一種基于雙抗及細胞密度的高特異性高純度的腫瘤細胞分選方法
【專利摘要】本發明公開了一種基于雙抗及細胞密度的高特異性高純度的腫瘤細胞分選方法，該方法包括如下步驟：在粒徑為30?100μm、密度為1.16?3g/mL的羥基微球表面化學鍵合上一層20?100nm厚的明膠，得到包裹明膠的羥基微球；在包裹明膠的羥基微球表面修飾上抗體anti?EpCAM和anti?CD146；將病人血樣與修飾抗體的羥基微球混勻孵育得混合樣品，滴加到1.15?1.20g/mL細胞分離液的上層，離心分離后，捕獲住腫瘤細胞的微球沉積在細胞分離液底部；將捕獲住腫瘤細胞的微球使用明膠酶降解微球表面明膠，釋放腫瘤細胞。本發明分選效率及純度更高，并且分選出來的腫瘤細胞能夠被釋放及培養。
【專利說明】一種基于雙抗及細胞密度的高特異性高純度的腫瘤細胞分選方法
[0001]
技術領域
[0002]本發明涉及腫瘤細胞分選方法，具體涉及一種基于雙抗及細胞密度的高特異性高純度的腫瘤細胞分選方法。
【背景技術】
[0003]循環腫瘤細胞(Circulating Tumor Cells, CTCs)是從原發腫瘤組織上脫離下來進入到腫瘤患者外周血中的腫瘤細胞，對于腫瘤的早期診斷和治療評估有很重要的臨床研究價值。鑒于實體腫瘤患者因癌癥導致死亡的原因多數是因腫瘤轉移這個事實，以及血液循環系統中監測到CTCs將預示著腫瘤向遠處轉移的可能性，早期的循環腫瘤細胞診斷在人體腫瘤活組織檢查和判斷疾病進展中起著關鍵作用。然而，血液循環系統中的CTCs含量是極低的，轉移癌患者體內每毫升血液中只有幾個到幾百個CTCs，卻存在著19個干擾血細胞，因此對于CTCs的富集分選是一個非常大的技術挑戰。CTCs的分選效果(分選效率以及分選純度)直接影響了其對病人腫瘤診斷的預判以及后續的基因檢測等，因此高的分選靈敏度、高的分選純度、高通量以及高的CTCs活性的細胞分選成為近年來的研究熱點和難點。
[0004]近年來，越來越多的靈敏的、具有特異性的CTCs的捕獲與鑒定技術已經逐漸發展成熟。目前，CTCs的分選機理最常用的是利用特異性抗體對其表面表達的腫瘤標記物，如上皮細胞粘附因子(epithelial cell adhes1n molecule, EpCAM)，進行特異性的抗原-抗體吸附達到細胞分選的目的。這些特異性識別方法均依賴于CTCs表面的EpCAM抗原表達的情況，然而研究發現，腫瘤細胞在迀移過程中會出現上皮-間質轉換(epithel ia-mesenchymal transit1n, EMT)過程，在這個過程中CTCs表面的EpCAM或者CK抗原的表達會降低，而這些EpCAM陰性的CTCs可以揭示腫瘤轉移的機理，而這些很重要的CTCs將會被基于ant1-EpCAM抗體的捕獲方法所遺失，導致了較低的CTC捕獲效率。其次應用較為廣泛的是利用CTCs與其他血細胞的物理特性差異進行非特異性的分選，如細胞尺寸、密度和形變等的差異性。其中密度梯度離心法，因其成本低廉和操作簡單的優勢而被應用在患者外周血CTCs的探測中。根據不同種類的細胞密度不同(其中CTCs密度范圍為1.06-1.llg/mL，紅細胞密度范圍為1.10-1.15g/mL，白細胞密度范圍為1.07-1.09g/mL)，利用密度梯度離心法將細胞按照不同密度分布在離心液中。然而這種方法只能去除血樣中大量的紅細胞，由于CTCs與白細胞的密度有交叉部分，在離心分選過程中，CTCs可能會與白細胞共沉積，導致純度、靈敏度降低。
[0005]因此本發明在抗原-抗體特異性識別技術和密度梯度離心技術的基礎上引入了一種新的更有效的基于密度大小的細胞分選技術。本發明添加了一種新的腫瘤標記物CD146，來加強CTCs的捕獲。作為EMT的誘導因子，CD146跟腫瘤細胞表面EpCAM的表達呈互補關系，故使用ant1-CD146抗體可以捕獲到EpCAM陰性表達的CTCs，尤其已經經歷過EMT過程的CTCs。本發明通過特異性識別選擇性的增大CTC密度，從而擴大其與血細胞密度的差異性，使用一種優化的特定密度的細胞分離液對處理過的血樣進行分層，提高CTC分選純度。

【發明內容】

[0006]本發明的目的在于克服現有技術存在的缺點與不足，提供一種基于雙抗及細胞密度的高特異性高純度的腫瘤細胞分選方法，該方法基于抗原-抗體特異性識別技術和密度梯度離心技術，其分選效率及純度更高，并且分選出來的腫瘤細胞能夠被釋放及培養。
[0007]為了達到以上目的，本發明采用以下技術方案:
一種基于雙抗及細胞密度的高特異性高純度的腫瘤細胞分選方法，包括如下步驟:
(I)配制密度為1.15-1.20g/mL的細胞分離液。所述的細胞分離液包括Ficoll或Percoll細胞分離液。
[0008](2)在粒徑為30-100μπι、密度為1.16_3g/mL的羥基微球表面化學鍵合上一層20-1OOnm厚的明膠，得到包裹明膠的羥基微球。所述的羥基微球包括二氧化硅微球、聚甲基丙烯酸甲酯PMMA微球。
[0009](3)在包裹明膠的羥基微球表面修飾上具有特異性免疫識別腫瘤細胞功能的抗體ant 1-EpCAM和ant 1-⑶146，得到雙抗體修飾的羥基微球。
[0010](4)將病人血樣與雙抗體修飾的羥基微球混勻孵育(使微球表面修飾的抗體與腫瘤細胞表面抗原特異性結合以捕獲住腫瘤細胞)得混合樣品，將混合樣品緩慢滴加到1.15-1.20g/mL細胞分離液的上層，離心分離后，上述微球處理過的血樣被分層，其中所有的血細胞懸浮在細胞分離液上方，所有的捕獲住腫瘤細胞的微球(CTC-beads)沉積在細胞分離液底部，從而將外周血樣中的CTC-beads完全從周圍的血細胞中分離出來，得到非常高的CTC-beads純度。
[0011](5)將收集的捕獲住腫瘤細胞的微球使用明膠酶降解微球表面明膠，釋放腫瘤細胞。
[0012]步驟(I)中所述的Percoll細胞分離液的密度優選為1.15g/mL。從美國Sigma公司購買的Percoll原液的密度是1.13g/mL，通過使用1.316g/mL的蔗糖溶液以體積比1:9的比例濃縮密度為1.13g/mL的Percoll原液得到密度為1.15g/mL的Percoll細胞分離液。
[0013]步驟(2)中所述的羥基微球優選為粒徑為50μπι、密度1.2g/mL的二氧化硅微球。
[0014]所述的羥基微球為二氧化硅微球時，步驟(2)優選包括如下步驟:I)將二氧化硅微球加入到無水乙醇中，加熱升溫至60°C后滴入3-氨基丙基三乙氧基硅烷(3-Aminopropyltriethoxysilane, APS)磁力攪拌2_4h，然后經過無水乙醇、去離子水離心沖洗后得到了氨基修飾的二氧化硅微球(NH2-S12)。2)將NH2-S1道新分散到去離子水中，加入戊二醛，室溫下攪拌5-20h，然后經過去離子水離心沖洗后得到了醛基修飾的二氧化硅微球(CHO-S12)。3)將CHO-S12再次分散到明膠溶液，室溫下攪拌3-12h后用去離子水離心洗滌去除未反應完全的明膠溶液得到表面均勻包裹上一層厚明膠的二氧化硅微球(S12OGeD0
[0015]步驟(3)優選包括如下步驟:I)使用EDC/NHS對包裹明膠的羥基微球表面羧基進行活化30_120min，使用磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffer Solut1n, PBS)離心清洗3次。2)將I)處理的微球浸入到鏈霉親和素(streptavidin，SA)溶液中，反應40_120min在微球表面引入鏈霉親和素，PBS離心清洗3次。3)將2)處理的微球加入到生物素化的ant1-EpCAM和ant 1-⑶146抗體溶液中，室溫下反應I _3h，用PBS漂洗得到雙抗體修飾的羥基微球。
[0016]步驟(4)混合樣品中雙抗體修飾的羥基微球的數量優選為1.5X 105/mL。
[0017]步驟(4)中離心所用離心力優選為40_400g。
[0018]在步驟(4)中，密度為1.2g/mL的二氧化硅微球特異性地捕獲CTCs，使用將得到密度>1.2g/mL的CTC-bead，使用密度為1.15g/mL的Percoll溶液對血樣進行分層，在這個密度下，紅細胞很難沉降，離心后，所有血細胞懸浮在Percol I溶液上層，CTC-beads沉降在最底層，徹底地跟所有的血細胞區分開來。
[0019]步驟(5)中所述的明膠酶優選為基質金屬蛋白酶9(metalloproteinases_9, MMP-9)0
[0020]優選的，所述的基于雙抗及細胞密度的高特異性高純度的腫瘤細胞分選方法，還包括對收集的腫瘤細胞進行活性鑒定步驟。
[0021]本發明相對于現有技術具有如下優點和效果:
(I)本發明用的二氧化硅微球密度在1.2g/mL左右，遠大于腫瘤細胞和正常血細胞的密度，修飾上相應的抗體后捕獲住腫瘤細胞，選擇性的增大了腫瘤細胞的密度，大幅擴大了其與血細胞密度差異性，提高了腫瘤細胞的篩選純度。
[0022](2)本發明使用雙抗體(ant1-EpCAM和ant1-CD146抗體)來特異性捕獲腫瘤細胞，大大加強了腫瘤細胞的捕獲效率。
[0023](3)本發明用雙抗體修飾的Si02@Gel能特異性吸附靶細胞，而不吸附血細胞，從而實現了對CTCs的特異性識別和捕獲。
[0024](4)本發明同時結合了基于細胞密度和抗原-抗體特異性識別，區分、篩選腫瘤細胞的方法。
[0025](5)本發明初次使用優化的Percoll細胞分離液，分選得到的純度極高的腫瘤細胞。
[0026](6)本發明在二氧化硅微球表面包裹了一層明膠，在收集到捕獲腫瘤細胞的二氧化硅微球后，通過明膠酶降解即可釋放腫瘤細胞，釋放的腫瘤細胞活性不受影響。
[0027](7)本發明可以對釋放下來的腫瘤細胞進行再培養，腫瘤細胞傳代并未受到影響，且驗證了腫瘤細胞相對血細胞極強的無限增殖能力。
[0028](8)本發明的分選過程具有簡單、方便、易操作等優勢。
【附圖說明】
[0029]圖1是本發明S12OGel微球捕獲、分選和釋放細胞的示意圖。
[0030]圖2是明膠、包裹明膠后的二氧化硅微球(S12OGel)和S12微球的表征結果圖，其中a)為傅里葉紅外圖，b)為XRD圖。
[0031]圖3是S12微球和S12OGel及其捕獲腫瘤細胞的TEM和SEM圖，其中a)為S12微球TEM圖，b)為S12OGel TEM圖，c)為S12微球表面捕獲腫瘤細胞的SEM圖，d)為S12OGel表面捕獲腫瘤細胞的SEM圖。
[0032]圖4是S12微球和S12OGel對腫瘤細胞系的捕獲效率結果圖。
[0033]圖5是結直腸癌細胞(HCT116)和乳腺癌細胞(MCF-7)表面EpCAM和⑶146抗原表達的測試結果圖，其中a)為兩種腫瘤細胞表面EpCAM和CD146抗原表達的共聚焦熒光圖，b)為流式結果圖，c)為聚合酶鏈式反應(PCR)結果圖。
[0034]圖6是不同抗體修飾的S12OGel對腫瘤細胞系的捕獲效率比較圖，其中對照組為未修飾任何抗體的Si02@Gel。
[0035]圖7是不同抗體修飾的S12OGel對人造CTC血樣中腫瘤細胞的捕獲效率比較圖，其中對照組為未修飾任何抗體的S12OGel。
[0036]圖8是不同密度的Percoll溶液對腫瘤細胞的分選結果圖。
[0037]圖9是CTC-beads經Percoll細胞分離液分選前后對照圖，a)為S12OGel選擇性的捕獲血樣中腫瘤細胞的顯微鏡明場圖，b)為CTC-beads經Percoll細胞分離液離心分選后的顯微鏡明場圖，其中黑色箭頭所指為捕獲住的腫瘤細胞。
[0038]圖10是麗P-9降解S12OGel表面的明膠及腫瘤細胞被釋放下來的效果圖，其中a)為S12微球表面化學修飾上明膠納米顆粒的TEM圖，b)為S12OGel表面明膠被MMP-9酶降解后的TEM圖，c)為S12OGel捕獲住腫瘤細胞的顯微鏡明場圖，d)為S12OGel表面明膠降解后被捕獲的腫瘤細胞被釋放下來的明場圖。
[0039]圖11是使用三色熒光對釋放下來的腫瘤細胞以及白細胞進行鑒定的熒光顯微圖，其中a)為純化前人造CTC血樣中投擲的腫瘤細胞跟白細胞比例圖，b)為人造CTC血樣經捕獲、分選純化釋放后腫瘤細胞跟白細胞的比例圖。
[0040]圖12是MMP-9酶降解CTC-beads釋放下來的腫瘤細胞和白細胞的數量總結圖。
[0041]圖13是使用流式細胞儀測定釋放前后腫瘤細胞活性結果圖，其中對照組為未經染色的細胞的熒光強度，腫瘤細胞經歷捕獲釋放流程前的細胞活性為94.9%，最終經歷捕獲和釋放后的腫瘤活性為92.5%。
[0042]圖14是釋放下來的腫瘤細胞進行再培養的顯微鏡下的視野圖，其中上面三張圖為明場圖，下面二張圖為暗場圖。
[0043]圖15是使用四色免疫化學熒光鑒定和計數癌癥患者外周血樣中捕獲到CTCs的結果圖，其中a)為CTC的熒光鑒定圖，b)為表面表達⑶146的CTC，c)為20例癌癥病人ImL血樣中捕獲到的CTC數量。
【具體實施方式】
[0044]下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限于此。若未特別指明，實施例中所用的技術手段均為本領域技術人員所熟知的常規手段。
[0045]本發明基于雙抗及細胞密度的高特異性高純度的腫瘤細胞分選方法的原理見圖1。在包裹明膠的二氧化娃微球Si02@Gel表面修飾上ant1-EpCAM和ant1-⑶146抗體，將修飾上雙抗的S12OGel與病人血樣混勻使微球捕獲住血樣中的腫瘤細胞，選擇性的增大腫瘤細胞密度(>1.2g/mL);將血樣滴加到密度為1.15g/mL的Percoll細胞分離液上層，離心分離后，所有的血細胞懸浮在Percoll溶液上層，捕獲腫瘤細胞的微球(CTC-beads)全部沉降在溶液底部，達到腫瘤細胞完全從血細胞中分離的目的;最后將分選提純后的CTC-beads使用MMP-9酶對二氧化硅微球表面的明膠進行降解，CTCs從二氧化硅微球表面保持很高活性地脫離下來，得到完全純化的CTCs。
[0046]實施例1S12OGel的制備及包裹明膠前后捕獲腫瘤細胞效率的比較(I)S12OGel 的制備
稱取0.1g尺寸為50μπι、密度為1.2g/mL的S12微球，經過無水乙醇離心清洗3次后，移入錐形瓶內，加入50mL無水乙醇，置于加熱攪拌臺上;待溫度升高到600C后，滴加0.2mL的3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APS)，攪拌3h后在S12微球表面引入氨基得到氨基修飾的S12微球(NH2-S12)5NH2-S12分別用無水乙醇、去離子水離心洗滌3次后，重新懸浮在50mL的去離子水中，滴加0.2mL濃度為50%的戊二醛溶液，室溫下攪拌1h后在微球表面引入醛基得到醛基修飾的S12微球(CHO-S12) ； CHO-S12用去離子水離心洗滌3次后，加入40mL濃度為I%的明膠溶液，室溫下攪拌4h，去離子水離心洗滌去除未反應完全的明膠溶液，最終得到表面均勻包裹一層明膠(厚度50nm左右)的二氧化娃微球(Si02@Gel)。
[0047 ]圖2a是明膠、包裹明膠后的二氧化硅微球(S i O2OGe I)和S i O2微球表面的官能團的紅外光譜圖，其中S12OGel在波長1635cm—1處有吸收帶，這個吸收帶屬于明膠N-H的伸縮振動吸收峰，而在S12表面無此吸收峰，說明了S12OGel表面明膠的存在；圖2b是相應的X射線衍射衍射圖譜，看出這三種材料都處于非晶的無定型結構，其中S12OGel的衍射角(2Θ21.7° )相對S12的衍射角(2Θ 22.8° )有一個稍微偏移的角度并且衍射峰稍微尖銳一些。
[0048](2)Si02微球和S12OGel對腫瘤細胞的捕獲效率將107-7細胞系使用01^]?配制成104/1^的濃度，加入1.5\105/1^ S12微球、S12OGel
微球，混勻，室溫孵育20min，樣品經過脫水、固定以后，使用顯微鏡觀察比較細胞在S12和S12OGel微球上的貼附狀態。圖3為S12微球和S12OGel及其捕獲腫瘤細胞的TEM和SEM圖，S12微球通過化學鍵合上一層明膠之后，在光滑的S12微球表面形成了明膠的納米結構。從細胞貼壁的SEM圖可以看出，光滑的S12微球襯底上細胞呈現球狀，可能不利于細胞捕獲在基底上;而在明膠納米顆粒基底上，細胞攤開，伸出很長的偽足，利于細胞爬片，可能會增加捕獲效率。
[0049]據此，進一步研究微球表面納米結構的形貌對腫瘤細胞捕獲效率的影響。將MCF-7和!1(:1'116兩種細胞系使用0腿1均配制成105/1^的濃度，分別加入1.5\105/11^ S12微球、S12OGel微球，混勻，室溫孵育20min后，顯微鏡下進行觀察計數，結果見圖4。從圖4看出，相比S12微球，S12OGel微球對腫瘤細胞的捕獲效率提高了 25%，說明微球表面的納米結構對腫瘤細胞的捕獲具有增強作用。
[0050]實施例2腫瘤細胞表面標記物的選擇
CTCs在轉移的過程中會發生復雜的EMT過程，在這個過程中，很多CTCs表面的EpCAM會低表達或者不表達，同時細胞表面會高表達CD146抗原，因此為了提高CTCs的捕獲效率，選用抗體ant1-⑶146和ant1-EpCAM—起來開展癌癥患者外周血中CTCs的捕獲工作。
[0051 ] 本實施例研究了乳腺癌細胞MCF-7和結直腸癌細胞HCTl 16表面CD146和EpCAM的表達。用嫁接熒光素的抗體PE-ant1-CD146和APC-ant1-EpCAM來標記腫瘤細胞相應抗原的表達，使用共聚焦顯微鏡和流式細胞儀對細胞進行觀察計數，并且對兩種腫瘤細胞進行了 RT-PCR測序，具體方法和實驗結果如下:
(I)共聚焦顯微鏡觀察
將15個腫瘤細胞培養在共聚小皿上，37°C、5%⑶2條件下培養I天后，加入1yL PE-anti_CD146( 10yg/mL)和1yL APC-ant1-EpCAM(10yg/mL)室溫下孵育1min ； PBS清洗后，加入4%多聚甲醛(PFA)室溫下將細胞固定1min JpAlOlIL DAPIUyg/mL)溶液染色來識別細胞核;使用激光掃描共聚焦顯微鏡(LCS SP9 STED Leica, Germany)對細胞進行拍照。實驗結果如圖5a所示，兩種腫瘤細胞均表達CD146和EpCAM這兩種抗原。
[0052](2)流式分析
將16個MCF-7和此1116細胞使用含1% BSA的I3BS溶液清洗，避免后續細胞染料非特異性吸附在細胞表面;離心去除I3BS之后，將細胞重新懸浮在在101IL PBS溶液中，加入1yLPE-anti_CD146( 10yg/mL)和(或)10yL APC-anti_EpCAM( 10yg/mL)孵育1min;經過PBS離心清洗去除多余的染色試劑，將細胞重新懸浮在在101IL PBS溶液中，使用流式細胞儀(Accuri C6, BD B1sciences)對細胞進行計數，同時未染色的細胞將作為對照組。實驗結果顯示，兩種腫瘤細胞都高表達⑶146和EpCAM這兩種抗原(圖5b)，同時從圖5b看出，有的腫瘤細胞只表達CD146或者EpCAM。依據上述流式結果，說明基于腫瘤細胞表面表達的EpCAM開展的免疫識別CTCs的技術，將會丟失表面不表達EpCAM的CTCs，而同時利用腫瘤細胞表面表達的⑶146來識別CTCs理論上會加強CTCs的捕獲效率。
[0053](3)RT-PCR
使用反車專錄聚合酉每鏈反應(reverse transcript1n-polymerase chain react1n,RT-PCR)方法、實時焚光定量PCR系統(StepOnePlus system)和TaqMan基因表達分析(Applied B1systems)來分析腫瘤細胞表面蛋白(如⑶146，EpCAM和E-Cadherin)的表達，結果如圖5(:所示。其中甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase, GAPDH)幾乎在所有組織中都高水平表達，將高表達的GAPDH作為其他蛋白表達的對照。實驗結果顯示，兩種腫瘤細胞表面⑶146和EpCAM這兩種抗原的表達屬于互補關系。
[0054]實施例3 S12OGel表面抗體的修飾
(I)使用PBS配制0.1M 的MES(2_morpholinoethanesulfonic acid )溶液，用MES溶液配制含4mg/mL EDC(N-(3-dimethylamino propyl-N’-ethylcar-bodiimide))和6mg/mL -NHS(N-hydroxysuc-cinimide)的溶液，將 100口1^數量為I.5 X 15 Si02@Gel懸浮液跟10yL上述EDC/NHS溶液在室溫下攪拌40min，激活明膠表面的羧基，PBS離心清洗3次。
[0055](2)使用PBS配制濃度為SOyg/mL的鏈霉親和素(streptavidin, SA)溶液，將上一步處理過的微球浸入101IL SA溶液中，室溫下反應60min，PBS離心清洗3次。
[0056](3)使用I3BS配制濃度為lOyg/mL的生物素化ant1-EpCAM溶液和lOyg/mL的生物素化ant1-⑶146溶液，將上一步處理過的微球浸入lOOyL ant1-EpCAM溶液和/或lOOyL ant1-CD146溶液中，室溫下反應2h，得到雙抗(ant1-EpCAM和ant1-CD146)修飾的Si02@Gel、ant1-EpCAM 修飾 S12OGel 和 ant1-CD146 修飾的 S12OGel。
[0057]實施例4不同抗體修飾的S12OGel捕獲腫瘤細胞效率的比較
(I)使用MCF-7和HCTl 16細胞系來研究加入的ant1-CD146抗體對腫瘤細胞捕獲效率的影響。
[0058]將胰酶消化下來的腫瘤細胞系經過DMEM多步稀釋得到濃度為15個/mL的細胞懸浮液。將未經過抗體修飾的1.5 X 15 S12OGel和不同抗體修飾的1.5 X 15 S12OGel分別與ImL 15個/mL細胞懸液混合30min，在Olympus IX 71顯微鏡下對懸浮液中未被捕獲的細胞進行計數，歸一化計算不同抗體修飾的S i 02iGe I對腫瘤細胞的回收效率。實驗結果如圖6所示，表面同時修飾ant1-EpCAM和ant1-⑶146的S12OGel對腫瘤細胞的回收效率要比單獨使用一種抗體的回收效率要高，回收效率約為90%，預示了兩種抗體的結合在癌癥患者外周血內加強CTCs捕獲的可行性。而不修飾任何抗體的S12OGe I捕獲效率〈4%，說明修飾抗體的Si02iGe I對細胞的捕獲是特異性的非物理吸附。
[0059](2)在進行臨床病人外周血樣中CTCs的捕獲實驗之前，先將上述腫瘤捕獲條件應用在人造血樣中腫瘤細胞的模擬捕獲實驗中。
[0060]首先，將一定數量的經過羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯(carboxy-fluorescein succinimidyl ester, CFSE, 5口8/!111^)預染色的]\^^'-7和!1(71116細胞加入11111^健康人外周血中，分別制備成腫瘤細胞濃度為20、50、100和250個/mL的人造CTC血樣。接著，將未經抗體修飾的1.5 X 15 S12OGel以及不同抗體修飾的1.5 X 15 S12OGel分別加入ImL不同濃度的人造CTC血樣中，室溫下共孵育20min，熒光顯微鏡下觀察計數不同S12OGel表面捕獲到的腫瘤細胞數。實驗結果如圖7所示，即使在人外周血復雜的微環境條件下，表面同時修飾ant1-EpCAM和ant1-⑶146的S12OGel依然能高效率(?85%)地回收血樣中的腫瘤細胞，并且同時使用兩種抗體比單獨使用任一抗體的捕獲效率要高。進一步驗證了病人血中雙抗對CTCs捕獲潛在的有效性。
[0061 ]實施例5 Percoll細胞分離液的制備和優化
在一個固定的離心力和分離液粘度下，溶液中不同顆粒的沉降速率跟顆粒的尺寸和密度有關，使用一定濃度的分離液和選擇一個固定的離心力離心一段時間后，不同顆粒將會停留在分離液的不同層。由此本實施例研究了癌癥患者外周血中各種細胞在分離液中的分層情況，其中紅細胞的密度為1.10-1.15g/mL，單核細胞(包括白細胞和腫瘤細胞)的密度為1.07-1.09g/mL。上面選擇了一種尺寸為50μηι、密度為1.2g/mL的二氧化娃微球包裹明膠、修飾上雙抗特異性地捕獲CTCs，將得到尺寸>50μπι、密度>1.2g/mL的CTC-bead，由于CTC-bead直徑和密度遠遠大于白細胞，故CTC-bead沉降速率將遠遠大于白細胞。
[0062]從美國Sigma公司購買的Percoll原液的密度是1.13g/mL;使用10倍濃縮的PBS(1.075g/mL)溶液以體積比1:9的比例稀釋Percoll原液，得到密度為1.077g/mL的較低密度的Per Co 11溶液;使用2.5M( 1.316g/mL )的蔗糖溶液以體積比1:9的比例濃縮Per co 11原液，得到密度為1.15的較高密度的Percoll溶液。
[0063]往裝有2mL不同密度(1.077g/L、1.13g/mL、1.15g/mL)的Percoll細胞分離液的15mL離心管中緩慢地滴加ImL上述完成腫瘤細胞捕獲的人造CTC血樣，400g離心力下離心1min，觀察細胞的沉降情況，結果見圖8。細胞分離液密度在1.077-1.13g/mL范圍內(圖8b-
c)，離心后會有相當大數量的紅細胞沉降在分離液底層，跟CTC-beads混在一起，降低了CTCs的分選純度。細胞分離液密度為1.15g/mL時，所有血細胞懸浮在Per co 11細胞分離液上層，CTC-beads沉降在最底層，徹底地跟所有的血細胞區分開來(圖8d)。
[0064]實施例6
往裝有2mL 1.15g/mL的Percoll細胞分離液的15mL離心管中緩慢地滴加ImL上述完成腫瘤細胞捕獲的人造CTC血樣，400g離心力下離心1min后，去除上清液和懸浮的血細胞，收集離心管底部的CTC-beads用顯微鏡觀察。如圖9顯示，顯微鏡明場下觀察發現，經過Percoll細胞分離液分選之后，CTC-beads完全跟血細胞分離開來。經過熒光染色鑒定計算得到腫瘤細胞的回收純度達到>90%。
[0065]將經I.15g/mL Percoll細胞分離液分選的CTC-beads加入到的0.5mL經PBS配制的MMP-9(0.1 g/mL)溶液中，37°C、5% CO2條件下孵育20分鐘，使用SEM觀察微球表面形貌，直觀驗證了微球表面的明膠納米顆粒能被MMP-9酶溶液降解(如圖10)。同時在X81顯微鏡下觀察到腫瘤細胞從微球表面脫離下來，釋放效率>90%。通過三色免疫化學熒光鑒定，計數釋放下來的腫瘤細胞數量和白細胞的數量，實驗結果總結如圖11和圖12所示，腫瘤細胞純化效率極高為?90%。
[0066]微球表面包裹的明膠經過200仙0.lmg/mL的MMP-9酶降解20min后，MCF-7細胞從微球表面釋放下來。將釋放下來的細胞收集起來，使用含1% BSA的PBS溶液清洗，避免后續細胞染料非特異性吸附在細胞表面。離心去除PBS之后，加入50仙濃度為Syg/mL的CFSE和50yL的碘化丙碇(PI，Syg/mL)孵育1min;經過I3BS離心清洗去除多余的染色試劑，將細胞重新懸浮在在101IL的I3BS溶液中，使用流式細胞儀(Accuri C6, BD B1sciences)對細胞進行計數，同時將胰酶剛消化下來的細胞和未經過染色的細胞作為對照組。圖13顯示，經歷捕獲-釋放過程的腫瘤細胞活性與剛被胰酶消化下來的細胞活性一樣。
[0067]接著將釋放下來的細胞收集起來放入96孔板內37°C、5%CO2條件下培養，每隔一段時間使用CFSE/PI染色進行活性鑒定同時觀察釋放后腫瘤細胞的生長狀態。結果見圖14，說明細胞捕獲釋放過程并未對細胞造成損傷，并且也未對細胞周期活動產出明顯的影響。
[0068]實施例7
在最優化條件下，對取自乳腺癌和結直腸癌患者的外周血開展了CTCs的捕獲與檢測實驗。
[0069]從20例患者(其中乳腺癌和結直腸癌患者各10例)靜脈血管處各抽取2mL的外周血，平均分為2份，一份加入1.5 X 15個經ant1-EpCAM修飾的S12OGel，另一份加入1.5 X 15個經 ant1-EpCAM 和 ant1-CD146 修飾的 S12OGel,共孵育 20min 后，先后經過 2mL 1.15g/mL?6代011細胞分離液40(^離心除去外周血細胞，2001^ 0.lmg/mL MMP-9酶溶液降解微球表面明膠使CTCs跟微球脫離。將釋放后收集起來的使用四色免疫化學熒光鑒定CTCs。
[0070]四色熒光鑒定:首先用ImL4%多聚甲醛(PFA)溶液進行固定，靜置10分鐘，用PBS沖洗;接著加入0.1% Triton-XlOO溶液ImL對細胞進行穿孔，靜置10分鐘，用I3BS沖洗，在加入3% BSA溶液0.5mL對非特異性位點進行包被，靜置30分鐘，用PBS沖洗;PE-ant1-CD146和APC-ant1-EpCAM，ant1-CD45-FITC和ant1-CK-PE熒光染料各0.1mL對細胞進行免疫熒光染色，并4°C下靜置過夜；最后經DAPI染色后利用多通道熒光檢測系統進行CTCs觀測和計數。ant1-⑶45-FITC在藍光激發下發綠色熒光用于識別白細胞，ant1-CK-PE在綠光激發下發橙紅色熒光用于識別腫瘤細胞，DAPI在紫外光激發下呈藍色用于染細胞核。其中所有DAPI+/CD45-/EpCAM+或者DAPI+/CD45-/CD146+的細胞均視為CTC;而所有DAPI+/CD45+的細胞視為白細胞。實驗結果如圖15所示，從乳腺癌患者和結直腸癌患者的ImL外周血樣中，均捕獲到了CTCs，并且經 ant1-EpCAM 和 ant1-CD146 修飾的 S12OGel 比單獨修飾 ant1-EpCAM 的 S12OGel捕獲和鑒定到的CTCs要多，說明了ant1-CD146能捕獲到患者血樣中低表達或者不表達EpCAM的CTCs，這些捕獲到的CTCs對臨床研究腫瘤迀移具有非常重要的研究價值。
[0071]上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。
【主權項】
1.一種基于雙抗及細胞密度的高特異性高純度的腫瘤細胞分選方法，其特征在于:包括如下步驟: (1)配制密度為1.15-1.20g/mL的細胞分離液；所述的細胞分離液包括Ficol I或Percol I細胞分離液； (2)在粒徑為30-100μπι、密度為1.16-3g/mL的羥基微球表面化學鍵合上一層20-100nm厚的明膠，得到包裹明膠的羥基微球;所述的羥基微球包括二氧化硅微球、聚甲基丙烯酸甲酯微球； (3)在包裹明膠的輕基微球表面修飾上抗體ant1-EpCAM和ant1-CD146，得到雙抗體修飾的羥基微球； (4)將病人血樣與雙抗體修飾的羥基微球混勻孵育得混合樣品，將混合樣品滴加到1.15-1.20g/mL細胞分離液的上層，離心分離后，捕獲住腫瘤細胞的微球沉積在細胞分離液底部； (5)將收集的捕獲住腫瘤細胞的微球使用明膠酶降解微球表面明膠，釋放腫瘤細胞。2.根據權利要求1所述的基于雙抗及細胞密度的高特異性高純度的腫瘤細胞分選方法，其特征在于:步驟(I)中所述的細胞分離液為的密度為1.15g/mL的PercolI細胞分離液。3.根據權利要求2所述的基于雙抗及細胞密度的高特異性高純度的腫瘤細胞分選方法，其特征在于:密度為1.15g/mL的Percoll細胞分離液通過使用1.316g/mL的蔗糖溶液以體積比1:9的比例濃縮密度為1.13g/mL的Percoll原液得到。4.根據權利要求1所述的基于雙抗及細胞密度的高特異性高純度的腫瘤細胞分選方法，其特征在于:步驟(2)中所述的羥基微球是粒徑為50μπι、密度為1.2g/mL的二氧化硅微球。5.根據權利要求1所述的基于雙抗及細胞密度的高特異性高純度的腫瘤細胞分選方法，其特征在于:所述的羥基微球為二氧化硅微球時，步驟(2)包括如下步驟: 1)將二氧化硅微球加入到無水乙醇中，加熱升溫至60°C后滴入3-氨基丙基三乙氧基硅烷磁力攪拌2-4h，然后經過無水乙醇、去離子水離心沖洗后得到了氨基修飾的二氧化硅微球； 2)將氨基修飾的二氧化硅微球重新分散到去離子水中，加入戊二醛，室溫下攪拌5-20h，然后經過去離子水離心沖洗后得到了醛基修飾的二氧化硅微球； 3)將醛基修飾的二氧化硅微球再次分散到明膠溶液，室溫下攪拌3-12h后用去離子水離心洗滌去除未反應完全的明膠溶液得到表面均勻包裹上一層明膠的二氧化硅微球。6.根據權利要求1所述的基于雙抗及細胞密度的高特異性高純度的腫瘤細胞分選方法，其特征在于:步驟(3)包括如下步驟: 1)使用EDC/NHS對包裹明膠的羥基微球表面羧基進行活化30-120min，使用I3BS離心清洗3次； 2)將I)處理的微球浸入到鏈霉親和素溶液中，反應40-120min在微球表面引入鏈霉親和素，PBS離心清洗3次； 3)將2)處理的微球加入到生物素化的ant1-EpCAM和ant1-⑶146抗體溶液中，室溫下反應l-3h，用PBS漂洗得到雙抗體修飾的羥基微球。7.根據權利要求1所述的基于雙抗及細胞密度的高特異性高純度的腫瘤細胞分選方法，其特征在于:步驟(4)混合樣品中雙抗體修飾的羥基微球的數量為1.5 X 105/mL。8.根據權利要求1所述的基于雙抗及細胞密度的高特異性高純度的腫瘤細胞分選方法，其特征在于:步驟(4)中離心所用離心力為40-400g。9.根據權利要求1所述的基于雙抗及細胞密度的高特異性高純度的腫瘤細胞分選方法，其特征在于:步驟(5)中所述的明膠酶為基質金屬蛋白酶9。10.根據權利要求1所述的基于雙抗及細胞密度的高特異性高純度的腫瘤細胞分選方法，其特征在于:包括對收集的腫瘤細胞進行活性鑒定步驟。
【文檔編號】C12N5/09GK105950558SQ201610366839
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年5月27日
【發明人】趙興中, 黃琴琴, 蔡博
【申請人】武漢大學