雜交瘤細胞株Zj/2D8及其檢測尼克酰胺-N-甲基化酶抗原的應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種蛋白免疫學檢測方法，具體涉及一種可以抗尼克酰胺-N-甲基化 酶蛋白的單克隆抗體、分泌該單克隆抗體的細胞株、制備方法及該單克隆抗體的用途。 (二）
【背景技術】
[0002] 惡性腫瘤是一類嚴重危害人類健康的疾病。據世界衛生組織最新數據顯示，每年 全球癌癥新發病例1000多萬，死亡700多萬，占總死亡人數的12%。到2020年前，每年將 新增1500萬癌癥患者，不僅如此，癌癥的死亡人數也在全球迅速上升，2030年這個數字可 能會增至1320萬。
[0003] 腫瘤的早期診斷是腫瘤防治的關鍵，腫瘤的死亡和復發的危險性與初診時的分期 密切相關，且化療、放療的敏感性一定程度上取決于癌細胞內的酶或蛋白分子。生物標志物 是細胞處于特定條件下代表該細胞生物學狀態的重要信號指示分子。為了降低腫瘤的死亡 率或提高治療的效果，許多研宄致力于腫瘤關鍵生物標準物的發現和篩選。因此，尋求腫瘤 早期診斷、分期或/和指示化療、放療的敏感性、預后以及潛在治療靶點的腫瘤標志物一直 是腫瘤學的研宄熱點。
[0004] 尼克酰胺-N-甲基化酶（NNMT，EC2. I. I. 1)正常表達于人肝臟組織中，其他組織如 腸、肺、腎、胎盤、心臟、骨骼肌、腦、胰腺表達很低或者沒有表達。NNMT在不同人的肝臟中活 性差異較大，活性的高低取決于胞漿中NNMT的濃度，NNMT的濃度與NNMT的mRNA水平有關， 與基因的多態性無關，通常認為NNMT過表達的機制是由于基因翻譯后調控異常所致，可能 受肝細胞核因子-I (HNF-I)、TGF- β 1、STAT3等激活。
[0005] NNMT的主要功能是以S-腺苷-L蛋氨酸（SAM)為供體，催化尼克酰胺和吡啶類物 質的甲基化，形成吡啶鹽，在正常肝細胞中參與藥物的生物轉化，是催化藥物、異型生物質 代謝的一種酶。NNMT是維持尼克酰胺平衡的關鍵酶，所以可以推測NNMT的增高可影響尼 克酰胺參與細胞的功能。尼克酰胺是NAD分子的組成部分，可通過補救合成途徑生產NAD， 而NAD參與細胞的很多基本可能如能力代謝，對應和損傷的抵抗，細胞的壽命等。帕金森綜 合癥被認為與NNMT增高引起的尼克酰胺代謝異常有關，在腦組織中該酶活性過度增高通 過兩條途徑導致帕金森綜合癥，一是生成神經毒物N-甲基吡啶（如N-甲基-4苯基吡啶 (ΜΡΡ+))激活導致線粒體復合體1受損，二是降低了尼克酰胺導致能量代謝障礙。尼克酰胺 還能抑制多聚ADP聚合酶（PARP)，而PRAP通過堿基切除修復、壞死、凋亡等多細胞調節來 保持基因組的完整性。因此有理由推測NNMT可能參與腫瘤細胞的多種生物功能，與腫瘤的 發生和發展有關，或可影響化，放療效果。如能明確NNMT在腫瘤細胞中的作用，并闡明NNMT 在腫瘤中的作用機制或分析其下游相關分子組成的模塊或通路，必將進一步明確NNMT作 為在腫瘤防治中的價值。
[0006] 近年來，用蛋白助學和基因芯片技術比較不同癌組織和癌旁組織差異時發現NNMT 在多種癌組織中異常表達。與正常組織和癌旁組織相比，NNMT在結直腸癌、肺癌、膀胱癌、胃 癌、甲狀腺乳頭狀癌、腎透明細胞癌、口腔鱗狀細胞癌、乳腺癌和胰腺等腫瘤組織有過表達， 并在多種腫瘤患者的血清中升高。這些研宄提示NNMT與腫瘤發生密切相關，推測NNMT可 能參與腫瘤細胞的多種生物功能，與腫瘤的發生和發展有關，或可影響化、放療效果。 (三）
【發明內容】

[0007] 本發明采用尼克酰胺-N-甲基化酶蛋白作為免疫原免疫小鼠制備了能穩定分泌 抗NNMT單克隆抗體的細胞株，然后通過NNMT蛋白的間接ELISA法篩選并進一步純化獲得 了能分泌NNMT抗體的細胞系及由所屬細胞系提取的單克隆抗體，因此本發明目的是提供 一株高效分泌抗NNMT (尼克酰胺-N-甲基化酶）抗體的雜交瘤細胞株，利用該細胞株提取 NNMT抗體，采用NNMT抗體對待測組織中的NNMT抗原進行檢測，進而確定待測組織中NNMT 抗原的含量，有助于臨床診斷。
[0008] 本發明采用的技術方案是：
[0009] 本發明提供一株雜交瘤細胞株Zj/2D8,保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏日 期為2013年10月22日，保藏編號為CCTCC NO !C2013149,保藏地址為中國武漢，武漢大學， 郵編：430072。
[0010] 本發明還涉及一種所述雜交瘤細胞株Zj/2D8在檢測尼克酰胺-N-甲基化酶 (NNMT)抗原中的應用，具體所述的應用是提取雜交瘤細胞株Zj/2D8中的NNMT抗體，再根據 抗原抗體特異性結合原理，利用NNMT抗體檢測待測樣品中NNMT抗原含量。
[0011] 本發明所述NNMT抗體的提取方法為：（1)將雜交瘤細胞株Zj/2D8用含10 %胎牛 血清的1640培養液，在37°C，含5% CO2的細胞培養箱內擴大培養，收集細胞，用PBS (pH值 為7. 4)配制成0. 4X IO6Ail的細胞液，再將細胞液腹腔注射石蠟致敏的BALB/c小鼠（不 限于BALB/c小鼠，本領域公知的小鼠型號均可），每只注射Iml，接種后9天收獲腹水，1200 轉/分鐘離心，除去沉淀，收集上清液；
[0012] (2)向步驟⑴收集的上清液中加入2倍體積的pH 5.0、0.06mol/L醋酸鈉緩沖 液，再用lmol/L HCl調pH至4. 8,制成稀釋上清液；然后按每毫升稀釋上清液中加11 μ 1 辛酸的比例，室溫攪拌下向稀釋上清液中逐滴加入辛酸，于30分鐘內加完，4°C靜置2小時， 取出，15000g離心30分鐘，棄沉淀；上清經125 μ m尼龍篩過濾后，濾液加入1/10體積的 0· Olmol/L PBS，用lmol/L NaOH調pH至7. 2 ;在4°C下加入硫酸銨至45%飽和度（所述 45%飽和度是指質量濃度），攪拌30分鐘，靜置1小時，1000 Og離心30分鐘，棄上清，沉淀 以含 137mmol/L NaCl+2. 6mol/LKCl+0. 2mmol/L EDTA 的 PBS 為透析液進行透析，4°C過夜， 直至用l〇g/L BaCljK溶液檢測截留液無 SO 4離子，取出截留液，1000 Og離心30分鐘，除去 不溶性沉渣，上清即為NNMT抗體。
[0013] 本發明提供的雜交瘤細胞Zj/2D8所產生的單克隆NNMT抗體對于NNMT抗原均有 高水平的抗體效價，因此單克隆NNMT抗體、其活性片段或其保守性突變體以及標記的活性 片段或其保守性突變體，或其任意組合均可用于制備檢測NNMT抗原的試劑、藥劑或試劑 盒。本發明所述制備檢測NNMT抗原的試劑、藥劑或試劑盒優選采用雙抗夾心法檢測NNMT 抗原。
[0014] 對于本發明所述標記的活性片段或其保守性突變體，是指本領域公知的生物標記 或化學標記。例如酶標記、熒光標記（例如熒光素標記）或化學發光標記。優選地，所述酶 標記為辣根過氧化物、丙酮酸激酶或葡萄糖氧化酶標記。
[0015] 本發明所述單克隆抗體優選為人源化的單克隆抗體（人源化抗體主要指鼠源單 克隆抗體以基因克隆及DNA重組技術改造，重新表達的抗體，其大部分氨基酸序列為人源 序列取代，基本保留親本鼠單克隆抗體的親和力和特異性，又降低了其異源性）。
[0016] 與現有技術相比，本發明有益效果主要體現在：
[0017] (1)本發明提供的單克隆雜交瘤細胞株Zj/2D8能夠高效分泌（是指在實施例1的 1. 3中培養液上清稀釋1000倍后檢測細胞分泌到上清液中的抗體亦為陽性）NNMT單克隆抗 體蛋白。
[0018] (2)本發明從單克隆雜交瘤細胞株Zj/2D8提取的NNMT單克隆抗體對NNMT抗原具 有很高的（I :1000000)抗體效價，較好的親和力和較高的純度，提示該單克隆抗體可應用 于檢測NNMT抗原的科研研宄領域。
[0019] (2)本發明的從單克隆雜交瘤細胞株Zj/2D8提取的NNMT單克隆抗體可應用于臨 床檢測，通過對不同組織的病理切片進行免疫組化，檢測該組織中NNMT蛋白的表達情況。 (四）
【附圖說明】
[0020] 圖 1 為 Zj/2D8、1E7 和 2F8 純品抗體 SDS-PAGE 電泳圖，M !Marker，I :Zj/2D8 純品 抗體，2 :1E7純品抗體，3 :2F8純品抗體。
[0021] 圖2為Zj/2D8、1E7和2F8細胞株分泌抗體的亞類、輕鏈型圖，A為Zj/2D8、B為 1E7, C 為 2F8C。
[0022] 圖3為Z j/2D8純品抗體凝膠掃描圖。
[0023] 圖4為Zj/2D8、2F8和1E7細胞株純品抗體的親和力反應曲線圖。
[0024] 圖5為Zj/2D8細胞株單抗的免疫印跡，I :GST蛋白，2 !NNMT-GST融合蛋白，3 :NNMT 蛋白。
[0025] 圖6為10條合成短肽的免疫印跡。
[0026] 圖7為大腸癌細胞株及陽性細胞株HT-29細胞NNMT慢病毒干擾后的免疫印跡。<