一種靶向卵巢癌干細胞的抗腫瘤生物制劑的制作方法
【專利摘要】本發明首次公開了一種包含Lin28和Oct4的特異性siRNAs，能有效靶向卵巢癌干細胞而抑制卵巢癌進展的抗腫瘤生物制劑。Lin28和Oct4是多潛能干細胞markers，其兩者同時表達是進展期卵巢癌細胞去分化、預后不良的典型特征，代表了卵巢癌中的腫瘤干細胞亞群細胞。而同時沉默Lin28和Oct4能大大減弱卵巢癌細胞的生存能力，并誘導癌細胞凋亡。Lin28和Oct4的特異性siRNAs特異性靶向卵巢癌干細胞，抑制卵巢癌的進展。本發明提供了一種通過靶向卵巢癌干細胞抑制卵巢癌細胞生長和增殖的抗腫瘤生物制劑，具有重要的臨床意義和應用價值。
【專利說明】一種靶向卵巢癌干細胞的抗腫瘤生物制劑

【技術領域】
[0001] 本發明首次公開了一種利用RNAi干擾技術靶向卵巢癌中干細胞中Lin28和0ct4 的抗腫瘤生物制劑。Lin28和0ct4均為維持干細胞的關鍵多潛能因子，基因表達沉默后，腫 瘤干細胞趨向分化，從而降低自我更新和增殖能力，從而達到抑制腫瘤細胞的生長、轉移。 技術背景
[0002] Lin28是在線蟲的時段發育中發揮著關鍵作用、進化上高度保守的RNA結合蛋白。 Lin28具有調節基因表達的多重作用。它能阻斷miRNAlet-7的生物合成，也能調節其它 miRNA的表達。同時它也結合一群特異性mRNA，包括IGF-2, 0ct4以及細胞周期相關因子， 從而調節它們的表達。Lin28和0ct4在未分化的胚胎干細胞中高度表達，而隨著干細胞分 化而表達減少，提示Lin28和0ct4在維持干細胞而保持在未分化的多潛能狀態中起著關鍵 作用。
[0003] 卵巢癌是女性生殖系統常見的腫瘤，惡性程度高，由于早期癥狀不明顯而常常在 診斷時已經為晚期。我們利用高通量卵巢癌組織芯片研究發現：卵巢癌細胞中Lin28和 0ct4的同步表達與臨床分期明顯相關，顯示低分化狀態，預后不良。Lin28和0ct4是干細 胞內維持多分化潛能的分子，兩種分子都表達的亞群細胞可能代表了卵巢癌干細胞。Lin28 在組織中的表達的細胞和0ct4表達的細胞一致。用siRNA技術分別沉默兩個分子的表達， 對細胞的生存和凋亡沒有產生明顯的影響；但同時沉默兩個分子的表達，卵巢癌細胞的生 長增殖和存活能力顯著降低。這提示靶向卵巢癌干細胞的治療可能成為防治卵巢癌的新思 路。
[0004] 因此，我們提出了一種通過SiRNA沉默Lin28和0ct4的表達而靶向卵巢癌干細胞 而抑制卵巢癌進展的一種抗腫瘤生物制劑。


【發明內容】

[0005] 1.本發明公開了一種特異性沉默Lin28和0ct4的siRNAs抗腫瘤生物制劑，能特 異抑制卵巢癌中腫瘤干細胞而阻止卵巢癌的進展。
[0006] 2. s iLin28 為(ON-T A RGE Tp I u s SMA RTp ο o I，L-〇 1 8 4 I 1-〇 1)為 Dharmacon(Lafayette，CO, USA)產品在卵巢癌和畸胎瘤的細胞系中沉默0ct4的效率達 95%以上。
[0007] 3. si0ct4 (L-019591-00)為 Dharmacon (Lafayette，CO, USA)，該試劑包含特異的 針對0ct4的序列，在卵巢癌和畸胎瘤的細胞系中沉默0ct4的效率達95%以上。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0008] 圖1同時沉默Lin28和0ct4的表達顯著抑制卵巢癌細胞的生存和誘導細胞凋 亡。a :siLin8 和 si0ct4 抑制 Lin28 和 0ct4 的 mRNA 水平；b :siLin8 和 si0ct4 抑制 Lin28 和0ct4的蛋白水平；c，d :單獨抑制Lin28對細胞的生存和凋亡影響不明顯；e :同時沉默 Lin28和0ct4的表達顯著抑制卵巢癌細胞的生存和誘導細胞凋亡

【具體實施方式】
[0009] 在前期工作中，發明人發現siLin28和si0ct4同時轉染卵巢癌細胞，發現顯著地 抑制細胞的生長并誘導細胞的凋亡，而單獨siLin28和si0ct4分別轉染而并沒有相似的效 果。Lin28和0ct4是多潛能因子，是干細胞marker，因此Lin28和0ct4共同表達的細胞可 能為卵巢癌干細胞。同時抑制兩者的表達，導致癌干細胞不能維持其干性，或分化受阻，因 此抑制整個細胞群的增殖，并誘導細胞凋亡，因此，是一種極具潛力的靶向卵巢癌干細胞而 抑制卵巢癌進展的抗腫瘤生物制劑。
[0010] 實例抗腫瘤生物制劑抑制卵巢癌細胞的生長
[0011] 為了驗證該生物制劑對卵巢癌細胞的抑制生長和誘導凋亡效應，分別用不同的實 驗進行了驗證。具體實驗步驟如下：
[0012] I. siLin28 和 si0ct4 的轉染
[0013] 1)轉染前一天，在不包含抗生素的適量的培養基中接種卵巢癌細胞，轉染時細胞 的匯合度為30-50%。
[0014] 2)每一個轉染樣品都要按照如下的方法準備siRNA_Lipofectamine2000復合物。
[0015] 3)在適量的不包含血清的Opti-MEM I低血清培養基稀釋siLin28和si0ct4,輕 輕混勻。
[0016] 4)使用前輕輕混合Lipofectamine2000,然后稀釋適量的試劑到Opti-MEM I低血 清培養基，輕輕混勻后在室溫下孵育5分鐘。
[0017] 5)孵育5分鐘后，混合稀釋的siRNA和稀釋的Lipofectamine2000,輕輕混合,在 室溫下孵育20分鐘，復合物形成。
[0018] 6)將siRNA_Lipofectamine2000復合物加入到每一個包含細胞和培養基的孔中。 通過輕輕地前后搖動培養板混合。
[0019] 7) 37°C，C02培養箱孵育24-96小時，直到適合進行基因阻斷分析。
[0020] 8)結果分析：siLin28和si0ct4的轉染導致卵巢細胞株PA-I和IGROVl細胞中 1^1128和0(^4水平分別下調90%和80%以上。
[0021] 2.細胞活力檢測
[0022] 1)接種轉染siLin28/si0ct4和siCon的兩組細胞各3, 000細胞/孔于96-well 細胞培養板中，細胞液的終體積為lOOul，37度培養過夜。
[0023] 2)除去培基，加入 20ul/ 孔CellTiter-Blue? Reagent 試劑，振搖 10s，37 度孵育 l-4h。
[0024] 3)振搖 10s，檢測 560/590nm 吸光值。
[0025] 4)結果分析：轉染siLin28/si0ct4抗腫瘤生物制劑的實驗組的細胞生存活力在 PA-I和IGROVl細胞分別下調?65和50%。
[0026] 3.細胞凋亡分析
[0027] 1)接種轉染siLin28/si0ct4和siCon的兩組細胞各3, 000細胞/孔于96-well 細胞培養板中，細胞液的終體積為IOOul，37度培養48h。
[0028] 2)力口 100 μ I Apo-ONE? Caspase-3/7 試劑，繼續孵育 l-4h。
[0029] 3)振搖 30min_lh。
[0030] 4)485±20nm波長檢測吸光值。
[0031] 5)結果分析：轉染siLin28/si0ct4的細胞凋亡率是對照組的4-6倍。
[0032] 以上研究表明，siLin28/si0ct4能有效抑制卵巢癌細胞的增殖和誘導細胞凋亡， Lin28和si0ct4是干細胞marker，其共同表達的細胞可能為卵巢癌干細胞，靶向卵巢癌干 細胞有效抑制卵巢癌細胞的增殖并誘導細胞凋亡，成為一種極有潛力的新的抗腫瘤生物制 劑。
【權利要求】
1. 本發明公開了一種靶向卵巢癌干細胞的小分子RNA(siRNA)抗腫瘤生物制劑，其成 分為siLin28和si0ct4的混合物。Lin28和0ct4是多潛能干細胞分子marker,兩者同時 表達是進展期卵巢癌細胞去分化、預后不良的典型特征，代表了卵巢癌中的腫瘤干細胞亞 群細胞。siLin28和si0ct4特異性同時沉默Lin28和0ct4大大減弱卵巢癌干細胞的生存 能力，并誘導卵巢癌細胞凋亡。本發明提供了一種通過靶向卵巢癌干細胞，有效抑制卵巢癌 進展的抗腫瘤生物制劑，具有重要的臨床意義和應用價值。
2. 按照權利要求1中所述，其特征在于：siLin28為（ON-TARGET plus SMARTpool， L-018411-01)為Dharmacon(Lafayette，CO, USA)產品在卵巢癌和畸胎瘤的細胞系中沉默 Lin28的效率達95%以上。
3. 按照權利要求1中所述，其特征在：si0ct4(L-019591-00)為 Dharmacon (Lafayette, CO, USA),該試劑包含特異的針對0ct4的序列，在卵巢癌和畸胎瘤 的細胞系中沉默0ct4的效率達95%以上。
4. 按照權利要求1中所述，其特征在于：采用Lipofectamine2000(Invitrogen)作為 轉染試劑，將siRNA導入卵巢癌干細胞。
5. 按照權利要求1中所述，其特征在于：用siRNA沉默Lin28和0ct4靶向卵巢癌干細 胞而抑制卵巢癌細胞生長和增殖。
【文檔編號】A61K48/00GK104225616SQ201310226198
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2013年6月8日 優先權日:2013年6月8日
【發明者】彭淑平, 黃英群, 帥詞俊, 牛蔓, 韋娉嬪 申請人:中南大學