一種高特異性的葉酸完全抗原合成方法及其應用的制作方法
【專利摘要】一種高特異性的葉酸完全抗原合成方法及其應用，屬于生物化工【技術領域】。本發明是在載體蛋白溶液中加入6-氨基己酸與水溶性碳二亞胺后室溫下反應，透析后得到修飾了連接臂的載體蛋白B。葉酸（N-{4-[(2-氨基-1,4-二氫-4-氧代-6-喋啶)甲氨基]苯甲酰基}-L-谷氨酸）溶解于二甲亞砜，加入二環己基碳二亞胺與羥基琥珀酰亞胺，反應生成葉酸衍生物，再與載體蛋白B連接臂上的氨基進行偶聯，得到完全抗原。結果表明，用本發明的抗原免疫動物得到的抗血清效價達81000，檢測限0.042ng/mL，半抑制濃度0.3ng/mL。產生的抗體特異性高、靈敏度高。本發明的抗原或抗體用于免疫親和柱的制備及建立酶聯免疫吸附分析方法和膠體金試紙快速檢測法，用于檢測葉酸殘留。
【專利說明】一種高特異性的葉酸完全抗原合成方法及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種高特異性的葉酸完全抗原合成方法及其應用，屬于生物化工【技術領域】。
【背景技術】
[0002]葉酸(folic acid或folate)又名碟酰谷氨酸,B族維生素之一,是氨基酸、嘧唳和嘌呤代謝中單碳轉移的載體，對核蛋白的合成起輔酶作用；同時，葉酸也是許多細胞內酶反應的輔酶；葉酸的缺乏，會導致dTMP的合成受到限制，使DNA合成受阻，而產生巨幼細胞貧血。目前的研究已經證實，婦女孕前或妊娠早期缺乏葉酸是神經管畸形發生的重要病因之一。葉酸與同型半胱氨酸代謝關系密切，對預防心腦血管疾病的發生具有重要的生物學意義。而且，也有研究表明，葉酸與許多癌癥的發生、預防以及治療相關。在我國，葉酸作為一種食品添加劑可以按照食品安全國家標準合法添加至食品中。
【權利要求】
1.一種高特異性的葉酸完全抗原合成方法，其特征在于步驟為:在載體蛋白溶液中加入6-氨基己酸ε -ACA與水溶性碳二亞胺EDC，在室溫下反應，透析后得到修飾了連接臂的載體蛋白B ;將葉酸Ν-{4-[ (2-氨基-1，4- 二氫-4-氧代-6-喋啶)甲氨基]苯甲酰基} -L-谷氨酸溶解于二甲亞砜DMSO中，加入二環己基碳二亞胺DCC與N-羥基丁二酰亞胺NHS,反應生成葉酸衍生物，再加入載體蛋白B，調節反應pH值7.4，與載體蛋白B上的氨基進行偶聯，透析，得到高特異性的葉酸完全抗原。
2.根據權利要求1所述高特異性的葉酸完全抗原合成方法，其特征在于:所述載體蛋白為牛血清白蛋白BSA或雞卵清白蛋白0VA。
3.根據權利要求1所述高特異性的葉酸完全抗原合成方法，其特征在于具體步驟如下: (1)修飾載體蛋白:取載體蛋白50mg溶解于5mLpH9.6碳酸鹽緩沖溶液中，再加入10mg 6-氨基己酸,30mg水溶性碳二亞胺；調節體系pH值于6~8，室溫下反應4h ;用PBS緩沖液透析2天，期間換水4次，即得到修飾了連接臂的載體蛋白B ； (2)葉酸完全抗原的制備: 取25mg葉酸，加入2.5mL DMSO溶解，調節pH值為7.4，再分別加入1mg N-羥基丁二酰亞胺NHS，23mg DCC，室溫下避光混勻，攪拌反應4h，將步驟(1)制備的載體蛋白B 10mg加入反應液中，調節PH值為8.5，在室溫25°C下避光反應2h ;用PBS緩沖液透析2天，期間換水4次，即得到葉酸完全抗原。
4.權利要求1所述高特異性的葉酸完全抗原的應用，其特征在于:通過葉酸完全抗原化合物免疫動物得到多克隆抗體或單克隆抗體，并應用于檢測葉酸中。
【文檔編號】G01N33/53GK104031142SQ201410254563
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年6月10日 優先權日:2014年6月10日
【發明者】馬偉, 胥傳來, 孔德昭, 匡華, 徐麗廣, 劉麗強, 宋珊珊, 吳曉玲 申請人:江南大學