] 為更進一步闡述本發明所采取的技術手段及其效果，W下結合本發明的優選實施 例來進一步說明本發明的技術方案，但本發明并非局限在實施例范圍內。
[0041] 實施例中未注明具體技術或條件者，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件， 或者按照產品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可通過正規渠道商購 獲得的常規產品。
[004引實施例1 :制備CsSP46蛋白
[0043] 肝吸蟲CsSP46基因的克隆，表達載體的構建及鑒定，如圖1所示：
[0044] (1)根據肝吸蟲的基因序列設計引物：
[0045]h游引物：5'-ATACATATGATGGGACGTCCCCATGCAGATG-3' (沈QIDNO. 3)，其中下劃 線部分為化0I酶切位點；
[0046]下游引物：5'-GGGCTCGAGTTACTTGGGAGTCTTTGATGATTG-3'(沈QIDNO. 4)，其中下 劃線部分為NdeI酶切位點。
[0047] 采用常規小量細菌DNA提取方法即堿裂解法提取肝吸蟲的基因組。
[0048] PCR擴增：W提取的質粒為模板進行PCR擴增，反應體系如下：
[0049]
,
[0050] 設置一組W水為樣本的陰性對照。
[0051] 反應條件如下：
[0052]
[0053] 所獲得PCR產物進行1. 2%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定并用膠回收試劑盒（QIAquick GelExtraction)純化。采用TAKARApMDlS-Tkit參照說明書體系進行連接。
[0054] (2)驗證：所述酶切采用將過夜培養的菌液采用試劑盒的提取的方法純化質粒， 電泳檢測無誤后進行雙酶切，酶切體系如下：
[00巧]
[0056] 同時酶切祀T-28a(+)質粒，作為陰性對照，酶切溫度為37°C，時間比。所獲得酶 切產物進行1. 2%的瓊脂糖凝膠回收目的條帶。
[0057] 結果如圖2所示，雙酶切驗證后的電泳圖可W看出，1的PCR產物是一條1000多的 目的條帶，2雙酶切后具有一條1000多的目的條帶和5000多的酶切后的質粒，3空質粒酶 切后的質粒與2酶切后的質粒大小相同。
[005引 （3)通過同源重組法，將連接產物重組到表達載體祀T-28a(+)(購自TAKARA公 司）中，構建重組載體；將所述重組載體轉化到克隆菌D冊α大腸桿菌中，篩選含有所述 CsSP46基因序列的陽性轉化菌；具篩選可W通過X-Gal等方法篩選含有所述CsSP46基因 序列的陽性轉化菌；
[0059] 具體地，將上述回收到的目的片段和載體進行連接。采用的TAKARAT4連接酶體 系如下：
[0060]
[0061] 按上述方法將連接產物轉化到D冊α感受態，并在LB化an+)平板進行培養，37°C 過夜，挑取單菌落進行PCR鑒定。
[0062] (4)從所述陽性轉化菌中提取所述重組載體，PCR驗證并酶切驗證，驗證基因片段 的大小，證明PCR得到的序列正確。將所述測序證明正確的重組載體轉化到表達菌化21大 腸桿菌中，得到含有所述CsSP46基因序列的陽性表達菌；
[0063] 具體地，挑取6個單菌落37Γ過夜培養。將過夜培養的菌液W1:100的比例加入 5mlAmp+LB培養基中，37Γ22化pm培養化。取出1ml菌液作為未誘導對照，其余按照體積 加入IPTG至終濃度為0. 4mM，37°C180巧培養地。取1ml菌液12000g離屯、lOmin，棄上清， 用lOOul去離子水重懸沉淀，加入等體積的2XSDSloadingbuffer，沸水浴lOmin，取上清 用12%SDS-PAGE電泳檢測。
[0064] 將經檢測誘導成功的菌株擴大培養和誘導，將過夜培養的菌液1:100稀釋至 200ml新鮮LB培養基中，按照上述誘導條件對其進行誘導。
[0065] 經誘導后的菌液12000g離屯、lOmin，收集菌體。W1/10體積的裂解緩沖液重懸菌 體，超聲破碎，控制功率200W，工作條件為超聲4s暫停10s90次，W冰浴降溫，重復3次W 徹底破碎細菌。將經超聲破碎處理的菌液12000g離屯、lOmin后，分別取上清和沉淀經12% SDS-PAGE驗證蛋白表達方式。
[0066] 結果如圖3所示，可W看出，成功構建的化21-pET-28a(+) -CsSP46再經過誘導后， 在46-50kDa處出現明顯條帶，超聲裂解后，目的蛋白主要存在于沉淀中，且與重組蛋白理 論分子量48. 7kDa吻合，可見已成功得到CsSP46蛋白。
[0067] 妨親和層析純化所述CsSP46蛋白，具體地，可W通過Ni-NTA柱親和層析純化等 方式分離純化所述CsSP46蛋白。
[0068] 具體地，可W采用GE公司的Ni-NTA親和層析預裝柱（化Se地arose化曲 Perf^ormance)按照產品說明書純化目的蛋白CsSP46。實驗中，用蒸饋水W 50-100cm/h的 線性流速洗5個柱體積，W150cm/h的線性流速用6個柱體積的結合緩沖液平衡柱子，然后 加入預處理過的樣品，用緩沖液洗涂，直到吸收達到基線。采用逐步洗脫法用洗脫緩沖液洗 脫，收集各階段樣品，SDS-PAGE檢測蛋白純化效果。
[0069] 綜上所述，本發明通過用肝吸蟲特異性抗原CsSP46包被制成的肝吸蟲IgG抗體檢 測的敏感度、特異性等指標均高于90%，能夠滿足臨床診斷的要求，并且基本不存在交叉反 應的情況，操作上比國家針對肝吸蟲病的指定診斷金標準方法更簡單快捷，重復性更好，可 W在臨床診斷中大力推廣。
[0070] 申請人聲明，本發明通過上述實施例來說明本發明的詳細方法，但本發明并不局 限于上述詳細方法，即不意味著本發明必須依賴上述詳細方法才能實施。所屬技術領域的 技術人員應該明了，對本發明的任何改進，對本發明產品各原料的等效替換及輔助成分的 添加、具體方式的選擇等，均落在本發明的保護范圍和公開范圍之內。
【主權項】
1. 一種檢測肝吸蟲的特異性抗原CSSP46,其特征在于，所述特異性抗原CsSP46的氨基 酸序列包含如SEQIDNO. 1所示的片段。2.根據權利要求1所述的特異性抗原CsSP46,其特征在于，所述特異性抗原CsSP46的 基因序列包含如SEQIDNO. 2所示的片段。3.根據權利要求1或2所述的特異性抗原CsSP46,其特征在于，所述特異性抗原 CsSP46的基因序列的PCR擴增引物為： 上游引物如SEQIDNO. 3所示，下游引物如SEQIDNO. 4所示。4. 一種如根據權利要求1-3中任一項所述的特異性抗原CsSP46的制備方法，其特征在 于，所述方法包括如下步驟： (1) 通過PCR擴增技術獲得所述CsSP46的基因序列，并將CsSP46的基因序列重組到表 達載體中，構建重組載體； (2) 將重組載體轉化到克隆菌種，篩選含有所述CsSP46基因序列的陽性轉化菌； (3) 從所述陽性轉化菌中提取所述重組載體，并轉化到表達菌中，得到含有所述 CsSP46基因序列的陽性表達菌，對所述陽性表達菌擴大培養，誘導所述CsSP46蛋白表達； (4) 親和層析純化所述CsSP46蛋白。5. 根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述PCR擴增的引物為： 上游引物如SEQIDNO. 3所示，下游引物如SEQIDNO. 4所示。6. 根據權利要求4或5所述的制備方法，其特征在于，所述PCR擴增的退火溫度為 58。。。7. -種如權利要求1-3中任一項所述的特異性抗原CsSP46在制備抗肝吸蟲的藥物和 /或試劑中的應用。8. -種檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含如權利要求1-3中任一項所述的特 異性抗原CsSP46。
【專利摘要】本發明具體涉及一種檢測肝吸蟲的特異性抗原CsSP46、其制備方法及應用，所述特異性抗原CsSP46的氨基酸序列包含如SEQ？ID？NO.1所示的片段。本發明通過用肝吸蟲特異性抗原CsSP46包被制成的肝吸蟲IgG抗體檢測的敏感度、特異性等指標均高于90％，能夠滿足臨床診斷的要求，并且基本不存在交叉反應的情況，操作上比國家針對肝吸蟲病的指定診斷金標準方法更簡單快捷，重復性更好，可以在臨床診斷中大力推廣。
【IPC分類】A61P33/02, A61K39/002, G01N33/569, C12N15/30, C07K14/44
【公開號】CN105254733
【申請號】CN201510645379
【發明人】曾周祥, 傅劍華, 蔡棟, 李明磊, 莊興華, 操美芳, 蔡華
【申請人】深圳華康生物醫學工程有限公司
【公開日】2016年1月20日
【申請日】2015年10月8日