一種抗vegfr2的單鏈抗體及其應用
【專利說明】一種抗VEGFR2的單鏈抗體及其應用
[0001]
技術領域
[0002]本發明屬于生物工程領域，具體涉及一種全新的可與血管內皮生長因子受體2(vascular endothelial growth factor receptor, VEGFR2)特異結合的高親和力全人源單鏈抗體，能抑制VEGF誘導的血管內皮細胞(human umbilical vascular endothelialcell, HUVEC)的增殖，是一種具有抗血管生成活性的基因工程抗體。
【背景技術】
[0003]癌細胞在生長因子受體的激活下增殖，癌細胞生長時會促進自身促血管生長因子如血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)等的表達上調，刺激內皮細胞活化，分泌出其他血管生成所需要的蛋白酶，引起一系列的級聯反應，通過抗凋亡等機制調節內皮細胞的存活，促進新生血管形成并維持其完整性。內皮細胞在VEGF等刺激因子作用下增殖，大量增殖的內皮細胞重新排列形成條索狀，刺激成纖維細胞分泌細胞外基質，形成新的血管。人VEGF受體2( VEGFR-2)，又稱為KDR(kinase insert domain-containing receptor，KDR)是VEGF的主要信號傳導受體，其參與新生血管內皮細胞的迀移、增殖、生存，在腫瘤周圍血管新生過程中具有重要的作用。因此，抑制VEGF/VEGFR-2途徑是抑制腫瘤轉移及生長的重要途徑。
[0004]KDR作為一種酪氨酸激酶受體，由一個胞外結構域，一個跨膜結構域和一個胞質內酪氨酸激酶結構域組成，其胞外有7個胞外免疫球蛋白樣區，其中3區(含有97個氨基酸)對VEGF的緊密結合部位貢獻最為突出。前期工作中以KDR胞外3區(KDR3)為靶抗原，利用噬菌體展示技術從Griff in.1單鏈抗體庫中篩選出了具有單鏈抗體。

【發明內容】

[0005]發明目的
本發明基于具有提高體外親和力的單鏈抗體突變體庫的構建，提供一種具有潛在醫學和藥學價值的全人源的抗KDR3的高親和力單鏈抗體。
[0006]技術方案
一種抗血管內皮生長因子受體2的單鏈抗體，其特征在于:所述的重鏈的氨基酸序列為SEQ ID NO: 1，即ARRGDQWESGGBSSAAPRLRSCTTFFLCCCSRGDDD ;輕鏈為SEQ ID NO: 2的氨基酸序列，即 LSPTSTTAPPFFTQQQSFGVQ。
[0007]上述的抗體選擇性地與VEGFR-2結合或抑制VEGF與VEGFR-2的結合或中和VEGF。
[0008]所述的一種抗VEGFR2的單鏈抗體制備治療以血管內皮生長因子受體的過量表達為特征的疾病藥物中的應用，其中所述的疾病為癌癥、視網膜黃斑病變和糖尿病并發眼部疾病。
[0009]有益效果: 本發明基于具有提高體外親和力的單鏈抗體突變體庫的構建，提供一種具有潛在醫學和藥學價值的全人源的抗KDR3的高親和力單鏈抗體，獲得單鏈抗體RD高親和力和更強的抑制VEGF誘導的HUVEC細胞增殖的活性。本發明單鏈抗體的特征為特異性高親和力結合人VEGFR-2胞外3區-KDR3，在體外能夠抑制VEGF誘導的HUVEC細胞的增殖。
[0010]本發明得到對靶抗原KDR3親和力提高的單鏈抗體RD，體外抑制HUVEC細胞增殖實驗結果表明，本發明得到的單鏈抗體可以顯著抑制HUVEC細胞的增殖。本發明為治療以血管內皮生長因子受體的表達，特別是過量表達為特征的疾病提供了基于抗體的療法，相關疾病包括但不限于癌癥和視網膜黃斑病變等糖尿病并發眼部疾病。
[0011]
【具體實施方式】
[0012]以下借助非限制性實施例舉詳細描述本發明。對本領域技術人員而言，在不背離本發明精神的前提下對它所做的任何顯而易見的改動，特別是對若干部件的等同替換，都構成對本發明專利權的侵犯，將承擔相應的法律責任。
[0013]實施例中涉及的百分比，其中固定試劑為重量體積百分比，液體試劑為體積百分比。
[0014]實施例1抗KDR3單鏈抗體突變體的篩選及鑒定
以包被緩沖液(10mM Tris, NaCl 150mM, ρΗ9.0)稀釋KDR3蛋白(按文獻制備:JuanZhang, Haixin Li, Wei Chen.Preparat1n of Extracellular Domain 3 of HumanVEGF Receptor-2 and the Monitoring of Its Real-Time Binding to VEGF byB1sensors.B1technol.Prog., 2009, Vol.25，N0.6)至 100 yg/ml;取4 ml加入到免疫管中，4 °C包被過夜；次日，棄上清，PBS迅速洗管3次；2% MPBS(含有2%脫脂牛奶的PBS )，37 °C封閉2 h;棄封閉液，用I3BS迅速洗管3次;噬菌體展示庫(1012?1013 p.f.u )(購自天津賽爾生物技術有限公司)懸浮于4 ml 2% MPBS并加入到免疫管中，室溫反復倒轉30min后，于室溫靜置90 min以上；以含有0.1% Tween-20的PBS洗管10次，再以I3BS洗管10次去除去污劑；加入I ml 100 mM三乙胺(700 μ? 7.18 mol/L三乙胺加入50 ml水中)，室溫反復倒轉孵育10 min，進行特異性洗脫;0.5 ml I M Tris(pH7.4)用于迅速中和洗脫下來的噬菌體；中和后的噬菌體用于感染對數期的E.coli TGl，進行擴增和制備，用于下一輪篩選，連續進行四輪篩選。四輪篩選中KDR3包被的濃度分別為5yg/ml，5yg/ml，2.5yg/ml，lyg/ml ο
[0015]任意挑取取第四輪篩選獲得的噬菌體感染200μ1處于對數生長期的感染琥珀突變型蛋白表達菌株Ε.coli HB2151(Novagen公司)，lmM的IPTG于30°C誘導過夜，進行抗體ELISA篩選親和力高的單鏈抗體。方法如下:酶標板包被lyg/ml的KDR3，每孔100μ1。4°C包被過夜，5%的脫脂奶粉封閉，37°C封閉2h。將制備得到的上清中的不同種類的抗體各100μ1加入到對應的孔中。一抗為1:2 000稀釋的鼠源抗c-Myc抗體，二抗為1:5000稀釋HRP標記的山羊抗鼠抗體，加入TMB顯色液顯色30min后，每孔加入50μ1 I mol/ L H2SO4終止反應，酶標儀測定0D450/0D650作為最后檢測結果。
[0016]實施例2抗KDR3單鏈抗體的可溶性表達及分離純化
挑選實施例1抗體ELI SA初步檢測值最高的菌株，37 °C培養至0D600=0.8，加入終濃度ImM的IPTG，30°C誘導過夜，取樣進行15% SDS-PAGE，分析目的蛋白表達。
[0017]將過夜菌液6000rpm，4°C離心15min，收集菌體;PBS重懸洗滌菌體一次，采用滲透休克法破碎菌體，即高滲溶液(50mM Tris-HCl，20%蔗糖，ImM EDTA，pH8.0)重懸菌體，緩慢攪拌1min A°C , 9000g離心1min，倒出上清，用冰冷的5mM MgS(k重懸沉淀，緩慢攪拌10min，4°C，1000g離心20min，將上清與上一步上清合并用于鎳柱(購自GE Healthcare)親和層析純化，用不同濃度的咪唑洗滌雜蛋白，洗脫目的蛋白；15% SDS-PAGE檢測收集的樣品，-20°C保存目的蛋白，命名為單鏈抗體RD，經上海生工氨基酸測序獲知，其氨基酸序列為SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 2，。
[0018]實施例3 ELISA測定相對親和力
方法同實施例2初步檢測親和力ELISA。將KDR3溶解在0.05 mo I/L碳酸緩沖液(pH9.6)中，終濃度為I yg/ml，每孔100 μ?將抗原加到96孔板中，4 °C包被過夜。5%的脫脂奶粉封閉2h。分別加入4000，3000，2000，1000，500，250 nM/ml 的RD抗體，37°C孵育90min，用PBST洗三次，每次5 min。一抗為1:2 000稀釋的鼠源抗c_Myc抗體，二抗為1:5 000稀釋HRP標記的山羊抗鼠抗體。加入TMB顯色液顯色30分鐘后，每孔加入50μ1 I mol/ LH2SO4終止反應，酶標儀測定0D450/0D650作為最后檢測結果。顯示抗體RD對抗原有較高的親和力，抗體效價為1:2500。
[0019]實施例4單鏈抗體AK11對HUVEC細胞的生長抑制作用
HUVEC細胞(購自上海生化與細胞所)于37°C、5%C02培養箱中培養，待長滿90%以上時，換液。將重懸后的細胞稀釋至3 X 14細胞/ml，96孔板中每孔加ΙΟΟμΙ，同時設置空白對照組(即不含細胞，只加培養基)，于37°C、5%C02培養箱中培養24h后加待測物。用DMEM+1%FBS培養基將 RD 稀釋到:5000ng/ml、1000ng/ml、500ng/ml、100ng/ml、50ng/ml、lOng/ml。每孔 100μI，每個濃度設置三個平行孔(n=3)，同時設置空白對照和陰性對照(無VEGF)，VEGF終濃度為10ng/ml。最后于37°C、5%C02培養箱中培養72h。
[0020]培養72h后，每孔加入5mg/ml MTT溶液12μ1，于培養箱中繼續培養4h。然后于平板離心機中，3000 rpm離心5min后，吸出孔中溶液，加入150μ1 /孔DMSO溶液，再于微量振蕩器上振蕩I Omin，最后酶標儀上檢測570nm和630nm處的吸光度值，則每個孔的吸光度值即為A570-A630。
[0021 ]抗體對VEGF誘導的內皮細胞抑制率計算公式為:(A?4-A^)/(A|^-A空)X 100%。
[0022]結果，在本實驗條件下，單鏈抗體RD的IC50值為18.45nM，其具有外抗血管內皮細胞增殖的活性。
【主權項】
1.一種抗VEGFR2的單鏈抗體，其特征在于:所述的重鏈可變區域的氨基酸序列為SEQID NO:1;輕鏈可變區域為SEQ ID NO: 2的氨基酸序列。2.根據權利要求1所述的一種抗VEGFR2的單鏈抗體制備治療以血管內皮生長因子受體的過量表達為特征的疾病藥物中的應用，其中所述的疾病為癌癥、視網膜黃斑病變和糖尿病并發眼部疾病。
【專利摘要】本發明公開了一種經過體外親和力成熟的全人源的抗KDR單鏈抗體RD，具體為一種抗血管內皮生長因子受體2的單鏈抗體，其特征在于：所述的重鏈可變區域的氨基酸序列為SEQ？ID？NO:？1；輕鏈可變區域為SEQ？ID？NO:？2的氨基酸序列。本發明的單鏈抗體可特異性結合于血管內皮生長因子受體2，可以抑制VEGF誘導的HUVEC的生長，可應用于治療以血管內皮生長因子受體的表達，特別是過量表達為特征的疾病提供了基于抗體的療法，相關疾病包括但不限于癌癥和視網膜黃斑病變等糖尿病并發眼部疾病。
【IPC分類】A61P35/00, A61P27/02, A61P3/10, C07K16/28, A61K39/395
【公開號】CN105601743
【申請號】CN201610068209
【發明人】羅瑞雪
【申請人】蘇州普羅達生物科技有限公司
【公開日】2016年5月25日
【申請日】2016年2月1日