專利名稱：抗阿爾茨海默病單克隆抗體及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種新型抗阿爾茨海默病單克隆抗體。本發明還涉及所述單克隆抗體在制 備阿爾茨海默病的診斷試劑和治療藥物中的應用。
背景技術：
-
阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,以下簡稱AD)是全世界60歲以上老年人癡呆 的最主要原因。AD的早期診斷、預防和治療具有重大意義。自1975年Kohler和Milstein 創建B淋巴細胞雜交瘤技術以來，各種單克隆抗體相繼出現，用于疾病診斷治療的基礎與 臨床研究，發揮了重大作用。
已知AP寡聚體是引起AD早期病理和學習記憶行為改變的主要原因。1999年Schenk 等用A(342分子為多肽疫苗免疫PDAPP轉基因小鼠，經過治療，幼年小鼠腦內沒有產生p-淀粉樣斑塊沉積、神經細胞萎縮等AD的典型病變。已經發病的老齡鼠，治療后病變明顯 減輕。2001年人工合成的AP1-42疫苗(AN1792)進行了臨床IIa期實驗。不幸的是在接 受治療的患者中有6%出現了腦膜炎。由于治療可能存在的副作用，該療法在2002年的1 月被全面停止。臨床結果顯示，在接受治療一年后，體內產生針對AP斑塊抗體的患者與 沒有產生抗體的患者相比，認知能力下降速度減慢。患者的尸檢結果顯示在大腦皮層中沒 有或只有少量的A卩斑塊，在斑塊消失部位發現反應性小膠質細胞，同時發現有IgG結合 到斑塊上。
從此以后，眾多學者開始采用針對AP分子的免疫療法來治療或預防AD，取得了不同 程度的療效。但現有技術的免疫方式及效果仍不夠理想，尤其是不能特異性識別特定的AP 寡聚體。在免疫治療實驗中，有可能與纖維結合，發生腦出血等副反應。
因此，研制特異性識別和結合AP寡聚體的單克隆抗體，確有必要。

發明內容
本發明的目的是提供一種抗阿爾茨海默病單克隆抗體，直接目的是提供抗人A卩單克 隆抗體，能夠特異性識別和結合AP寡聚體，可用于制備阿爾茨海默病的診斷試劑和治療 藥物。本發明制備了寡聚體高親和性抗人A(3單克隆抗體，取名為A8。本發明人使用5' RACE的方法克隆到Ap寡聚體高親和性單抗A8輕鏈、重鏈可變區 基因。根據抗體恒定區CH-1區的最保守的一段序列設計引物，進行反轉錄，在cDNA產 物的5'端加上Poly(C)尾巴，然后使用針對多聚脫氧核苷酸尾巴設計的錨定引物與基因特 異性引物通過PCR方法將目的基因擴增出來。序列分析表明，A8抗體輕鏈和重鏈可變區 序列與已經提交的小鼠IgG可變區序列同源性達90。/。與92%。可以確定所得到的序列為 抗體輕鏈和重鏈可變區序列，而非其它基因的序列。所得VH和VL基因可編碼正確的小 鼠抗體可變區。
A8重鏈和輕鏈可變區基因是從能夠分泌較高活性的鼠源性寡聚體高親和性抗AP單抗 的雜交瘤細胞株中克隆的。其中所述的重鏈可變區基因全長為450bp,所述的輕鏈可變區 基因全長為429bp，兩個基因重組后可用于表達特異性識別和結合AP寡聚體的抗體活性 片段。
抗A(3寡聚體單抗A8輕、重鏈可變區基因的克隆。
分泌產生上述抗阿爾茨海默病單克隆抗體的細胞株為北京交通大學生命科學與生物 工程研究院采用傳統的骨髓瘤與脾細胞融合的方法獲得的一株Ap寡聚體高親和性的鼠源 性抗人A(3單抗雜交瘤細胞株，命名為A8，其抗原為A(31-42聚集物，其分泌的抗體分子 亞型為IgG3。
所述A8雜交瘤細胞己經在中國典型培養物保藏中心(CCTCC)保藏。
所述抗人Ap單克隆抗體A8的重鏈與輕鏈可變區如SEQ ID NO:l SEQ ID NO:4所
示。其中
SEQ ID NO:l是抗人A(3單克隆抗體重鏈可變區DNA序列； SEQ ID NO:2是抗人A(3單克隆抗體重鏈可變區氨基酸序列。
SEQ ID NO:3是抗人Ap單克隆抗體輕鏈可變區DNA序列； SEQ ID NO:4是抗人A(3單克隆抗體輕鏈可變區氨基酸序列。
本發明在制備抗人AP單克隆抗體及其性質和功能鑒定中進行了如下實驗 1、抗原制備及抗體性質的鑒定
A卩寡聚混合物(即本發明所用的免疫抗原)的制備(見實施例1， "1.A(3寡聚混合物 的制備")。其亞類為IgG3，抗原識別表位在A(3多肽N端l-6位氨基酸。
可溶性A卩M2寡聚體是最主要的AD早期致病因子，對神經元的毒性最強。目前，關于診斷和治療用途的針對16.5-25KDAPl42寡聚體単抗，目前尚未見報道。
2、 間接ELISA實驗
結果表明A8可以很好識別以堿性包被液包被于96孔板的A(3寡聚混合物。最低檢 測限為0.625嗎/ml (見實施例2)。 用于ELISA的最佳稀釋度為1:106。
3、 免疫印跡(Westernblot)實驗
結果表明A8可以很好識別以SDS-PAGE分離，轉移在硝酸纖維素膜的A|3寡聚混 合物，主要識別16.5-25KD的寡聚物(見實施例3)。 用于蛋白質免疫印跡的最佳稀釋度為1:4,000。
4、 免疫組化實驗
單抗A8可以特異性識別快速老化癡呆模型小鼠(Senescence Accelerated Mouse P8, SAMP8)腦組織的A卩寡聚體。結果顯示染色清晰，定位準確，基本沒有背景干擾。在 進行免疫組化過程中，無須抗原修復(見實施例4)。
5、 Morris水迷宮檢測
結果顯示A8可以改善SAMP8的學習記憶能力(見實施例5)。
6、 單抗A8可變區基因的克隆
利用5'RACE的方法擴增抗AP寡聚體單抗A8輕、重鏈可變區基因(見實施例6)。
用本發明獲得的抗人AP單克隆抗體，利用雙抗體夾心ELISA法(酶聯免疫吸附試驗)、 Western blot實驗、免疫組化等實驗方法，可以分別制備三種不同方法的檢測阿爾茨海默 病的試劑。
基于上述巳克隆到的抗人Ap寡聚體單抗A8輕、重鏈可變區基因，可以采用基因工程 方法，構建和/或表達多種小分子基因工程抗體的載體、細胞株和抗體，如單鏈抗體、嵌 合抗體、Fab抗體等，以便用于AD診斷、預防和治療的基礎與臨床研究和應用。因此， 所述抗人AP單克隆抗體還可以制備成為藥物，用于診斷、預防和治療阿爾茨海默病。
本發明的優點
首先，本發明用于免疫的抗原為APm2寡聚體混合物，免疫效果好，小鼠免疫血清效 價高。這一點優于常用的"多肽偶聯載體蛋白方法"。
其次，提供的抗阿爾茨海默病單克隆抗體A8特異性識別16.5-22KD的Ap寡聚體，具有AD早期診斷的應用前景。由于A8特異性識別可溶性AP寡聚體，在免疫治療實驗 中，有可能避免與纖維結合，從而降低腦出血等副反應。


圖1為體外制備A(3寡聚體抗原。圖中M為蛋白質分子量標記(Marker), 1為分子量 標記蛋白質電泳結果，2為AP寡聚體混合物電泳結果。
圖2為抗A(3寡聚體單抗A8純化后的重、輕鏈。圖中1為蛋白質分子量標記(Marker), 2為單抗A8的重鏈和輕鏈。
圖3為單抗A8的檢測靈敏度。
圖4為單抗A8和商品化單抗6E10對A (3寡聚體識別的差異。1:蛋白質分子量Marker; 2:檢測抗體為A8; 3:檢測抗體為6E10。
圖5為單抗A8特異性識別快速老化癡呆模型小鼠大腦皮層及海馬區A(3的情況。
圖6為Morris水迷宮檢測結果，圖中，橫坐標為治療后的時間(第1， 2， 3， 4， 5 天)，縱坐標為各組找到平臺小鼠的數目(單位只)。
圖7為RT-PCR擴增的抗Ap寡聚體單抗A8輕、重鏈可變區基因的瓊脂糖凝膠電泳圖， 圖中M為DL-2000DNA分子量Marker, 1為A8重鏈可變區基因，2為A8輕鏈可變區基 因。
生物材料保藏信息
培養物名稱雜交瘤細胞株A8
保藏編號 CCTCC一C200926
保藏單位中國典型培養物保藏中心 保藏時間2009年4月15日
具體實施例方式
實施例1寡聚體高親和性抗人AP單克隆抗體A8的制備 l.Ap寡聚混合物的制備
A(3M2肽由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。參照文獻(Lambert M, 1998)
方法，并且進行必要的調整，將其在近似天然的條件下體外組裝得到A卩M2寡聚混合物。
先將A卩M2肽lmg溶于冰預冷的六氟異丙醇(l,l,l,3,3,3-hexafluoro-2-propannol, HFIP)(Sigma)，使APw2肽單體化，室溫，lh后使HFIP揮發殆盡。然后用無水二甲基亞砜 (DMSO) (Sigma) 20^tl溶解A(31-42單體，最后將其置于F12培養基(Sigma)或磷酸鹽
緩沖體系(體積相應補足lml)、置4。C， 24 h，使其自然聚合，用Western blot檢測A卩M2
寡聚混合物的制備情況(見圖1)。
2. 小鼠的免疫接種
取6-8周齡雌性BALB/c小鼠5只。分別用Ap寡聚混合物共進行4次免疫首次按 50pg/只劑量將A卩寡聚混合物與等體積福氏完全佐劑(Sigma)混勻后，腹腔注射。間隔 2周后重復注射，使用福氏不完全佐劑(Sigma)，偶聯多肽劑量為30pg/只。間隔2周后 重復一次；再間隔兩周，用純抗原50嗎進行脾內加強免疫，3-4d后取脾融合。
3. 飼養細胞的制備取6-8周齡BALB/c小鼠，引頸處死，無菌條件下RPMI 1640 培養液(Sigma)沖洗腹腔數次，將沖洗液2000rpm，離心10min。棄上清，用含20%小 牛血清的RPMI 1640培養液懸浮沉淀，細胞計數，調整細胞濃度為1()S個/ml，加入96孔 板中，IOO一孔，置于37匸，5%(302培養箱中孵育。
4. 細胞融合取強化免疫3-4d的小鼠，眼球放血后，收集血清，拉頸處死，無菌取出 脾臟，制成單細胞懸液后，按10:1的比例將脾細胞與處于對數生長期的Sp2/0細胞(經 8-氮鳥嘌呤，即8-Azaguanine，簡稱8-AG篩選)混合，1000rpm離心10min，棄上清，輕 彈管底使沉淀細胞呈糊狀，37。C水浴中加入0.7ml 50% PEG 4000 (polyethylene glycol, Sigma)，邊加邊旋轉離心管，使細胞保持混勻狀態，lmin力n完，37。C水浴中靜置90s，立 即緩慢加入20ml RPMI 1640液，800rpm離心8min，棄上清，加入含20%小牛血清(杭 州四季青生物工程材料有限公司)、2%HAT (Sigma)、 1%青鏈霉素(Sigma)的1640培養 液，輕輕混勻，調整細胞濃度為2xl()S個/ml，加入已備有飼養細胞的96孔板中，100-孔，置于37。C， 5。/。C02培養箱中孵育，逐日觀察細胞生長情況，1周后補加含20%小牛 血清、1%HT (Sigma)、 1%青鏈霉素的RPMI 1640培養液，按下列公式計算克隆生長率。
克隆生長率(％)=(細胞克隆生長孔/接種孔)xl00%
5. 陽性克隆的篩選及亞克隆
待細胞克隆長至視野的1/3時(顯微鏡放大倍數4X10)，小心吸取細胞上清液，10 y g ml"AP寡聚混合物為包被抗原，ELISA方法檢測上清中的抗體，具體方法及判斷標 準見"4.細胞融合"，按下列公式計算克隆陽性率。
克隆陽性率(％)=(抗體陽性？L/檢測的細胞克隆生長孔)X100% 采用有限稀釋法對抗體分泌陽性的孔進行反復克隆化，至所有單克隆孔上清抗體陽性率為100%。
6. 雜交瘤細胞株的建立
將克隆化的陽性克隆移入24孔板、6孔板和T25細胞培養瓶，擴大培養60-90d并建株。
7. 單克隆抗體的亞類鑒定
按照Sigma公司的小鼠IgG亞類鑒定試劑盒(Sigma)操作雜交瘤細胞株分泌單抗A8 的IgG亞類為IgG3。
8. 單克隆抗體的表位分析
使用競爭ELISA法測定單克隆抗體的抗原識別表位將單克隆抗體與濃度梯度的各 個肽段(A(31-6， A)31-11， A卩12-28)孵育lh后加入到包被有A卩寡聚體的酶標板上進行 間接ELISA檢測。結果表明其表位為N端多肽A|31-6。
9. 單抗的大量制備及純化
接種雜交瘤細胞至降植垸(Sigma)預處理的BABL/c小鼠腹腔，1><107個雜交瘤細胞 /只，7-10天后抽取腹水，使用AKTA explorelOO蛋白層析系統通過Protein A親和層析柱 純化單克隆抗體，見圖2。用BCA試劑盒(美國PIERCE公司)測定抗體濃度，為3mg/ml。
實施例2間接ELISA實驗
1.方法
(1) 包被lOug .ml"A卩寡聚混合物為包被抗原，加入酶標板(SUNRISE公司)中， 每孔100ul， 4'C過夜。
(2) PBS-T (NaC18g， KC1 0.2g， Na2HP04. 1.44g， KH2P04. 0.44g， Tween-20 0.05ml， 補ddH20至lL， pH7.2 7.4)洗板3次，每次5min。
(3) 封閉加含0,2。/。BSA的PBS-T，每孔100ul。 37°C， 2h。
(4) 將倍比稀釋的單抗A8，加入96孔板中，每孔100ul。 37°C， 2h。同時設空白對 照、陰性對照和陽性對照(分別用小鼠抗人AP血清、Calbiochem公司的抗人A(31-17)。
(5) PBS-T洗板3次，每次5min。
(6) 加1:10000稀釋的HRP標記的羊抗鼠IgG (北京中杉金橋生物技術有限公司)，每 孔100 ul。 37°C， lh。
(7) PBS-T洗板3次，每次5min。
(8) 加底物TMB，每孔100 y 1， 20 min后，450nm波長檢測J值。陽性判斷標準如下
(樣品孔^值-空白對照^值)/ (陰性對照孔^值-空白對照J值)>2檢測的最大稀釋度為該抗體的效價。2.結果與結論
應用我們制備的單抗A8能夠識別包被的A卩寡聚混合物。最低檢測限為0.625 pg/ml。見圖3。
上述結果說明單抗A8能夠有效識別體外組裝的A卩寡聚混合物，其反應靈敏度較好。
實施例3免疫印跡(Western blot)實驗
1. 方法
取50 100嗎樣品，5x樣品緩沖液，混勻后上樣，先以100V電壓使蛋白通過濃縮膠。當樣品進入分離膠時，調節電壓使其恒定在120V。當溴酚藍泳動至凝膠底部時，結束電泳，取下凝膠，常規用考馬斯亮藍R-250染色法染色；將凝膠和硝酸纖維素膜分別放入裝有印跡緩沖液的容器里平衡10min，依次在放入濾紙、凝膠、NC膜、濾紙，成"三明治"狀，倒入轉膜緩沖液，膠面朝負極，NC膜面朝向正極，小心避免并趕去氣泡。接通電源，使恒流80mA連續轉移2h，切斷電源。
轉膜結束后，用麗春紅S染色液(10X麗春紅S貯存液配制方法為稱取麗春紅S2g,三氯乙酸30g,璜基水楊酸30g,加水至100ml;用時按照1: 10的比例用用去離子水稀釋)確定蛋白條帶位置，做相應的標記。用封閉液封閉硝酸纖維素膜(稱取脫脂奶粉5g，溶于0.1mol/LPBST (NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4. 1.44g，KH2P04. 0.44g，Tween-20 0.05ml,補ddH20至1L， pH7.2 7.4) 100ml), 4"封閉過夜。用封閉液液稀釋單抗A8，濃度一般為0.2~lng/ml,于4r孵育12-14 h，或于20 37'C孵育2 h。用O.lmol/L PBST洗滌硝酸纖維素膜4次，每次5 10min。用PBS稀釋HRP標記的二抗，稀釋度為1: 1000，室溫孵育lh。用O.lmol/L PBST洗滌硝酸纖維素膜4次，每次5 min。按照P正RCE化學發光試劑盒說明，將A液和B液等體積混合，加在硝酸纖維素膜上，2-5min后，用X光片曝光顯影，觀察結果。用Quantity One software (BIO-RAD)軟件進行條帶半定量。
2. 結果與結論
Western Blot結果，純化的A8主要識別低分子量寡聚體(以識別寡聚混合物中16.5KD左右成分)，此外與單體、高分子量寡聚體和原纖維又交叉反應。6E10對單體、低分子量寡聚體、高分子量寡聚體和原纖維的識別沒有差異。見圖4。
上述結果說明，單抗A8對AP寡聚混合物中16.5KD左右成分反應最強，與6E10對寡聚混合物的識別效果明顯不同。單抗A8可以利用Western Blot進行樣本的Ap檢測。
實施例4免疫組化實驗1.方法
(1) 脫蠟、水化。
(2) PBS洗兩次各5分鐘
(3) 用蒸熘水或PBS配置新鮮的3%H202,室溫封閉5 10分鐘，蒸餾水洗3次。
(4) 抗原修復。
(5) PBS洗5分鐘。
(6) 滴加正常山羊血清封閉液，室溫20分鐘。甩去多余液體。
(7) 滴加單抗A8，室溫1小時或者(C過夜或者37。C1小時(4。C過夜后在37。C復溫45分鐘)。
(8) PBS洗三次每次2分鐘。
(9) 滴加生物素化二抗(山羊抗小鼠IgG)， 20。C 37。C20分鐘。
(10) PBS洗3次每次2分鐘。
(11) 滴加試劑SABC， 2(TC 37'C20分鐘。
(12) PBS洗4次每次5分鐘。
(13) DAB顯色DAB顯色試劑盒或者自配顯色劑顯色(鏡下掌握顯色程度)。
(14) 蒸餾水洗。蘇木素復染2分鐘、鹽酸酒精分化。
(15) 脫水、透明、封片、鏡檢。
\丄結果與結論
結果顯示，皮質與海馬區染色清晰，定位準確，背景較低。見圖5。單抗A8可以作為腦皮質與海馬區A(3檢測的抗體。
實施例5 Morris水迷宮檢測
1、 實驗目的檢測單抗A8對快速老化癡呆模型小鼠的治療作用
2、 實驗動物
實驗動物SAMP8購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，委托北京大學醫學部醫學實驗動物中心飼養。分組情況如下
按照注射藥物不同分為抗體A8治療組、小鼠非特異性IgG注射組、生理鹽水注射組、SAMP8空白對照組，每組12只。
3、 實驗方法
參照文獻(Lee EB, 2006)的方法，以單抗A8腹腔注射8月齡雄性SAMP8小鼠(400(ag/只)，每周1次，治療8周以后，進行Morris水迷宮檢測(在北京大學醫學部醫學實驗動物中心完成)。
Morris水迷宮檢測歩驟
(1) 設計特制的水迷宮主要由一圓柱型水池和一可移動位置的平臺組成。水池高70cm，直徑80cm，平臺直徑8cm，水池上空通過一個數字攝相機與計算機相連接。
(2) 預先在水池中注入清水，水深15cm，池壁及池底均為黑色，使池水變為不透明的黑色，平臺表面為黑色，使小鼠不能看到，水面高出平臺表面0.5cm。
(3) 水溫控制在22士0.5。C，在水池上標定相同一點作為每次實驗小鼠的入水點。每個象限對應的側壁上粘貼不同形狀的標志。平臺置于離入水點較遠的象限中間，實驗過程保持平臺位置不變。
(4) 每次實驗在隔音的房間內進行，水池，光源，鼠籠等實驗室各物件的位置保持不變。
(5) 治療結束后第3天開始訓練，如果動物在120s內找到平臺，讓其在平臺上停留20s，如果動物沒有找到平臺，將其放在平臺上使其停留20s。
(6) 每次實驗以120s為限，紀錄每次各組動物能夠到達平臺的小鼠只數。若設定時間內未找到平臺，計算機停止跟蹤，記錄時間為120s。
(7) 于治療結束后4、 5、 6、 7、 8天繼續學習和測試，記錄每組小鼠找到平臺的情況。
4、 結果
A8治療組學習記憶改善情況明顯優于小鼠非特異性IgG注射組、生理鹽水注射組、SAMP8空白對照組。各組找到平臺小鼠的數目情況，測試第1天至第5天分別為A8治療組(0、 2、 3、 4、 4只)；非特異性IgG注射組(1、 1、 0、 0、 0)、生理鹽水注射組、SAMP8空白對照組(0、 0、 1、 1、 0)見圖6 (橫坐標為治療后的天數，縱坐標為各組找到平臺小鼠的數目)。
5、 結論
單抗A8有改善快速老化癡呆模型小鼠學習記憶能力的作用。基因的克隆
取處于對數生長期的A8雜交瘤細胞(5xl06)，采用Trizol試劑法提取雜交瘤細胞株A8的總RNA，取少量進行紫外分光光度計定量及1%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳。利用5'RACE的方法擴增抗AP寡聚體單抗A8輕、重鏈可變區基因。分別跟據小鼠IgG輕鏈和重鏈恒定區CH-1區基因序列設計基因特異性引物L-GSP1:ACTGGATGGTGGGAAGATGG禾Q H-GSP1: CAGTGGATAGACCGATGGGGG。根據試齊U盒說明書以總RNA為模板，分別以L-GSP1和H-GSP1為引物，使用SuperScripII反轉錄酶合成cDNA第一鏈。反轉錄反應方案為總RNA5嗎，GSP 100n mol/L，補加無Rnase水至18iaL， 70。C孵育10min后立即置冰浴上；繼續向反應液中加入10xbuffer2.5pL， 25mmol/L MgCl2 2.5pL， 10m mol/L dNTP lpL， 42。C孵育lmin后加入lpL 200U/^L SuperScrip II反轉錄酶，42。C反應50min， 7CTC孵育10min。反轉錄完畢后加入RNase水解RNA，使產物中只含有cDNA第一鏈。使用S.N.A.P離心柱純化cDNA第一鏈，然后通過末端脫氧核苷酸轉移酶TdT以dCTP為底物向cDNA第一鏈5'端加上Poly(C)尾巴。
分別用 以 AAP:GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG 與L-GSP2:GGGGAA GATGGATACAGTTGGTGCAGC 禾P AAP 與 H-GSP2GATAGCCGATGGGGGTGTTGTTT TGG兩對引物以已經加上Poly(C)尾巴的cDNA第一鏈為模板擴增抗體輕鏈和重鏈(VL、 VH)可變區基因。擴增產物VH (約450bp)和VL(約429bp)經瓊脂糖凝膠(1.5%)電泳鑒定，見圖7。用PCR產物純化試劑盒(Omega)回收純化后，將目的片段克隆至T載體，測序分析(見序列表l-4)。
PCR擴增反應按照常規方法進行以上述產物為模板，分別用重鏈和輕鏈引物擴增抗體輕、重鏈可變區基因。反應體系為cDNA5nL，上下游引物(10mmol/L)各1 u L，10m mol/L dNTP 2 y L， 10 X buffer 5 u L，補加雙蒸水至50 u L， Ex Taq DNA聚合酶1.25^1，加水至50nl，混勻，瞬時離心后，置PCR儀內反應。PCR條件為95預變性5 min，循環參數為94變性40s， 55退火40s， 72延伸1 min，共30個循環，最后72延伸51 min。
目的片段T載體克隆測序方案如下將PCR產物以試劑盒(Omega)純化回收后，連入pMD18-T載體。連接反應體系為pMD18-T載體1^1， PCR產物純化重鏈(或輕鏈)4^1，連接緩沖液5pl，混勻后置4"C過夜，轉化大腸桿菌DH5ot，篩選重組克隆并測序。
抗A(3寡聚體單抗A8輕、重鏈可變區基因在制備用于診斷、預防和治療AD的試劑(盒)及藥物中的應用
抗A(3寡聚體單抗A8輕、重鏈可變區基因應用方面的研究主要有(1)建立可用于分析A(3寡聚體的夾心ELISA法；(2)AD的預防及早期治療研究用于低齡SAMP8或Tg2576轉基因鼠等AD動物模型，靜脈、腹腔或頓內注射抗A(3寡聚體單抗A8輕、重鏈可變區基因相關的多肽或抗體，通過觀察學習記憶行為學、組織病理學以及分子細胞生物學改變，得到實驗室數據；(3) AD的治療研究用于高齡或老年SAMP8或Tg2576轉基因鼠等AD動物模型，靜脈、腹腔或顱內注射抗A(3寡聚體單抗A8輕、重鏈可變區基因相關的多肽或抗體，通過觀察學習記憶行為學、組織病理學以及分子細胞生物學改變，得到實驗室數據；(4); A(3寡聚體單抗A8輕、重鏈可變區基因相關的多肽或抗體用于各期臨床試驗研究；(5) AP寡聚體單抗A8輕、重鏈可變區基因相關的多肽或抗體應用的副作用及并發癥研究。(腦膜腦炎、出血)。
以本發明所述的輕、重鏈可變區基因重構成一定形式的蛋白藥物，可以直接用于AD的診斷及免疫治療。
以本發明所述及的輕、重鏈可變區基因編碼的多肽，可重組成的新型抗體主要有下列幾種形式(1)嵌合抗體是用鼠MAb的V區與人IgG的C區連接而成為人-鼠嵌合抗體。由于其完整地保存了鼠MAb的特異性和親和力，同時降低了HAMA等不良反應，故在免疫治療中顯示出良好的效果。(2)人源化抗體針對可變區基因結構的人源化改造，包括CDR移植、表面氨基酸殘基修飾、骨架區交換、定位保留和表位導向選擇等，從而不但降低了可變區的鼠源性同時又保持了鼠MAb的特異性和親和力。(3)小分子抗體主要有由VH-CH1和VL-CH1組成的Fab抗體、用一條多肽(Gly4Ser) 3接頭連接VH基因和VL基因而成的單鏈抗體、由VH和VL以非共價鍵結合而成Fv片段抗體、由VH或VL—個功能結構域組成的單域抗體、由單個CDR構成的最小識別單位等。(4)多價微型抗體主要有雙鏈抗體(ScFv) 2、 Flex微型抗體、LD微型抗體、F (ab') 2、 F (ab，)3、 (ScFv)4等。由于有多價抗原結合位點，親和力高，分子大小適中，在腎臟中的清除率較慢的特點而具有較高的臨床應用價值。(5)雙特異性抗體是一類具有雙重特異性和雙重功能的抗體，又稱雙功能抗體。(6)重組抗體融合蛋白把Fab或Fv等基因片段，與非抗體的核酸或酶等其它生物功能分子連接形成的具有靶特定的生物活性重組蛋白。(7)噬菌體抗體把Ig的V區基因與絲狀噬菌體DNA上基因III或基因VIII連接經轉染宿主菌后，使其在膜表面外殼蛋白表達Fab或ScFv的融合蛋白產物。通過對此產物多輪相關抗原的親和吸附，從中篩選出所需的特異性抗體。
以本發明所述及的輕、重鏈可變區基因編碼的多肽，以及重構成一定形式的抗體，進行各種酶、生物素、熒光(Cy3、 Cy5等)等標記。在上述研究的基礎上，利用合成或原核表達的AP及寡聚化的Ap作為標準抗原樣品，建立夾心ELISA法分析最適的包被抗體及濃度，最適的生物素化的檢測抗體(Ap寡聚體特異性單克隆抗體)及濃度，同時以辣根過氧化物酶標記的親和素和TMB為檢測系統，獲得可溶性A(3寡聚體夾心ELISA分析方法，建立AD早期診斷方法的實驗室標準。
以上述由輕、重鏈可變區基因編碼的多肽重組或衍生的抗體分子組裝的AD以及AD相關疾病診斷試劑盒。抗阿爾茨海默病單克隆抗體序列表.txt
<110〉北京交通大學〈120〉抗阿爾茨海默病宇.克隆抗體<130> BioEdit-Lasergene<160〉 4
<170〉 Patentln version 3.5〈210> 1<211> 1039<212〉 腿
<213〉 人(Homo sapiens)〈400> 1
GGGCTCGTAG TGCAGCTTGC ATGCCTGCAG GTCGACGATT TATGCGGCCG CATGGACAGG 60CTTACTTCTT CATTCCTGCT GCTGATTGTC CCTGCATATG TCTTGTCCCA AGTTACTCTA 120AAAGAGTCTG GCCCTGGGAT ATTGAAGCCC TCACAGACCC TCAGTCTGAC TTGTTCTTTC 180TCTGGGTTTT CACTGAGCAC TTCTGGTATG GGTGTAGGCT GGATTCGTCA GCCTTCAGGG 240AAGGGTCTGG AGTGGCTGGC ACACATTTGG TGGGATGATG ATAAGTACTA TAACCCATCC 300CTGAAGAGCC GGCTCACAAT CTCCAAGGAT ACCTCCAGAA ACCAGGTATT CCTCAAGATC 360ACCAGTGTGG ACACTGCAGA TACTGCCACT TACTACTGTG CTCGAAGGGG GATCTACTAT 420GATTACGACA ACTTTAACTA CTGGGGCCAA GGCACCACTC TCACAGTCTC CTCAGCCAAA 480ACAACACCCC CATCGGTCTA TCGGATCCCT CAATCTCTAG AGGATCCCCG GGTACCGAGC 540TCGAATTCGT AATCATGGTC ATAGCTGTTT CCTGTGTGAA ATTGTTATCC GCTCACAATT 600CCACACAACA TACGAGCCGG AAGCATAAAG TGTAAAGCCT GGGGTGCCTA ATGAGTGAGC 660TAACTCACAT TAATTGCGTT GCGCTCACTG CCCGCTTTCC AGTCGGGAAA CCTGTCGTGC 720CAGCTGCATT AATGAATCGG CCAACGCGCG GGGAGAGGCG GTTTGCGTAT TGGGCGCTCT 780TCCGCTTCCT CGCTCACTGA CTCGCTGCGC TCGGTCGTTC GGCTGCGGCG AGCGGTATCA 840GCTCACTCAA AGGCGGTAAT ACGGTTATCC ACAGAATCAG GGGATAACGC AGGAAAGAAC 900ATGTGAGCAA AAGGCCAGCA AAAGGCCAGG AACCGTAAAA AGGCCGCGTT GCTGGCGTTT 960TTCCATAGGC TCCGCCCCCC TGACGAGCAT CACAAAAATC GACGCTCAAG TCAGAGGTGG 1020CGAAACCCGA CAGGACTAT 1039
<210> 2
<211〉 346
<212> PRT
<213〉 人(Homo sapiens)<400〉 2
Leu Ala Cys Leu Gin Val Asp Asp Leu Cys Gly10 15 '
Thr Ser Ser Phe Leu Leu Leu lie Val Pro Ala
25 30Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly lie Leu
40 45Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser
55 60Met Gly Val Glv Trp lie Arg Gin Pro Ser Gly70 75 80
Leu Ala His lie Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr
90 9^Lys Ser Arg Leu Thr lie Ser Lys Asp Thr Ser
105 110Leu Lys lie Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr
120 125Ala Arg Arg Gly lie Tyr Tyr Asp Tyr Asp Asn
135 liOGin Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys150 155 160
Val Tyr Arg lie Pro Gin Ser Leu Glu Asp Pro
170 175Asn Ser End Ser Trp Ser End leu Phe Pro Val
185 190Leu Thr lie Pro His Asn lie Arg Ala Gly Ser
200 205Trp Gly Ala End End Val Ser End Leu Thr Leu2l5 220
GlyLeuValValGin
15
ArgMetAspArgLeu
20
TyrValLeuSerGin
35
LysProSerGinThr
50
LeuSerThrSerGly
65
匕ysGlyLeuGluTrp
85
TyrAsnProSerLeu
100
ArgAsnGinValPhe
115
AlaThrTyrTyrCys
130
PheAsnTyrTrpGly
145
ThrThrProProSer
165
ArgValProSerSer
180
EndAsnCysTyrPro
195
lielysCysLysAla
2'10抗阿爾茨海默病單克隆抗體序列表.txt
lieAlaLeuArgSerLeuPro Ala PheGinSerGlyAsnLeuSerCys
225230235240
GinLeuHisEndEndlieGly Gin ArgAlaGlyArgGlyGlyLeuArg
245250255
lieGlyArgSerSerAlaSer Ser LeuThrAspSerLeuArgSerVal
260265270
ValArgLeuArgArgAlaVal Ser AlaHisSerLysAlaVallieArg
275280285
LeuSerThrGluSerGlyAsp Asn AlaGlyLysAsnMetEndAlaLys
290295300
GlyGinGinLysAlaArgAsn Arg l>ysLysAlaAlaLeuLeuAlaPhe
305310315320
PheHisArgLeuArgProPro Asp GluHisHisLysAsnArgArgSer
325330335
SerGinArgTrpArgAsnPro Thr GlyLeu
340 345
<210〉 3
<211> 1045
〈212〉 DNA
<213> 人(Homo sapiens)
〈400〉 3
ATGAAAAACG
TTGCCTGTTA
ATGACCCAAA
AGATCTAGTC
AAACCAGGCC
CCAGACAGGT
GAGGCTGAGG
GGTGCTGGGA
CCCGAATTCT
CATAGCTGTT
GAAGCATAAA
TGCGCTCACT
GCCAACGCGC
ACTCGCTGCG
TACGGTTATC
AAAAGGCCAG
CTGACGAGCA
AAAGATACCA
TCAGTGCAAGGGCTGTTGGTCTCCACTCTCAGAGCATTGTAGTCTCCAAATCAGTGGCAGATCTGGGAATCCAAGCTGGAAGAATCTCTATCCTGTGTGAGTGTAAAGCCGCCCGCTTTCGGGGAGAGGCCTCGGTCGTTCACAGAATCAGAACCGTAAATCACAAAAATGGCGTTTCCC
CTTGCATGCCGCTGATGTTCCCTGCCTGTCACATAGTAATGCTCCTGATCTGGATCAGGGTTATTACTGCGCTGAAACGGGAGGATCCCCAATTGTTATCTGGGGTGCCTCAGTCGGGAAGGTTTGCGTACGGCTGCGGCGGGGATAACGAAGGCCGCGTCGACGCTCAACCTGG
TGCAGGTCGATGGATTCCTGAGTCTTGGAGGGAAACACCTTACAAAGTTTACAGATTTCATTTCAAGGTTGCTGATGCTGGGGTACCGAGCGCTCACAATAATGAGTGAGACCTGTCGTGTTGGGCGCTCGAGCGGTATCCACGAAAGAATGCTGGCGTTGTCAGAGGTG
CGATTMGAACTTCCAGCAGATCAAGCCTCATTTAGAATGCCAACCGATTCACTCAAGATCACGTGTTCCCACCAACTGTCTCGAATTCGTCCACACAACCTAACTCACACCAGCTGCATTTCCGCTTCCAGCTCACTCACATGTGAGCATTTCCATAGGGCGAAACCCG
GCTTATG艦TGATGTTTTGCATTTCTTGCGTACCTGCAGTTCTGGGGTCCAGCAGAGTGGCTCACGTTCATCCATCTTCTAATCATGGTATACGAGCCGTTAATTGCGTTAATGAATCGTCGCTCACTGAAGGCGGTAAAAAGGCCAGCCTCCGCCCCCACAGGACTAT
60
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960
1020
1045
〈210〉 4<211> 348
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)〈400> 4
MetLysAsnValSerAlaSerLeuHisAlaCys ArgSerThrlieLys
151015
LysLeuMetLysLeuProValArgLeuLeuVal LeuMetPheTrplie
202530
ProAlaSerSerSerAspValLeuMetThrGin ThrProLeuSerLeu
354045
ProValSerLeuGlyAspGinAlaSerlieSer CysArgSerSerGin
505560
SerlieValHisSerAsnGlyAsnThrTyrLeu GluTrpTyrLeuGin
65707580
匕ysProGlyGinSerProLysLeuLeulieTyr LysValSerAsnArg
859095
PheSerGlyValProAspArgPheSerGlySer GlySerGlyThrAsp
100105110
PheThrLeuLyslieSerArgValGluAlaGlu AspleuGlylieTyr
115120125
TyrCysPheGinGlySerArgValProLeuThr PheGlyAlaGlyThr
130 135 140抗阿爾茨海默病單克隆抗體序列表.txt
LysLeuGluLeuLysArgAlaAspAlaAlaProThrValSerliePhe
0
ProGluPheEndAsn 165LeuEndArgliePro 170GlyTyrArgAlaArg 175lie
ArgAsnHisGly 180HisSerCysPheLeu 185CysGlulieVallie 190ArgSer
GinPheHis 195ThrThrTyrGluPro 200GluAlaEndSerVal 205匕ysProGly
ValProAsnGluEndAlaAsnSerHisEndleuArgCysAlaHisCys
210215220ProLeuSerSerArgGluThrCysArgAlaSerCyslieAsnGluSer
225230235240
AlaAsnAlaArgGlv 245GluAlaValCysVal 250LeuGlyAlaLeuPro 255Leu
ProArgSerLeu 260ThrArgCysAlaArg 265SerPheGlyCysGly 270GluArg
TyrGinLeu 275ThrGinArgArgEnd 280TyrGlyTyrProGin 285AsnGinGly
lieThr 290HisGluArgThrCys 295GluGinLysAlaSer 300LysArgProGly
ThrValLysArgProArgCysTrpArgPheSerlieGlySerAlaPro
305310315320
LeuThrSerlieThr 325LyslieAspAlaGin 330ValArgGlyGlyGlu 335Thr
ArgGinAspTyr 340LysAspThrArgArg 345PheProLeu
權利要求
1. 抗阿爾茨海默病單克隆抗體，其重鏈可變區DNA序列如SEQ ID NO1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。
2. 抗阿爾茨海默病單克隆抗體，其輕鏈可變區DNA序列如SEQ ID NO:3所示，氨 基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
3. 抗阿爾茨海默病單克隆抗體，其重鏈與輕鏈可變區DNA序列和氨基酸序列分別如 下所示SEQ ID NO: 1是重鏈可變區DNA序列； SEQ ID NO:2是重鏈可變區氨基酸序列；SEQ ID NO:3是輕鏈可變區DNA序列； SEQ ID NO:4是輕鏈可變區氨基酸序列。
4. 權利要求1 3任一所述的單克隆抗體在制備檢測阿爾茨海默病試劑中的應用。
5. 權利要求4所述的應用，所述檢測阿爾茨海默病試劑是酶聯免疫吸附試驗試劑。
6. 權利要求4所述的應用，所述檢測阿爾茨海默病試劑是免疫印跡試驗試劑。
7. 權利要求4所述的應用，所述檢測阿爾茨海默病試劑是免疫組化試驗試劑。
8. 權利要求1 3任一所述的單克隆抗體在制備治療阿爾茨海默病藥物中的應用。
全文摘要
本發明提供了一種抗阿爾茨海默病單克隆抗體，能夠特異性識別和結合Aβ寡聚體，可用于制備阿爾茨海默病的診斷試劑和治療藥物。
文檔編號C07K16/18GK101531717SQ20091008207
公開日2009年9月16日 申請日期2009年4月22日 優先權日2009年4月22日
發明者何金生, 瑩 張, 濤 洪, 鑫 王 申請人:北京交通大學