專利名稱：：大豆球蛋白的單克隆抗體及其應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種大豆球蛋白的單克隆抗體及其應用。
背景技術：
：大豆作為人和動物優質的植物蛋白和油脂來源，具有廣泛應用。大豆及豆制品大量應用于食品行業，玉米-豆粕型日糧作為主要的動物飼料廣泛應用于畜禽生產。但是大豆球蛋白作為含量豐富、熱穩定性強、具有較強免疫原性的大豆抗原蛋白，經常引起過敏反應，在醫學領域常表現為嬰幼兒腹瀉，以及5-6%的兒童和2-4%的成年人對大豆和豆制品表現出臨床癥狀，常表現為腹瀉，嚴重的伴有顫抖、咽喉水腫和急性哮喘等癥狀；在畜牧行業，大豆抗原蛋白可導致斷乳仔豬和妊娠母豬、犢牛、大鼠等幼齡動物的過敏反應，常表現為腹瀉、生長性能下降直至死亡。目前已經開發了多種加工工藝來處理大豆、豆粕及豆制品，如多項研究證實豆粕、膨化大豆、發酵豆粕、大豆濃縮蛋白和大豆分離蛋白等大豆制品的抗原活性弱于生大豆。然而大豆球蛋白是熱穩定性的抗原蛋白，直接加熱并不能徹底破壞其抗原活性。例如，經過加熱處理的大豆制品中具有抗原活性的球蛋白殘留量仍高達18%,這個量足以引起嬰兒的過敏反應。所以，對不同加工工藝處理前后大豆、豆制品、豆粕飼料中大豆球蛋白含量的檢測具有重要的理論意義和應用價值。己有的定量檢測方法主要以抗血清測定和高效液相色譜分析為主。這些方法從免疫學角度來看仍存在一定的缺陷，前者多抗血清需要重復制備、不同實驗室之間不能參比、靈敏度和準確性低；后者則無法體現免疫反應性，并且由于前處理過程繁瑣和需要昂貴的專門儀器而難以廣泛應用于大豆制品的現場檢測。
發明內容本發明的一個目的是提供一種可用于檢測大豆球蛋白的單克隆抗體與分泌該抗體的雜交瘤細胞。本發明所提供的分泌大豆球蛋白的單克隆抗體，由保藏號為CGMCCNa2791的抗大豆球蛋白單克隆抗體細胞株4B2產生。該單克隆抗體為包含k輕鏈的鼠IgG2抗體，其親和常數(Ka)為3.3x108L/mol。抗大豆球蛋白單克隆抗體細胞株4B2CGMCCNo.2791已于2008年12月05日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為中國北京市朝陽區大屯路)，保藏登記號為CGMCCNo.2791。本發明的另一個目的是提供含有上述單克隆抗體的檢測大豆球蛋白的試劑盒。為了更方便現場監控和大量樣本篩查，本發明所提供的含有上述單克隆抗體的檢測大豆球蛋白的試劑盒中，還含有其它酶聯免疫檢測試劑，如酶標二抗、大豆球蛋白標準品溶液、顯色液、終止液、洗滌液等。將上述大豆球蛋白的單克隆抗體和固相載體相偶聯得到的免疫親和吸附劑，以該免疫親和吸附劑為填料的免疫親和色譜柱和含有該免疫親和吸附劑和免疫親和色譜柱的試劑盒均屬于本發明的保護范圍。其中，所述固相載體可為纖維素、葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、多孔玻璃、瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺-瓊脂糖凝膠等親和層析載體。本發明制備的大豆球蛋白單克隆抗體，為大豆球蛋白的基礎研究、品種篩選和改造、臨床診斷提供了有利的工具，可用于深入研究大豆球蛋白的生物學效應。具體而言可應用于.-(1)飼料行業、食品行業高通量快速檢測大豆、豆粕、豆制品、豆粕飼料中大豆球蛋白的含量；(2)將該抗體作為研究大豆抗原性的工具，進行大豆種質資源篩選、品種改造；(3)應用該抗體制備免疫親和柱，來分離純化大豆球蛋白；(4)應用該抗體進行動物實驗研究；(5)將大豆球蛋白單克隆抗體進行標記(如用FITC進行標記)，用于臨床診斷或輔助診斷對大豆食物過敏的患者；(6)應用該抗體進行免疫組化檢測大豆球蛋白在器官組織、各種體液的分布；(7)應用該抗體作為大豆球蛋白的拮抗劑，可以進行藥理學研究，用于治療大豆抗原蛋白過敏性疾病。用本發明的大豆球蛋白單克隆抗體檢測大豆球蛋白，克服了傳統的SDS-PAGE、多抗血清間接性ELISA檢測方法存在的不同實驗室之間不能參比、靈敏度和準確性低、需要重復免疫制備多抗血清的缺點，其檢測準確性接近反相高效液相法(RP-HPLC)，而且成本很低，可滿足詞料行業、食品行業相關企業單位高通量快速檢測大豆、豆粕、豆制品中大豆球蛋白含量的需要，在大豆制品抗原物質定量檢測和致過敏性的評估中具有廣闊的應用前景。圖1為SDS-PAGE分析純化的大豆球蛋白樣品。圖中條帶a:空白對照；條帶b:提取的大豆球蛋白粗樣品；條帶C:純化的大豆球蛋白樣品。圖2抗大豆球蛋白單克隆抗體細胞株4B2CGMCCNo.2791所產生的單克隆抗體的效價曲線。圖中每一個點代表在ELISA分析中8個重復測定的平均值(n^8)。包被抗原大豆球蛋白的濃度為50.0pg/mL，單抗的起始濃度為1.0mg/mL。(橫坐標是指10的n次方，比如說4對應的就是104，即該點代表稀釋10000倍)。圖3抗大豆球蛋白單克隆抗體細胞株4B2CGMCCNo.2791所產生的單克隆抗體與大豆及其制品的免疫印跡分析。圖中條帶a:提取的大豆球蛋白粗樣品；條帶b:純化的大豆球蛋白樣品。具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試劑，如無特別說明，均從商業途徑獲得。實施例l、抗大豆球蛋白單克隆抗體的制備1、大豆球蛋白的提取和純化采用分級鹽析與凝膠過濾相結合的方法制備。具體步驟如下l丄大豆脫皮后磨漿，過濾后乙醚萃取脫脂，經旋轉蒸發除去殘留乙醚，制得脫脂大豆粉。1.2.在室溫條件下，向脫脂大豆粉中加入0.03M的Tris-HCl(pH8.0，10mM(3-巰基乙醇(購自上海Aladdin,貨號1093795))緩沖液(1:20)，溶解，10,000rpm/min離心30min，收集上清液。1.3.以HC1調節pH至6.4，10,000rpm/min(4°C)離心30min，收集沉淀用磷酸鹽緩沖液(添加10mmol/LP-巰基乙醇的0.01mol/L磷酸緩沖液(PBS)，pH8.0)(0.01mol/L磷酸緩沖液(PBS)8.00gNaCl、0.20gKCl、0.20gKH2PO4、1.15gNa2HP04*12H20，加蒸餾水至1000mL，用lmol/L的NaOH調PH為8.0)。溶解，離心收集上清液，獲得大豆球蛋白粗提液。1.4.加入固體(NH4)2S04，使(NH4)2S04飽和度達51。/。，4"C靜置過夜后，15,000rpm/min4。C離心30min收集沉淀，沉淀溶解于pH7.6的磷酸鹽緩沖液。加入固體(NH4)2S04，使(NH4)2S04飽和度達90。/。，4。C靜置過夜后，以15,000rpm/min(4°C)離心30min，沉淀溶于pH7.6的磷酸鹽緩沖液中。1.5.瓊脂糖凝膠Sepharose6B經真空脫氣后裝柱(100cmx2.6cm)，充分平衡后上樣進行凝膠過濾，用pH7.6的磷酸鹽緩沖液洗脫，核酸蛋白檢測儀280nm檢測，分別收集洗脫液組分。將收集到的含有蛋白的洗脫液再經過DEAE-52層析柱(30cmx3.3cm)，收集蛋白洗脫液。將洗脫液于4'C對蒸餾水透析除鹽，冷凍干燥。1.6.蛋白純度鑒定和分子量測定采用SDS-PAGE電泳方法進行，添加SDS的分離凝膠濃度為12%，濃縮膠濃度為5%。以低分子量標準蛋白為標準進行電泳，電泳條件為恒壓100V。電泳結束后用考馬斯亮蘭染色液染色6h以上，脫色觀察，結果如圖l所示。1.7.利用BCA蛋白檢測試劑盒檢測蛋白的濃度，測定步驟按操作說明進行。2、雜交瘤細胞系的建立2丄動物免疫將適量純化的大豆球蛋白溶液加入0.5mL生理鹽水中，配成5mg/mL濃度，加入等體積的完全弗氏佐劑(購自Sigma，目錄號F5506-10)后制成免疫原乳化劑，免疫6周齡雌性Balb/c小鼠。4周后行第二次免疫，再兩周后行第三次免疫，均使用加入等體積的不完全弗氏佐劑(購自Sigma，目錄號F5881-10)后制成免疫原乳化劑。在第三次免疫后第10天用間接ELISA法測定小鼠血清中大豆球蛋白抗體效價，效價高者進行下一步細胞融合。2.2.細胞融合無菌取材經過步驟2.1.免疫的Balb/c小鼠脾臟，制成脾細胞懸浮液。分別吸取含lX108個脾細胞和2x1(^個骨髓瘤細胞sp2/0的懸浮液，移至50mL離心管中。加不完全培養液，使細胞液總體積為30mL。充分混勻后，于1000xg離心7min，棄上清液。輕彈管底，松散沉淀細胞。將離心管底部浸入37。C溫水中，均勻轉動，將1mL50%PEG溶液沿離心管壁加樣轉動的離心管，加樣時間60秒左右。立即將細胞懸浮液全部吸入吸管，靜置30秒后，再將其吹入離心管內。在5min內加入25mL不完全培養液以稀釋PEG，使PEG失去促融作用。于800xg離心7min，棄上清液。加入10mLHAT培養液，懸浮并混勻沉淀細胞。將細胞懸浮液加入已鋪有飼養細胞的96孔培養板中，每個孔0.1mL。然后將培養板置于37'C和5%C02的培養箱內培養。將融合后的細胞懸浮于HAT培養液中，置于37"C和5%<:02的培養箱內培養。每2-3天更換培養液一次。在融合后7天內用HAT培養液；第7-14天改用HT培養液；第14天以后則用普通的完全培養液。2.3.間接免疫酶聯吸附實驗(ELISA)篩選陽性雜交瘤細胞在細胞融合后第7天，每次換液收集雜交瘤細胞培養液，然后采用間接ELISA方法對每個細胞培養孔的培養液進行陽性雜交瘤細胞株的篩選。具體操作如下(1)包被用包被緩沖液((0.85mol/L、pH9.6的碳酸緩沖液)準確稱取1.59gNa2C03和2.93gNaHC03，將其混溶于1000mL蒸餾水中)將純化大豆球蛋白溶液稀釋至最佳工作濃度(2.5|ig/mL)，每孔加樣100)LiL，置濕盒于37"C溫育1小時。(2)封閉棄去酶標板孔內的液體。每個孔加入封閉液(用包被緩沖液配制，加入1%明膠)150pL，置濕盒中37i:溫育1小時后，用洗滌緩沖液(含0.05%Tween-20的0.01mol/LPBS(pH7.4);0.01mol/L磷酸緩沖液(PBS，pH7.4)的配方為8.00gNaCl，0.20gKCl，0.20gKH2PO4，1.15gNa2HP04*12H20;加蒸餾水至1000mL)洗滌3次，每次90s(簡稱洗滌，下同)，然后拍干。(3)加待測樣品用抗體稀釋液(含0.01。/。Tween-20、0.1%明膠的0.01mol/LPBS(pH7.4))將雜交瘤細胞培養上清液以適當起始濃度倍比稀釋后加入酶標板，每個孔100^L,每個濃度梯度設3個重復，同時設空白對照、陰性對照和陽性對照。37'C溫育lh后，洗滌，拍干。(4)加酶標二抗(抗抗體)用抗體稀釋液將酶標二抗(羊抗鼠IgG/HRP)稀釋到工作濃度(1:5000)，加入酶標板，每個孔100pL，置于37'C溫育lh后，洗滌，拍干。(5)加底物溶液向各酶標孔加新鮮配制的OPD底物使用液(OPD底物使用液將40mgOPD溶于100mL底物緩沖液，再加30pL30%H202。底物緩沖液((pH5.0的磷酸-檸檬酸緩沖液)將25.7mL的0.2mol/L磷酸氫二鈉(28.4g/L)和24.3mL的0.1mol/L檸檬酸(19.2g/L)溶于50mL蒸餾水)100|iL，37。C溫育15-30min。(6)終止反應每個孔加終止緩沖液((2mol/LH2S04):將21.7mL濃硫酸(98%)溶于156.6mL蒸餾水中)50mL，終止底物顯色反應。(7)判定結果用酶標儀于492nm波長下測定各個孔內溶液的吸光值(OD492)，若待測孔00492大于或等于陰性對照孔的2.1倍，即認為是陽性值，從而得出可能的陽性雜交瘤細胞克隆。2.4.陽性雜交瘤細胞的單克隆化采用有限稀釋法對篩選的陽性細胞株進行克隆，具體步驟如下于克隆前一天制備飼養細胞(Balb/c小鼠的腹腔單核巨噬細胞)。將待克隆的雜交瘤細胞用加樣器反復吹打均勻后，轉至24孔細胞培養板中，并進行細胞計數。根據計數結果，對細胞懸浮液做適當稀釋。取250個活細胞懸浮于4.6mL(終體積)培養液中(此時平均每0.1mL溶液中含5個細胞)，接種96孔培養板，每個孔0.1mL，共36個孔。將4mL培養液加入到余下的l.OmL細胞溶液中(此時平均每0.1mL溶液中含1個細胞)，將此細胞液接種至其次的36孔，每個孔O.lmL。向剩余的1.4mL細胞懸浮液中補加培養液1.4mL(此時平均每0.1mL溶液中含0.5個細胞)。混勻后，將其接種于剩余的24孔，每個孔0.1mL。將培養板置于37'C和5n/。C02培養箱中培養。適時進行換液和檢測。有多孔陽性時，應盡可能取單克隆孔進行再次克隆，直至所有細胞孔的培養液均為陽性。最后獲得穩定分泌抗大豆球蛋白單克隆抗體細胞株4B2，該細胞株已于2008年12月05日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為中國北京市朝陽區大屯路)，保藏登記號為CGMCCNo.2791。3、體外培養法制備單抗將己經建立的抗大豆球蛋白單克隆抗體細胞株4B2CGMCCNo.2791進行擴大培養，所用的培養基為DMEM培養基添加20。/。的胎牛血清，置于37°(3和5%(:02孵箱中培養，待細胞濃度大于10S/ml時停止換液，持續孵育至細胞全部死亡。收集培養上清液，1500-2000xg，離心10分鐘，上清液含有高水平的單克隆抗體，-20°C保存備用。4、體內誘生腹水法制備單抗抗體的大量制備采用體內誘生法。將液體石蠟(0.5mL/只)注入健康的Balb/c雌性小鼠腹腔內，1-2周后備用。將擴大培養的抗大豆球蛋白單克隆抗體細胞株4B2CGMCCNo.2791吹落，于1000xg離心5min后收集細胞，棄上清。用不完全培養液將細胞懸浮，混勻，將細胞濃度調整至10S個/mL。向已進行石蠟處理的小鼠腹腔內注射lmL/只的上述雜交瘤細胞。7-9天后收集腹水，于3000xg離心10min，棄脂肪層和細胞層，收集中間澄清層，置于-7(TC凍存。5、單抗的純化5丄預處理(二氧化硅吸附法)取步驟3獲得的上清液或步驟4獲得的小鼠腹水，用等體積的巴比妥緩沖液稀釋。加二氧化硅粉末，室溫下不時搖動30min。于2000xg離心20min，即得澄清的液體。5.2.辛酸-硫酸銨沉淀法純化IgG向一份經過步驟5丄預處理過的液體中加入2倍體積的0.06mol/L乙酸緩沖液(pH5.0)。用0.1mol/LHCl調pH值至4.8。于室溫下攪拌，并在30min內逐滴加入辛酸(每lmL稀釋前的經過步驟5丄預處理過的液體加33pL辛酸)。在4°C靜置2h后，于15000xg離心30min。棄沉淀，上清液經砂芯漏斗過濾。向溶液中加入經過步驟1預處理過的液體的1/10體積的0.1mol/LPBS，用1mol/LNaOH調pH值至7.4。置于4i:冰浴中，在30min內加入0.277g/mL的(NH4)2S04，使其飽和度達45%。靜置lh以上后，于10000Xg離心30min。棄上清，將沉淀溶于PBS(含137mmol/LNaCl、2.6腿ol/LKC1和0.2mmol/LEDTA，pH7.4)中。在4"C于PBS中透析過夜。于10000xg離心30min后，除去不溶性沉渣，澄清液即為初級純的抗體。5.3.親和層析純化IgG抗體的進一步純化采用HiTrapProteinGHP親和層析柱進行。具體操作如下用10倍柱體積(約10mL)的結合緩沖液(20mmol/L磷酸鹽，pH7.0)平衡層析柱。用直徑為0.45pm的過濾器過濾樣品除去不溶物，然后與結合緩沖液按l:l(V/V)混合。再用注射器進樣，隨后以10倍柱體積(約10mL)結合緩沖液清洗，以除去未結合雜蛋白。最后用2-5倍柱體積的洗脫緩沖液(0.1mol/L甘氨酸-鹽酸，pH2.7)洗脫樣品。收集洗脫液(收集試管事先加有lmol/LpH9.0的Tris-HCl中和液，其用量為100pL/mL收集液)。于5mmol/LPBS中充分透析，然后濃縮備用。6、單抗的特性鑒定6.1.抗體的類型及亞型取抗大豆球蛋白單克隆抗體細胞株4B2CGMCCNo.2791培養液，于2000xg離心8min，以去除細胞及其碎片。用免疫純單抗分型試劑盒I(ImmunoPureMonoclonalAntibodyIsotypingKitI)測定抗體的類型、亞型和輕鏈的亞型。根據分型試劑盒分析，抗大豆球蛋白單克隆抗體細胞株4B2CGMCCNo.2791產生的單抗屬于含A輕鏈的IgG2。6.2.抗體的含量收集抗大豆球蛋白單克隆抗體細胞株4B2CGMCCNo.2791的培養液，然后采用夾心ELISA法測定培養液中的抗體濃度，以純化兔抗鼠IgG包被酶標板，洗滌后加入適宜濃度的兔抗鼠IgG-HRP識別抗大豆球蛋白單克隆抗體細胞株4B2CGMCCNo.2791所產生的單克隆抗體。以小鼠IgG的不同濃度為橫坐標，以對應的OD492值為縱坐標，繪制標準曲線。根據檢測各株雜交瘤細胞培養液的OD492值，計算出抗體的準確濃度。6.3.抗體的效價用步驟1的大豆球蛋白(50.(Hig/mL)包被酶標板。將純化的單抗(單抗的起始濃度為1.0mg/mL)進行倍比稀釋后，用間接ELISA方法測定抗體的效價，以未進行融合的SP2/0細胞的培養上清液為陰性對照。圖2是抗體的效價曲線圖，與OD柳值為l.O相對應的抗體效價為2.7x1(^(圖中每一個點代表在ELISA分析中8個重復測定的平均值)。6.4.單抗穩定性的檢測復蘇雜交瘤細胞，收集不同傳代次數的細胞上清，并用間接ELISA方法檢測其效價。結果表明抗大豆球蛋白單克隆抗體細胞株4B2CGMCCNo.2791不同代次能夠穩定產生單克隆抗體(以實施例1，步驟6.3所述的方法進行檢測，該細胞株第1代至第8代的抗體效價均高于lx104)。6.5.抗體親和力的測定(非競爭性ELISA)抗體的親和常數采用非競爭性ELISA法，操作程序除了加入系列稀釋的已知濃度的抗大豆球蛋白單克隆抗體細胞株4B2CGMCCNo.2791培養液外，其他同步驟2.3。以待測樣品的不同濃度為橫坐標，以其相應的OD492值為縱坐標，繪制三條測定曲線。以各曲線上部趨于平坦的OD492值為100%，計算00492值為50%時抗體的濃度[Ab]t，這樣每份待測樣品可得[Ab]t、[Ab]'t、[Ab]"t三個值，然后根據徐志凱(徐志凱主編，1991，實用單克隆抗體技術。西安陜西科學技術出版社。pp7-145)描述的方法計算，抗大豆球蛋白單克隆抗體細胞株4B2CGMCCNo.2791所產生的單克隆抗體的親和常數(《。)為3.3xl()8L/mo1。6.6.單抗的反應特異性(1)抗體與類似物交叉反應用競爭性ELISA測定大豆球蛋白與其結構或功能類似物之間的交叉反應。將抗大豆球蛋白單克隆抗體細胞株4B2CGMCCNo.2791所產生的單克隆抗體作適當濃度稀釋后，以等體積分別與系列倍比稀釋的大豆球蛋白、P-伴聚球蛋白、胰蛋白酶抑制因子和凝集素混勻后，室溫反應15min。然后加至已包被處理的酶標板中。其余步驟同2.3.。其中，用于ELISA分析的包被抗原(大豆球蛋白)濃度為50.0|ig/mL，大豆球蛋白單克隆抗體細胞株4B2CGMCCNo.2791所產生的單克隆抗體濃度為50ng/mL。根據00492值繪制標準曲線，確定IC5。(ng/mL)(ICso為抑制抗原抗體結合的50%時各競爭物濃度，表l中每個iq。代表12個重復測定的平均值)。按照如下公式計算各類似物的交叉反應率(即大豆球蛋白的IC5()與各競爭物IC5Q之比。交叉反應率CR(。/。)=(大豆球蛋白的IC50)/(某競爭物的ICso)xl00X。如表1所示。表l中第二列上一行的數值為ICso，以平均值±標準差表示，單位是ng/mL;下一行的數值是交叉反應率，單位是％。表l.抗體與大豆球蛋白及其結構類似物或相關物質的交叉反應<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>(2)用WesternBlot免疫印跡實驗檢測單抗與大豆球蛋白結合反應將大豆粗提蛋白和純化的大豆球蛋白進行10%SDS-PAGE電泳，按常規方法在Bio-Rad電轉移系統中將凝膠蛋白帶轉移到硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉在4°C封閉過夜，加入抗大豆球蛋白單克隆抗體細胞株4B2CGMCCNo.2791所產生的單克隆抗體。室溫反應lh，洗滌三次。隨后加入堿性磷酸酶標記的羊抗鼠IgG，室溫反應lh，洗滌三次。最后加入NBT/BCIP底物顯色。洗滌均用TBST，每次10min。結果如圖3所示，結果表明抗大豆球蛋白單克隆抗體細胞株4B2CGMCCNo.2791所產生的單克隆抗體與大豆球蛋白具有較強的特異性反應，條帶a:提取的大豆球蛋白粗樣品；條帶b:純化的大豆球蛋白樣品。ELISA和WesternBlot的結果都證明抗大豆球蛋白單克隆抗體細胞株4B2CGMCCNo.2791所產生的單克隆抗體能和大豆球蛋白發生強烈的結合反應，因此可以應用于的免疫學檢測和蛋白定量，以及其他的相關應用研究。實施例2:大豆球蛋白的雙抗夾心ELISA檢測方法以抗大豆球蛋白單克隆抗體細胞株4B2CGMCCNo.2791所產生的單克隆抗體對大豆球蛋白進行檢測可以包括如下試劑1)抗大豆球蛋白單克隆抗體細胞株4B2CGMCCNo.2791所產生的單克隆抗體按實施例1步驟5進行純化；2)抗大豆球蛋白的多克隆抗體。該多抗的制備、純化方法如下a.多抗的制備取實施例1制備的大豆球蛋白用生理鹽水配成5mg/mL，與等量弗氏佐劑混合，利用旋渦混合器使其乳化完全。選取健康雌性新西蘭大白兔，首次免疫為足內側上皮，注射完全佐劑乳化抗原，選兩個位點，每點0.5mL;首免后14天加強免疫，背部隨機選取4點，消毒后皮下注射不完全佐劑乳化抗原，0.5mL/點；以后每隔10d加強免疫一次，連續三次加強免疫。最后一次加強免疫后10d，在耳上選擇清晰的靜脈血管，注射腎上腺素0.1mL/只，過0.5h后，再往靜脈直接注射提純的抗原。待效價達到要求后，對兔子進行前腔靜脈采血，分離血清，-20°(3保存備用。b.多抗的純化同實施例1的步驟5。3)羊抗鼠IgG/HRP酶標二抗；4)大豆球蛋白標準品(可按照實施例l步驟l的方法進行制備純化)；5)包被緩沖液(組成同實施例1步驟2.3.(1));6)1%牛血清白蛋白封閉液(組成同實施例1步驟2.3.(2));7)洗滌緩沖液(組成同實施例1步驟2.3.(2));8)OPD底物液(組成同實施例1步驟2.3.(5));9)終止液(組成同實施例1步驟2.3.(6))。所建立的大豆球蛋白雙抗夾心ELISA定量檢測法的實驗過程包括以抗大豆球蛋白的多克隆抗體包被ELISA酶標板，順序加入待檢樣品、抗大豆球蛋白單克隆抗體細胞株4B2CGMCCNo.2791所產生的單克隆抗體、羊抗鼠IgG/HRP酶標二抗、OPD底物液、終止液，然后用酶標儀檢測各個孔內溶液的吸光值(OD492)。可以以大豆球蛋白為標準品，倍比稀釋加樣，根據吸光值讀數建立標準曲線。樣品孔吸光值比對標準曲線得出精確大豆球蛋白含量。具體的方法及操作如下(1)大豆樣品的處理如果待檢測的樣品為大豆或者顆粒飼料，需預先按照如下方法制備大豆脫皮后磨漿，過濾后乙醚萃取脫脂，經旋轉蒸發除去殘留乙醚，制得脫脂樣品，再溶于0.03mol/LTris墨HCl(含0.01mol/L的(5-巰基乙醇，pH8.0)中。如果待檢測的樣品為粉狀豆粕或者飼料，可直接將待測大豆樣品溶于0.03mol/LTris-HCl(含0.01mol/L的(3-巰基乙醇，pH8.0)中，并磁力攪拌2h，使大豆蛋白以游離的形式釋放出來，以便于用免疫學方法定量檢測其中大豆球蛋白的實際(2)包被多抗純化后的抗大豆球蛋白的多克隆抗體用0.05mol/LNaHCO3pH9.6配成2ug/ml，包被于96孔酶標板中，4"C過夜(200wL/孔)包被聚苯乙烯等固相，形成固相抗體。(3)封閉棄去酶標板孔內的液體。洗滌去除未與固相結合或結合不緊的抗體后，用1%牛血清白蛋白封閉液進行封閉，每個孔加入封閉液150)LiL。置濕盒中于37匸溫育lh后，用洗滌緩沖液洗滌3次，每次90s(簡稱洗滌，下同)，然后拍干。(4)加待測樣品用包被緩沖液將大豆球蛋白標準品稀釋成O、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0和16.0(ig/mL八個工作濃度。按酶標板縱順序將每一種濃度的標準品加入到酶標板孔中，然后加入每個待測樣品(每個樣品設10個濃度梯度，每個濃度設3個重復)。每個孔100nL，每個濃度梯度或者樣品至少設3個重復，同時設空白對照、陰性對照和陽性對照。置濕盒中于37'C烘箱孵育lh后，棄去孔內的液體，洗滌，拍干。(5)加一抗(單抗)用抗體稀釋液將抗大豆球蛋白單克隆抗體細胞株4B2CGMCCNo.2791所產生的單克隆抗體稀釋至最佳工作濃度(2.5|ig/mL)，用移液槍準確移至酶標板，每個孔100pL，置濕盒中于37'C溫育lh。棄去孔內液體，洗滌，拍干。(6)加酶標二抗用抗體稀釋液將酶標二抗(羊抗鼠IgG/HRP)稀釋到工作濃度(1:5000)，加入酶標板，每個孔100pL，置于37。C溫育lh后，棄去孔內的液體，洗滌，拍干。(7)加底物溶液向各酶標孔加新鮮配制OPD底物使用液100pL，37'C溫育15—30min。(8)終止反應每個孔加終止液50pL，終止底物顯色反應。(9)判定結果用酶標儀于492nm波長下測定孔內溶液的吸光值(OD492)，以標準品不同稀釋度所對應的吸光值(OD492)做圖，得出擬合曲線方程。然后把待測樣品孔的吸光值(OD492)帶入方程，可準確得出大豆球蛋白的濃度。經檢測，本研究開發出的大豆球蛋白的雙抗夾心ELISA檢測方法檢測范圍為0.02昭/ml10iig/ml;靈敏度為0.01^ig/ml;變異系數為板內變異系數為1.8%，板間變異系數為3.3%，批內變異系數為4.0%，批間變異系數為7.2%;樣品不同梯度的線性評估為R2《972。權利要求1、大豆球蛋白的單克隆抗體，由保藏號為CGMCCNo.2791的抗大豆球蛋白單克隆抗體細胞株4B2所產生。2、保藏號為CGMCCNo.2791的抗大豆球蛋白單克隆抗體細胞株4B2。3、含有權利要求1所述的大豆球蛋白的單克隆抗體的試劑盒。4、根據權利要求3所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒為酶聯免疫檢測試劑盒。5、將權利要求1所述的大豆球蛋白的單克隆抗體和固相載體相偶聯得到的免疫親和吸附劑。6、以權利要求5所述的免疫親和吸附劑為填料的免疫親和色譜柱。7、含有權利要求5所述的免疫親和吸附劑或權利要求6所述的免疫親和色譜柱的試劑盒。8、權利要求1所述的大豆球蛋白的單克隆抗體或權利要求3或4的試劑盒在如下1)或2)的應用1)在檢測大豆球蛋白中的應用；2)在分離純化大豆球蛋白中的應用。9、權利要求5所述的免疫親和吸附劑、權利要求6所述的免疫親和色譜柱或權利要求7所述的試劑盒在分離純化大豆球蛋白中的應用。10、大豆球蛋白的拮抗劑，它的活性成分是權利要求l所述的大豆球蛋白的單克隆抗體。全文摘要本發明公開了一種大豆球蛋白的單克隆抗體及其應用。本發明所提供的大豆球蛋白的單克隆抗體，由保藏號為CGMCCNo.2791的抗大豆球蛋白單克隆抗體細胞株4B2產生。用本發明的大豆球蛋白單克隆抗體檢測大豆球蛋白，克服了傳統的SDS-PAGE、多抗血清間接性ELISA檢測方法存在的不同實驗室之間不能參比、靈敏度和準確性低、需要重復免疫制備多抗血清的缺點，其檢測準確性接近反相高效液相法(RP-HPLC)，而且成本很低，可滿足飼料行業、食品行業相關企業單位高通量快速檢測大豆、豆粕、豆制品中大豆球蛋白含量的需要，在大豆制品抗原物質定量檢測和致過敏性的評估中具有廣闊的應用前景。文檔編號C07K16/16GK101445558SQ20081024100公開日2009年6月3日申請日期2008年12月24日優先權日2008年12月24日發明者于貴平,尹靖東,李德發,王軍軍,王鳳來,賀平麗,曦馬申請人:中國農業大學