針對cxcr5的單克隆抗體的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及特異性針對CXCR5的抗體。更具體地，本發明涉及單克隆抗體，且更具 體地是全人單克隆抗體，其以高親和力特異性結合并中和人CXCR5。本發明還涉及編碼所述 抗體的核酸、用于表達這些核酸的載體，以及用于生產所述抗體的宿主細胞。此外，本發明 涉及所述抗體在診斷和/或治療自身免疫疾病或炎性疾病以及癌癥中的應用。
【背景技術】
[0002] 初始B細胞嚙合其B細胞受體（BCR)上的抗原（Ag)，上調CCR7并迀移至外部T細 胞區以引發T細胞輔助，導致以T細胞依賴或不依賴方式進行分化。T細胞依賴型B細胞 激活導致分泌漿細胞的短期IgM抗體。然而，與激活的T細胞的關聯相互作用可進一步擴 大B細胞功能并驅動濾泡分化。通過T細胞區運輸的聚集的輔助T細胞暴露于抗原呈遞細 胞（APC)(如樹突細胞）上MHC II型（MHCII)復合體上的相同抗原。抗原-MHCII復合體 的呈遞可導致具有相關抗原受體的T細胞的激活和增殖。激活的T細胞迀移至B細胞區域 并以相同特異性嚙合B細胞上MHCII結合的Ag，導致形成免疫突觸。以該方式激活的B細 胞催化濾泡生成并經歷強烈增殖，分化為高親和力記憶B細胞或長期漿細胞。通過BCR的 體細胞高度突變生成高親和力抗原結合B細胞的標準受到專門的間充質和T細胞群體的控 制。通過與濾泡B輔助T細胞（TFH)相互作用來選擇能夠嚙合并加工濾泡樹突細胞（FDC) 呈遞的抗原的高親和力抗原結合B細胞以進行進一步分化。與??Η細胞的相互作用促進選 擇高親和力接頭，以及用于分化為漿細胞和長期漿細胞的信號轉導。B和??Η細胞上CXCR5 的表達已知在優化生發中心內的這些相互作用中起關鍵作用。促進這些T和B細胞相互作 用的特化微環境由組成型表達CXCL13的FDC產生，其促進表達CXCR5的特化的淋巴細胞子 集的定位和停留。
[0003] 在生發中心中，需要與CXCR5陽性??Η細胞相互作用以誘導高親和力抗體應答。文 獻中越來越多的證據表明，B細胞在多發性硬化（MS)的發病中起作用，其生成導致髓磷脂 破壞的特異性（自身）抗體。此外，B細胞涉及MS疾病過程的全部階段，從起始（抗原捕 獲）至炎癥和組織損傷并可在MS中起其他作用，包括但不限于抗原呈遞和細胞因子產生。 在現有的MS療法中，直到最近之前都未直接靶向B細胞，其中試驗性研究使用單克隆抗體 (mAb)利妥昔單抗（抗CD20)。然而，隨著許多當前MS療法（干擾素 β、糖皮質激素、米托 蒽醌、那他珠單抗、芬戈莫德）和即將使用的MS療法（阿來組單抗）具有影響B細胞行為 的潛力，對B細胞的作用可能有助于其治療效力。
[0004] CXCR5(也稱為伯基特淋巴瘤受體，即BLR-I，和⑶185)是一種G蛋白偶聯的七次 跨膜結構域受體（GPCR 7TM受體），其在B細胞和⑶4 T細胞亞群上高度表達。唯一已知的 CXCR5配體是CXC趨化因子CXCL13 (也稱為BLC或BCA-1)。CXCR5的靶向刪除顯示該受體 涉及B細胞迀移和淋巴結內的B細胞定位。在缺失CXCR5的情況下，B細胞無法從富T細 胞區迀移至脾的B細胞濾泡，且結果是未形成功能性生發中心。CXCL13和CXCR5敲除小鼠 具有類似表型，但有趣的是，其仍能夠生成顯著的抗原特異性應答，但比野生型小鼠中低得 多。
[0005] CXCL13高度表達于發炎的中樞神經系統（CNS)，但在正常CNS中實際上不可檢測。 CXCL13的鞘內產生被認為負責將CXCR5陽性B和T細胞招募至腦脊液（CSF)，且MS患者的 CSF中大部分B細胞是CXCR5陽性的。還在繼發進展型MS患者腦膜的淋巴濾泡樣結構中 觀察到的FDC中檢測到CXCL13表達。MS中發現的致病性B細胞應答是經證明調節B細胞 功能的異位淋巴結構中淋巴細胞累積的直接產物。此外，非常靠近主動脫髓鞘損傷生成導 致持久性自身免疫應答的自身抗原，從而在驅動疾病慢性化過程中起主要作用。CXCL13和 B細胞激活因子（BAFF ;B細胞存活的關鍵調控因子）都在小鼠的CNS中顯著且恒定地上調 并復發緩解或慢性復發實驗性自身免疫腦脊髓炎（EAE)，表明在動物模型中，B細胞功能也 在CNS炎癥的慢性化過程中起作用。該發現與CXCL13敲除小鼠的表型一致，其顯示與野生 型對照相比較輕形式的EAE并具有炎性癥狀的快速消散和從疾病中完全恢復。這些研究證 明，CXCL13和CXCR5在B細胞迀移、分化和增殖應答中起重要作用。血管系統中存在的B細 胞數量相對較低，因此特化的淋巴微環境內的定位對于與決定B細胞效應功能的其他淋巴 細胞子集的相互作用而言至關重要。CXCR5的表達在該過程中起核心作用，因此CXCR5拮 抗可潛在地通過降低招募至CNS的B和T細胞來阻斷MS疾病，具體方法為通過抑制B細胞 成熟為漿細胞或中心細胞和通過阻斷與IFH細胞的相互作用和自身抗體產生。可能顯著的 是，CXCR5阻滯可通過減弱這些無菌淋巴環境內的自體抗原呈遞來破壞異位淋巴濾泡發育， 并促進炎性過程的緩解。
[0006] 還在其他慢性炎性疾病（如類風濕性關節炎（RA)和舍格倫綜合征）中通過 CXCL13表達和與攜帶CXCR5的細胞相互作用鑒定到了異位淋巴結構的生成，且最近已證明 CXCR5表達存在于多種胰腺癌中。因此，通過使用針對CXCR5的抗體，CXCR5的拮抗可以是這 些疾病中有用的治療方法。鑒于上文所述患有EAE的小鼠的CNS中BAFF和CXCL13 (CXCR5 的配體）表達的相似性，這是可信的，且原因是抗BAFF療法是對炎性/自身免疫疾病治療 而言是廣泛接受的。實際上，不同的抗BAFF抗體已上市或正在開發用于治療炎性/自身免 疫疾病：例如，已被批準用于系統性紅斑狼瘡（SLE)的貝利木單抗也被評估針對諸如MS、RA 和舍格倫綜合征的疾病，且塔巴單抗（tabalumab)目前正在SLE和MS的臨床試驗中。
[0007] 如上文所述，CXCL13/CXCR5通路在B細胞功能中起關鍵作用。Burkle等（2007) 還證明，該通路參與癌癥，如B細胞慢性淋巴細胞性白血病（B-CLL)。其特別證明，CLL患者 的血清CXCL13水平顯著高于健康患者。作者還證明，抗CXCR5抗體抑制對CXCL13的趨化 性，表明CXCR5是針對CLL患者的新治療靶標。
[0008] W02009032661描述了特異性結合人CXCR5的胞外結構域的人源化抗體多肽。其還 描述了治療涉及CXCR5陽性細胞疾病患者的方法，包括給予所述患者結合CXCR5的CXCR5 拮抗劑。
[0009] 考慮到炎性和/或自身免疫疾病以及癌癥對于公共健康的重要影響，因此還需要 可特別用作治療炎性和/或自身免疫疾病（如多發性硬化、類風濕性關節炎或舍格倫綜合 征）以及癌癥（如胰腺癌、B-CLL或涉及CXCR5/CXCL13通路的癌癥/淋巴瘤）的藥物的新 分子。

【發明內容】

[0010] 本發明提供了特異性結合CXCR5的新單克隆抗體，特別是全人抗體。這些CXCR5 抗體不僅能夠結合還能夠中和CXCR5。因此，其特別能夠結合CXCR5 +細胞，如B細胞。
[0011] 在第一實施方式中，本發明描述了經由其互補決定區（⑶R)序列結合CXCR5的抗 體或其部分。包含所述CDR的抗體保留了這些CDR來源的母體分子的CXCR5結合特異性。
[0012] 在另一個實施方式中，描述了所述抗體的構架區（FR)。所述FR將與本發明所述 CDR組合。
[0013] 在另一個實施方式中，還公開了感興趣的抗體的重鏈和輕鏈可變區的氨基酸序 列，以及可與其組合的優選的恒定區的氨基酸序列。
[0014] 本發明的另一個實施方式由編碼本發明抗體的多核苷酸序列、載體和包含所述多 核苷酸序列的細胞系組成。
[0015] 還描述了 一種生成本發明所述抗體的方法。
[0016] 本發明的另一個實施方式是一種藥物組合物，其包含一種或至少一種感興趣的抗 體。
[0017] 在最后的實施方式中，本發明所述單克隆抗體用作藥物。具體而言，其可用于治療 與CXCR5或CXCR5通路相關的疾病，并可用于治療自身免疫或炎性疾病。具體而言，這類疾 病或病癥選自多發性硬化、類風濕性關節炎或舍格倫綜合征。其還可用于治療癌癥，如胰腺 癌、B-CLL或涉及CXCR5/CXCL13通路的其他類型的癌癥。
[0018] 定義
[0019] -術語"免疫球蛋白"（Ig)指由一種或多種多肽組成的蛋白，所述一種或多種多肽 基本由免疫球蛋白基因編碼。一種免疫球蛋白形式構成了抗體的基本結構單元。該形式是 四聚體且由兩個相同的免疫球蛋白鏈的對組成，各對具有一條輕鏈和一條重鏈。輕鏈具有 兩部分：可變結構域（VL)和恒定結構域（CL)，其在輕鏈的上下文中也稱為恒定區。重鏈也 具有兩部分：可變結構域（VH)和恒定區（CH)。在各對中，輕鏈和重鏈可變結構域共同主要 負責結合抗原，且恒定區負責抗體效應功能。全長免疫球蛋白"輕鏈"（通常約25kDa)由 N末端處的可變結構域基因（通常約110個氨基酸）和C末端處的κ或λ恒定區結構域 (分別為CjP C λ)編碼。全長免疫球蛋白"重鏈"（通常約50kDa)類似地由可變結構域基 因（通常約116個氨基酸）和后文所述其他恒定區基因之一（通常約330個氨基酸）編碼。 存在五種類型的哺乳動物重鏈，其由希臘字母命名：[α ]、[ δ ]、[ ε ]、[ γ ]和[μ ]。重鏈 類型分別將抗體的同種型限定為IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。恒定區在相同同種型的所有抗 體中都相同，但在不同同種型的抗體中不同。重鏈[Υ]、[α]和[δ]的恒定區由三個Ig 恒定結構域（CH1、CH2和CH3)和一個鉸鏈區（用于增加撓性）組成；重鏈[ε ]和[μ ]的 恒定區由四個Ig恒定結構域（CH1、CH2、CH3和CH4)和一個鉸鏈區組成。
[0020] 免疫球蛋白輕鏈或重鏈可變結構域由"構架"區組成，其被三個高變區打斷。因 此，術語"高變區"指負責抗原結合的抗體的氨基酸殘基。高變區包含來自"互補決定區"或 "⑶R"的氨基酸殘基，即輕鏈可變結構域中的L-⑶RUL-⑶R2和L-⑶R3和重鏈可變結構域 中的H-CDRl、H-CDR2和H-CDR3 (Kabat等1991)和/或來自"高變環"的那些殘基（Chothia 和Lesk，1987)。"構架區"或"FR"殘基是除了本文所限定的超變區殘基之外的那些可變 區殘基。不同輕鏈的構架區（即L-FR1、L-FR2、L-FR3和L-FR4)或不同重鏈的構架區（即 H-FR1、H-FR2、H-FR3和H-FR4)的序列在物種內是相對保守的。因此，"人構架區"是與天然 產生的人免疫球蛋白的構架區基本相同（約85%或更高，通常約90-95%或更高）的構架 區。抗體的構架區即組成輕鏈和重鏈的組合的構架區，其用作定位和對齊CDR。CDR主要負 責與抗原表位的結合。
[0021] -本文所用術語"抗體"及其復數形式包括但不限于多克隆抗體、親和純化的多克 隆抗體、單克隆抗體和抗原結合片段，如F(ab'）2、Fab蛋白酶水解片段以及單鏈可變區片 段（scFv)。還包括遺傳工程改造的完整抗體或片段，例如嵌合抗體、scFv和Fab片段，以及 合成的抗原結合肽和多肽。
[0022] -術語"人源化"免疫球蛋白指包含人構架區和一個或多個來自非人（通常是小鼠 或大鼠）免疫球蛋白的CDR的免疫球蛋白。提供CDR的非人免疫球蛋白稱為"供體"且提 供構架區的人免疫球蛋白稱為"受體"（通過將非人CDR接枝在人構架和恒定區上，或通過 將整個非人可變結構域整合在人恒定區上（嵌合化）來進行人源化）。恒定區無需存在，但 如果存在，其必須與人免疫球蛋白恒定區基本相同，即至少約85-90%，優選約95%或更高 相同。因此，人源化免疫球蛋白的所有部分都與天然人免疫球蛋白序列的相應部分基本相 同，如果需要調節效應功能則重鏈恒定區中的一些殘基和CDR除外。"人源化抗體"是包含 人源化輕鏈可變結構域和人源化重鏈可變結構域的抗體。在一些情況下，人源化抗體可保 留人構架區內的非人殘基以增強適當的結合特征和/或可將一些氨基酸突變導入CDR內以 改進結合親和力和/或降低免疫原性和/或提高人的程度和/或改進抗體的生物化學/生 物物理學性質。通過人源化抗體，可提高生物半衰期，并降低了給予人后不良免疫反應的潛 力。
[0023] -術語"全人"免疫球蛋白指包含人構架區和人CDR的免疫球蛋白。恒定區無需存 在，但如果存在，其必須與人免疫球蛋白恒定區基本相同，即至少約85-90%，優選約95% 或更高相同。因此，全人免疫球蛋白的所有部分都與天然人免疫球蛋白序列的相應部分基 本相同，如果需要調節效應功能或藥代動力學特征則重鏈恒定區中的一些殘基除外。"全人 抗體"或"全人單克隆抗體"是包含全人輕鏈可變結構域和全人重鏈可變結構域的抗體。在 一些情況下，可將氨基酸突變導入CDR、構架區或恒定區內以改進結合親和力和/或降低免 疫原性和/或改進抗體的生物化學/生物物理學性質。
[0024] 術語"重組抗體"指其中氨基酸序列不同于天然抗體的抗體。由于抗體生成中重 組DNA技術的相關性，無需限制于天然抗體中發現的氨基酸的序列；可以重新設計抗體以 獲得所需的特性。可能的變化形式有很多且范圍為從改變僅一個或一些氨基酸到完全重新 設計例如可變結構域或恒定區。通常進行恒定區中的變化以改進、降低或改變諸如補體固 定（例如補體依賴的細胞毒性，CDC)、與Fc受體相互作用，以及其他效應功能（例如抗體依 賴的細胞毒性，ADCC)、藥代動力學特性（例如與新生兒Fc受體結合；FcRn)。將進行可變結 構域中的變化以改進抗原結合特性。除抗體外，免疫球蛋白還可以多種其他形式存在，包括 例如單鏈或Fv、Fab和（Fab'）2以及雙抗體、線性抗體、多價或多特異性雜交抗體。
[0025] -本文所用術語"抗體部分"指完整或全長鏈或抗體的片段，通常是結合或可變區。 所述部分或片段應維持完整鏈/抗體的至少一種活性，即其是"功能性部分"或"功能性片 段"。如果其維持至少一種活性，其優選維持靶標結合特性。抗體部分（或抗體片段）的示 例包括但不限于"單鏈Fv"、"單鏈抗體"、"Fv"或"scFv"。這些術語指包含重鏈和輕鏈可變 結構域但缺少恒定區的抗體片段，所有片段都在單個多肽鏈中。通常，單鏈抗體還包含VH 和VL結構域之間的多肽接頭，其促使形成允許抗原結合的所需結構。在具體的實施方式 中，單鏈抗體還可以是雙特異性和/或人源化的。
[0026] _"Fab片段"由一條輕鏈和一條重鏈的可變結構域和CHl結構域組成。Fab分子的 重鏈無法與另一重鏈分子形成二硫鍵。含有一條輕鏈和一條重鏈且含有較多的恒定區（在 CHl和CH2結構域之間）從而在兩條重鏈之間形成鏈間二硫鍵的"Fab'片段"稱作F (ab'）2 分子。"F (ab'）2"含有兩條輕鏈和兩條重鏈，其含有CHl和CH2結構域之間的一部分恒定 區，使得兩條重鏈之間形成鏈間二硫鍵。在定義了一些重要術語后，現在可以關注于本發明 的特定實施方式。
[0027] -在本發明的上下文中，術語"治療"指對于疾病進展的任何有利影響，包括在疾病 開始后減弱、減少和降低或緩解疾病發展。
[0028] -術語"藥學上可接受的"旨在涵蓋任何運載體，其不干擾活性成分的生物學活性 的有效性并且對給予的宿主無毒。例如，對于胃腸道外給藥，活性蛋白質可配制為用于在載 劑中注射的單位劑型，載劑例如但不限于鹽水、右旋糖溶液、血清白蛋白和林格氏溶液。
[0029] -人免疫系統已進化為對抗各種病毒、微生物和其他威脅。體液組分一抗體應答一 是免疫系統武器庫的關鍵組分。抗體可包被、阻斷和加工外來侵入物，且重要的是招募免疫 效應細胞以使用多種防御措施來應對侵入物。人免疫系統中存在多種抗體類型和同種型， 各自被賦予多種效應功能，其可調節為針對侵入病原體的性質。重組治療性抗體構建自人 序列且幾乎總是衍生自IgG類。迄今為止，大多數治療性抗體衍生自IgGl同種型，其次是 IgG2和IgG4。IgGl同種型具有廣泛應用性的原因是其嚙合免疫效應細胞和補體的嵌入能 力（built-in ability)。抗體或效應細胞介導的效應功能主要包括細胞裂解（ADCC=抗體 依賴性細胞介導的細胞毒性）、吞噬作用（ADCP =抗體依賴性細胞介導的吞噬作用）和補 體依賴性細胞毒性（CDC)。我們對于這些效應功能的認識大部分來自對抗體介導的殺傷的 體外分析。例如，人PBMC (外周血單核細胞）與靶細胞（通常是腫瘤細胞系）和靶標特異 性抗體