，長期的處理會導致細胞形態的短期改變，但很快回歸正常。與此相反，PTB敲低后迅速誘 導持久的神經元形態，3SM短暫處理3小時，可顯著提高轉分化效率，3SM的持續存在會產生 更強大的增強（圖6e)。這些數據表明3SM單獨處理沒有效果，但它與PTB敲低組合可高效的 誘導細胞命運改變。細胞增殖的顯著下降和S0X2及Nestin的負染表明該神經細胞重編程跳 過了干細胞階段是直接的細胞轉分化。值得注意的是如果我們將建立的策略應用與鼠源細 胞會導致細胞的快速死亡，說明了人和鼠的細胞存在著顯著的差別。
[0158] 第二個人源細胞特異的障礙物控制神經細胞成熟
[0159]我們還發現PTB敲除/3SM處理得到的神經元細胞缺乏成熟細胞特異的標志物，比 如MAP2、NF、NeuN等，暗示得到的神經細胞被停滯在神經細胞的早期階段（圖2a和圖7a)。與 預測相同，我們不能檢測到任何神經細胞的活性，比如細胞膜去極化后的鈣火花以及動作 電位。即使培養更長的時間，細胞也很難成熟。這些數據提示存在第二個障礙物來調控神經 細胞成熟，而且這個障礙物在鼠成纖維細胞轉分化過程中主動被移除 [28]，但是在人源細胞 中難以去除[28]。
[0160]為了尋找這個潛在的障礙物，我們進行了 RNA-seq分析。我們注意到了大量REST的 靶標基因被激活，但是，與MEF細胞不同，我們發現PTB的神經同源蛋白nPTB維持在高水平的 表達狀態（圖7b)。我們假設nPTB的表達與調控可能是人源細胞和鼠源細胞在轉分化過程中 的關鍵區別。為了驗證這個假說，我們在MEF和HAF轉分化過程中監測了PTB敲除后的nPTB表 達情況，我們發現nPTB在HAF分化為神經元類似細胞的過程中持續高表達（圖2b，c )，這提示 nPTB可能是人與鼠之間的關鍵區別。
[0161] 通過連續的敲低PTB/nPTB來克服兩種屏障(HAF細胞通過連續地敲低PTB和nPTB產 生功能神經元）
[0162] 感染四種經過驗證的針對nPTB的慢病毒shRNA構建可誘導敲低的細胞系（圖7c， d)〇 將含有如下革巴序列（gaagagaggatctgacgaacta，taagaaagacagcgctctaata， ttttaagaaacctggatccaaa，和 cgaggaagcagctattactatg)的pTRIPZ 重組載體利用 psPAX2和 PMD.2G質粒在293T細胞中包裝成慢病毒，然后感染人成纖維細胞得到可誘導敲低nPTB的細 胞系。結果顯示，PTB和nPTB在MEFs和HAFs中被同時敲除會導致細胞死亡，表明一個連續的 過程對于神經元的分化是很重要的，盡管在小鼠和人的細胞中存在時間上的差異。
[0163] 先敲低PTB，隨后使用潮霉素篩選3天，然后通過在不同時間點添加強力霉素來敲 除nPTB (由shnPTB表達模式中的REP表達表明的）（圖2d)。
[0164] 結果顯示，在不同的培養基中培養PTB敲低的細胞2天或者更長時間后(此時細胞 已經轉分化成具有神經細胞形態的初始神經細胞，但是未成熟），nPTB敲低的細胞中產生了 健康的MAP2陽性（14天時染色）的細胞（圖2e)。產生的神經元類似細胞在培養3個月時依然 保持健康，4個月時也是健康的。
[0165]接下來確定通過連續的敲低PTB和nPTB得到的神經元類似細胞是否具有神經元特 異的細胞膜特性。在強力霉素處理4周后與帶有GFP標簽的神經膠質細胞共培養2周后，檢測 快速活化和失活的內部鈉離子電流信號和外部鉀離子電流信號（圖2f)。鈉離子電流信號可 以被電壓門控的鈉離子通道特異的抑制劑:河豚毒素(TTX)封閉，洗除抑制劑后可以被部分 的解除抑制，表明這是一個主動結合，被動解離的過程（圖2f)。通過電流注入，可以觀察到 反復的電位活動（圖2g)。細胞同樣也表達功能性GABAA受體，依賴于GABA的刺激，這個過程 可以被苦毒素(PiTX)特異性抑制，苦毒素是一種GABAA受體特異性的抑制劑（圖2h)。還檢測 到不同振幅和頻率的自發性突觸后電流，它可以被興奮型(NBQX+APV)和抑制型(NBQX+APV+ PiTX)受體的抑制劑連續的封閉（圖2i-k)。總的來說，這些數據證明了在神經膠質細胞存在 時，通過連續性PTB和nPTB敲低的HAFs的誘導的神經元細胞是具有功能的。
[0166] 在神經元成熟過程中nPTB調節BRN2
[0167] 以上數據表明nPTB的敲除足以克服神經元成熟障礙，預示著一個新的調節途徑的 激活。為了了解其內在機制，我們在人類細胞中檢測了之前已經被證明的，在產生功能神經 元中重要調節因子的表達。實驗表明，除了BRN2之外，在HAF中，這些基因在敲低PTB后與這 些基因成為REST靶標的效應一致（圖8a)。而BRN2是一個在PTB敲低的HAF細胞中仍然被抑制 的皮質特異性轉錄因子 [37](圖3a)。值得注意的是，依次的敲低PTB和nPTB后有效的誘導了 BRN2的表達（圖3b)。
[0168] 之后我們確認了激活的BRN2在神經元成熟過程中的潛在促進作用。首先我們在 PTB敲低的同時表達不同的轉錄調節因子，發現BRN2的存在對于MAP2的表達和引起Ca2+的 內流是非常必要的（圖8b)。之后我們在一個穩定的HAF細胞系中構建了一個可誘導的多順 反子的質粒來同時敲低PTB和高表達BRN2(圖3c)。強力霉素處理后誘導PTB的迅速敲低和 BRN2逐漸的表達，處理兩周之后，我們檢測到多種成熟神經元的表面標記，包括MAP2，NCAM， NCAM，vGLUTl 和NeuN(圖 3c)。
[0169] 為了證明這些神經元的功能性，我們利用培養一周后的帶有GFP標記的神經膠質 細胞來記錄TTX敏感的鈉通道電流(圖3d)，電流引起的持續的動作電位，偶然的自發動作電 位，和功能性的AMPA和NMDA電流通過特殊的抑制物來區分(圖3g)。在帶有GFP標記的神經膠 質細胞培養3到4周后（圖3h)，我們檢測了可變幅度和頻率的自發突觸活動（圖3i-k)。通過 連續的敲低PTB和nPTB誘導或通過敲低PTB和BRN2過表達誘導而成的神經元在一些重要的 電生理特性方面具有相似性(Supplementary Tablel)。綜上，這些數據表明PTB敲低之后再 過表達BRN2對HAF轉分化為功能性的神經元是足夠的。
[0170] BRN2對hNPC分化必不可少
[0171]我們接下來希望研究建立在不同生理條件背景下，BRN2在神經元成熟過程中的功 能。也就是，通過去除培養基中成纖維細胞生長因子，將人源的神經前體細胞(hNPCs)分化 成大腦皮層神經元[38]。這些1^?〇8會表達特異的神經元干細胞標記，例如11681：；[11，3012和 BRN2(圖9a)。通過將BRN2敲除，我們發現，早期神經元分化事件不受影響，如Tujl的正常表 達（圖4a);而更多的成熟神經元相關的標記-MAP2,其表達量則嚴重的受到影響（圖4b和圖 9b，c)。在BRN2敲除的hNPCs細胞中，內部Na+流很少能被檢測到（圖9d)。這些數據表明BRN2 對于NPC分化形成功能性神經元是必須的。
[0172] BRN2激活神經元特異的miRNAs
[0173] 為了解BRN2如何介導神經元的成熟，我們進一步利用hNPC系統，收集hNPC分化前 后的樣品，使用2種相互獨立的BRN2抗體(抗體C-20和抗體B-2)進行ChIP-seq(圖9f，g)。在 3987個基因中，我們檢測到了大約5000個BRN2結合峰。利用G0注釋分析所有表達基因，表明 BRN2調節大部分在神經發生和成熟過程中至關重要的基因（圖9h，i)。
[0174] 在BRN2所有的靶基因中，我們注意到了 BRN2直接結合在20號染色體的MIR124-3基 因和5號染色體的MIR9-2基因上（圖4d)。以MIR124-3基因位點作為對照，在hNPC分化前和分 化后，BRN2的結合能力都沒有改變，而BRN2在MIR9-2基因位點上的多重結合位點只有在 hNPC分化后被檢測到了（圖4d)。我們進一步通過CHIP和qPCR證實了這一結果（圖4e)。在PTB 敲除處理的HAFs中，通過以miR-21作為負對照，檢測成熟的miR-124和miR-9,在BRN2過表達 的第6天，我們再次檢測到了miR-9的誘導，而非miR-124;然而將BRN2表達延長到第12天，2 種miRNAs都被誘導（圖4f)。這些數據表明，在hNPCs中BRN2結合和調節MIR124基因的表達； 但是最適度的miR-124轉錄水平不足以誘發神經元的分化。相比之下，BRN2調節的miR-9似 乎驅動了神經元的分化，miR-9-2前體在E12.5和E13.5之間的時期被大量誘導相一致，這個 時期BRN2基因在小鼠大腦中開始表達 [39_41]。
[0175] 我們也證實了在PTB敲除和nPTB敲除處理的HAFs中BRN2能夠結合MIR9和MIR124基 因位點（圖4g)。在應答PTB和nPTB相繼敲除的HAFs中，MIR9被持續的誘導（圖4h)。相比之下， MIR124在應答PTB敲除的HAFs中被高度誘導；但是由于未知的原因，在應答PTB敲除和nPTB 敲除處理的HAFs中，MIR124被抑制表達（圖4h)。無論如何，這些數據表明MIR124的誘導可能 作用于神經元的轉分化，而隨后的MIR9的激活可能作用誘導的類神經元細胞到功能性的神 經元過程。
[0176] nPTB-BRN2-miR9環對神經細胞成熟的作用
[0177] BRN2能夠誘導產生miR-9為神經細胞成熟提供了新的研究方向，同時我們注意到 nPTB的3'非翻譯區存在典型的配對區可能是miR-9和miR-124的靶定位點，即mRNA的種子 序列（圖5a)。接著我們又進一步探索這兩個在神經系特異性表達的miRNAs是否能減少內源 性nPTB的表達。前期研究表明miR-124能有效地抑制PTB表達并且能在一定程度上降低nPTB 的表達量[42]。在PTB抑制表達的HAFs中，我們發現miR-9和miR-124都能在mRNA和蛋白水平 使nPTB水平下調（圖5b，c)。正如我們所預測，shBRN2抑制了nPTB的下調，同時BRN2過表達減 少了PTB敲除處理HAFs中nPTB表達減少（圖10a，b)。為進一步探索miR-9和miR-124在對nPTB 轉錄后調節的作用，在人神經前體細胞中我們特異性表達了miR-9和miR-124的海綿體，發 現nPTB的表達水平顯著提高（圖5d，e)。在HAF誘導的神經細胞中，這些特異的海綿體同樣能 夠阻止nPTB基因的下調并且減少NeuN的表達，這與我們早期的研究結果，在分化的人神經 前體細胞中miR-9，miR-124對于維持神經細胞的分裂能力是必要的 [43,44]。
[0178] 我們又接著證實了nPTB3'非翻譯區的預測靶定位點，我們構建了一個有nPTB3'非 翻譯區的熒光素酶報告基因載體與miRNAs同時轉染，發現miR-9和miR-124兩者都可以抑制 報告載體熒光蛋白的表達，同時在預測的靶定位點特異性突變能削弱miRNA對報告基因表 達的下調（圖5g)。在nPTB 3'非翻譯區預測的兩個miR-124靶定位點中，第一個預測位點序 列的突變能夠更有效地阻止對于miR-124導致的nPTB下調（圖5g)。雖然miR-124過表達或抑 制表達能影響nPTB的表達量，但在生理條件下BRN2-miR-9-nPTB對神經細胞的成熟至關重 要，因為由shPTB誘導的未成熟的神經細胞miR-124表達量較高。為進一步說明nPTB表達量 的減少對于神經細胞的成熟至關重要，我們構建了由shPTB、shnPTB誘導的由HAFs轉分化的 shRNA-抵抗的神經細胞系，此細胞系中MAP2的表達量降低到本底水平，更重要的是，NeuN的 表達完全受到抑制（圖5h)。
[0179] 綜合分析，圖3-5表明在PTB表達降低的HAFs在誘導神經細胞成熟的過程中存在一 個未知的環路，在分子環中，nPTB下調直接或間接誘導BRN2活化;被激活的BRN2結合并誘導 miR-9轉錄，最終表達量增加的miR-9在轉錄后減少nPTB。因此，如同PTB-REST-miR-124環路 對神經細胞的轉分化的作用，nPTB-BRN2-miR-9環路一旦被激活，在神經細胞的成熟中自我 維持。
[0180] 順序調節環路的生理關聯性
[0181 ]神經分化通過依次表達轉錄和轉錄后的調節因子受到嚴格的控制，我們已闡明了 兩個獨立但高度交織的環路與體內的神經發生程序是一致的。眾所周知，PTB維持神經干細 胞庫，缺失PTB導致小鼠過早的神經分化和神經干細胞的大量缺失 [45]118敲除的效果在很 大程度上與REST敲除小鼠表型相似，這表明它們在神經元誘導中作用于相同的通路。PTB和 REST在非神經細胞中組成型表達，很可能在發育的神經元中它們的失活通過誘導MIR 124 的表達觸發[42]。我們以前的工作揭示了包括PTB，miR-124和REST的雙負反饋回路 [28]，一旦 觸發，該回路將自我維持，并拆除REST，產生大量的神經元特異性基因來驅動神經發生。重 要的是，miR-124誘導的REST拆解從根本上與REST基因敲除小鼠不同，殘留量的REST似乎是 確保分化的神經元的健康狀態所必須的 [46]。
[0182] 在神經發育的早期階段，由于nPTB包含一個PTB抑制外顯子，PTB失活的一個關鍵 功能是nPTB的去阻遏[34' 42'47'35]。我們的新數據顯示，!^1?-124負性調節#了8，這可能會抵消 PTB敲除誘導的nPTB表達，因而從不成熟到成熟的神經元維持相對穩定nPTB表達。瞬時nPTB 表達與E13.5誘導的BRN2和MIR-9是一致的，然而，我們一直不清楚nPTB如何在神經發育過 程中被關閉[39, 4Q]。我們現在建立由三個組分形成的一個前饋回路，并且在成熟的神經元 中，nPTB逐漸關閉是該回路完全活化的基礎 [36,48]。仍然需要確定人類大腦中激發此通路的 發育觸發器.
[0183] 小鼠和人類神經程序之間的主要區別
[0184] 小鼠一直是人類神經學和神經退行性疾病研究的主要模型。然而，小鼠和人在進 化上存在很多方面不同。其中的一個基本差異是大腦皮層擴張 [49]，大腦皮層擴張主要是由 于胚胎大腦皮層發育期間神經祖細胞的增加。嚴格控制神經元的轉分化和成熟環路，確保 在大腦發育過程中以連續的方式程序性開關，如同時敲除PTB和nPTB產生了致死的表型。值 得注意的是，在小鼠細胞優化的神經元轉分化程序，在人的細胞中不足以產生有功能的神 經元，而在人類細胞中優化的轉分化程序將導致小鼠細胞致死，這表明來自不同哺乳動物 的細胞可能具有其自己的內置的定時機制。
[0185]小鼠和人細胞之間，由PTB和nPTB介導的環路為基礎的分離定時機制似乎在小鼠 細胞中自動連接，但在人類細胞中需要分別被激活。雖然我們還處于理解這些具體種類的 機制的早期階段，一個潛在的機制可能是由于小鼠和人類之間用于誘導的miR-124和miR-9 表達的不同調節程序。miR-124被認為在神經發生過程中逐漸被誘導，而miR-9在神經元成 熟中被誘導表達 [25]。因此可以想象，起始誘導表達的miR-124可能在小鼠細胞中負責下調 PTB和nPTB，但在人類細胞主要下調PTB。即使在小鼠細胞，miR-124很可能靶向PTB比nPTB更 高效的，當同時失活PTB和nPTB將嚴重危及分化的神經元的生存力。
[0186] BRN2表達調控是神經元成熟的一個明顯的貢獻者，但其他神經元特異性轉錄因 子，如NEUR0D1也可能參與其中[14]。其中一個成熟神經元特異的轉錄因子將進一步促進 miR-124的表達，在神經發生的后期階段與BRN2誘導的miR-9-起調節神經元成熟。因此，根 據實驗測定的不同組合的轉錄因子可能都能夠部分的激活神經元轉分化和成熟過程，但是 不能夠在所有的細胞中激活這些過程。如人細胞的神經元重編程似乎被一些關鍵的 gatekeepers嚴格控制，包括兩個在本研究中闡明的環路，神經程序的這種機會性活化因 而導致人類細胞低的轉分化效率。
[0187] PTB和nPTB調芐基因表達的機制
[0188] PTB和nPTB是公認的剪切調節因子[34'36'42'47' 48'5()]，盡管它們在1?祖結合中具有相 似的生物化學特性，在調節剪切中具有相似的生物學功能，但在基因敲除小鼠的研究中發 現它們在發育過程具有非冗余的功能[36, 45,48]。我們最近的研究表明，除了調節剪切的功能 之外，PTB也結合在許多基因的3'非翻譯區，或者與miRNA競爭結合靶位點，或者改變RNA的 二級結構促進miRNA的靶向結合，從而雙向調節miRNA的功能 [28]。我們的早期工作證實PTB 的這些新功能很大程度上歸功于神經元轉分化的過程中miR-124介導的REST復合體的拆 除[28]。
[0189] 在神經元成熟中，我們發現調節nPTB表達的重要功能，之前的研究已闡明nPTB在 調節神經元特異性可變剪接事件中的作用，進而產生與成熟神經元相關的各種表型 [34 '36'48]。我們證明了通過活化nPTB-BRN2-miR-9環路，nPTB下調在驅動神經元成熟中的關鍵 作用，在這個環路中，BRN2可能從激活MIR9轉錄開始，誘導的miR-9反過來通過結合在nPTB 的3'端非編碼區，從而使nPTB失活，但目前還不清楚nPTB的下調如何導致BRN2的活化。接下 來的研究中，我們將繼續探討nPTB下調導致的BRN2活化的途徑，無論是直接通過一個轉錄 去阻遏機制或間接通過誘導成熟神經元的其它基因的剪接事件。
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【主權項】
1. 一種誘導神經細胞成熟的方法，包括如下步驟:激活未成熟的神經細胞中的nPTB-BRN2-miR-9信號通路； 所述nPTB-BRN2-miR-9信號通路為:nPTB的下調誘導BRN2活化;被激活的BRN2上調miR-9;miR-9 下調 nPTB。2. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于:所述未成熟的神經細胞為具有如下至少一 種特征的細胞： (1) 具備神經元細胞類似的細長突觸； (2) 表達神經元細胞早期標志物Tujl，不表達成熟神經元相關標志物； (3) 不具備神經細胞特異的動作電位和鈉離子電流。3. 根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述激活未成熟的神經細胞中的nPTB-BRN2-miR-9信號通路的方法為如下至少一種： (1) 下調nPTB; (2) 活化 BRN2; (3) 上調 miR-9。4. 根據權利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述下調nPTB是指敲低或敲除 nPTB基因。5. 根據權利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于:所述敲低或敲除nPTB基因時使用 的質粒為如任一種： (1) 將序列1所示DNA片段插入ptripz質粒的EcoRI和XhoI位點中間，即得shnptb質粒1; (2) 將序列2所示DNA片段插入ptripz質粒的EcoRI和XhoI位點中間，即得shnptb質粒2; (3) 將序列3所示DNA片段插入ptripz質粒的EcoRI和XhoI位點中間，即得shnptb質粒3; (4) 將序列4所示DNA片段插入ptripz質粒的EcoRI和XhoI位點中間，即得shnptb質粒4; (5) shnptb質粒I、shnptb質粒2、shnptb質粒3和shnptb質粒4的混合物。6. 根據權利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：所述活化BRN2的方法為過表達 BRN2〇7. 根據權利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于:所述過表達BRN2的過程中使用如 下重組載體:在骨架載體PTRIPZ的Xho I至EcoR 1位點間插入序列5所示DNA，得到中間載 體;再向中間載體的Agel至Clal位點間用BRN2的編碼基因取代RFP，即得重組載體。8. -種將人體細胞重編程得到成熟神經細胞的方法，包括如下步驟： (1) 將人體細胞重編程得到未成熟的神經細胞； (2) 按照權利要求1-7中任一所述方法，將所述未成熟的神經細胞轉變為成熟神經細 胞。9. 根據權利要求8所述的方法，其特征在于:所述將人體細胞重編程得到未成熟的神經 細胞的方法為:下調所述人體細胞中的PTB基因。10. 根據權利要求8或9所述的方法，其特征在于:所述下調PTB是指敲低或敲除PTB基 因。11. 根據權利要求8-10中任一所述的方法，其特征在于:所述人體細胞為非神經細胞， 具體為人成纖維細胞。12. -種將人成纖維細胞重編程得到成熟神經細胞的方法，包括如下步驟： (1) 敲低/敲除人成纖維細胞中的PTB基因，培養，得到未成熟的神經細胞； (2) 再將步驟（1)所得未成熟的神經細胞中的nPTB基因敲低/敲除，培養，得到成熟的神 經細胞。13. 根據權利要求12所述的方法，其特征在于:所述步驟（1)中敲低/敲除人成纖維細胞 中的PTB基因中使用如下（1)或（2)所示重組載體：（1)在骨架載體pTRIPZ的Xho I至EcoR 1 位點間插入序列5所示DNA，得到中間載體;再向中間載體的Agel至Clal位點間用BRN2的編 碼基因取代RFP，即得重組載體；（2)在骨架載體plko. 1-hygromycin的AgeI至EcoRI位點間 插入序列5所示DNA得到的重組載體； 所述步驟(2)中敲低/敲除nPTB基因時使用的質粒為如下任一所示： (1) 將序列1所示DNA片段插入ptripz質粒的EcoRI和XhoI位點中間，即得shnptb質粒1; (2) 將序列2所示DNA片段插入ptripz質粒的EcoRI和XhoI位點中間，即得shnptb質粒2; (3) 將序列3所示DNA片段插入ptripz質粒的EcoRI和XhoI位點中間，即得shnptb質粒3; (4) 將序列4所示DNA片段插入ptripz質粒的EcoRI和XhoI位點中間，即得shnptb質粒4; (5) shnptb質粒I、shnptb質粒2、shnptb質粒3和shnptb質粒4的混合物。14. 一種將人成纖維細胞重編程得到成熟神經細胞的方法，為如下（1)或(2)所示： (1) 敲低/敲除人成纖維細胞中的PTB基因，培養，得到未成熟的神經細胞;再在未成熟 的神經細胞中過表達BRN2，培養，得到成熟的神經細胞； (2) 在人成纖維細胞中同時敲低/敲除PTB基因和過表達BRN2,得到成熟的神經細胞。15. 根據權利要求14所述的方法，其特征在于:所述方法（1)中，敲低/敲除人成纖維細 胞中的PTB基因的過程中使用如下重組載體:在骨架載體plko. Ι-hygromycin的Age I至EcoR I位點間插入序列5所示DNA得到的重組載體;所述方法（1)中，過表達BRN2的過程中使用如 下重組載體:在骨架載體PTRIPZ的Xho I至EcoR 1位點間插入序列5所示DNA，得到中間載 體;再向中間載體的Agel至Clal位點間用BRN2的編碼基因取代RFP，即得重組載體； 所述方法(2)中使用如下重組載體:在骨架載體pTRIPZ的Xho I至EcoR 1位點間插入序 列5所示DNA，得到中間載體；再向中間載體的Age 1至Cla 1位點間用BRN2的編碼基因取代 RFP，即得重組載體。16. 根據權利要求1-15中任一所述的方法，其特征在于:在細胞培養過程中添加權利要 求19所述的產品。17. 將人體細胞重編程得到成熟神經細胞過程中使用的產品，為如下(A)或(B): (A) 如下任一種敲低或敲除nPTB基因時使用的質粒： (1) 將序列1所示DNA片段插入ptripz質粒的EcoRI和XhoI位點中間，即得shnptb質粒1; (2) 將序列2所示DNA片段插入ptripz質粒的EcoRI和XhoI位點中間，即得shnptb質粒2; (3) 將序列3所示DNA片段插入ptripz質粒的EcoRI和XhoI位點中間，即得shnptb質粒3; (4) 將序列4所示DNA片段插入ptripz質粒的EcoRI和XhoI位點中間，即得shnptb質粒4; (5) shnptb質粒1、shnptb質粒2、shnptb質粒3和shnptb質粒4的混合物； (B) 敲低/敲除PTB基因和過表達BRN2時使用的質粒： 在骨架載體PTRIPZ的Xho I至EcoR 1位點間插入序列5所示DNA，得到中間載體;再向中 間載體的Agel至Clal位點間用BRN2的編碼基因取代RFP，即得重組質粒。18. 如下任一所述應用： (1) nPTB-BRN2-miR-9信號通路在誘導神經細胞成熟中的應用，或nPTB-BRN2-miR-9信 號通路作為靶標在制備誘導神經細胞成熟的產品中的應用； (2) 激活nPTB-BRN2-miR-9信號通路的物質在誘導神經細胞成熟中的應用，或激活 nPTB-BRN2-miR-9信號通路的物質在制備誘導神經細胞成熟的產品中的應用； (3) 下調nPTB的物質在誘導神經細胞成熟中的應用，或下調nPTB的物質在制備誘導神 經細胞成熟中的應用； (4) 活化BRN2的物質在誘導神經細胞成熟中的應用，或活化BRN2的物質在制備誘導神 經細胞成熟中的應用； (5) 上調miR-9的物質在誘導神經細胞成熟中的應用，或上調miR-9的物質在制備誘導 神經細胞成熟中的應用； (6) 下調nPTB的物質在誘導BRN2活化中的應用，或下調nPTB的物質在制備誘導BRN2活 化的產品中的應用； (7) 被激活的BRN2在誘導miR-9轉錄中的應用，激活BRN2的物質在誘導miR-9轉錄中的 應用，或激活BRN2的物質在制備誘導miR-9轉錄的產品中的應用； (8) miR-9在下調nPTB中的應用，或miR-9在制備下調nPTB的產品中的應用。19. 一種用于提高體細胞向神經細胞轉分化效率的產品，為如下至少一種； (DSB431542； (2) CHIR99021； (3) Db-cAMP； (4) SB431542、CHIR99021和Db-cAMP; (5) shPTB和SB431542; (6) shPTB和CHIR99021; (7) shPTB和Db-cAMP; (8) shPTB和SB431542、CHIR99021和Db-cAMP; shPTB按照如下方法構建:在骨架載體plko.l-hygromycin的AgeI至EcoRI位點間插入 序列5所示DNA得到的重組載體shPTB。20. -種用于提高體細胞向神經細胞轉分化效率的方法，包括如下步驟:在由體細胞向 未成熟神經細胞轉分化過程中向使用的培養基中添加權利要求19所述的產品，和在由未成 熟神經細胞向成熟神經細胞轉化過程中向使用的培養基中添加權利要求19所述的產品。21. 權利要求1-16任一所述的方法、權利要求17所述的產品、權利要求18所述的應用、 權利要求19所述的產品或權利要求20所述的方法在治療神經類疾病中的應用。
【文檔編號】C12N5/0793GK105950557SQ201610298170
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年5月6日
【發明人】薛愿超, 付向東
【申請人】中國科學院生物物理研究所