一種檢測肝吸蟲的特異性抗原CsSP46、其制備方法及應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物檢測技術領域，具體設及一種檢測肝吸蟲的特異性抗原CsSP46、 其制備方法及應用。
【背景技術】
[0002] 目前，肝吸蟲病主要分布在亞洲，我國23個省市區均有本病流行，本病的流行與 傳染源的多寡、河流坑塘的分布、糞便污染水源的情況、當地的氣候W及當地居民飲食習慣 等諸多因素密切相關。肝吸蟲病的感染無男女老少之分，人群普遍易感，其在一個地區流行 的關鍵因素是當地人群有生吃魚肉或吃未煮熟的魚肉的習慣，如廣東珠江Ξ角洲一帶、香 港、廣西、臺灣、黑龍江和迂寧的朝鮮族居住地區。
[0003] 肝吸蟲病的臨床表現常為慢性過程，感染后逐漸發生癥狀、體征。多數人為輕度感 染無明顯癥狀，一般病例可有食欲不振、乏力、消化不良、肝區疼痛、腹脹、腹瀉等消化道癥 狀W及輕度浮腫、肝臟腫大等。兒童和青少年感染肝吸蟲病后，臨床表現較為嚴重，除上述 癥狀外，還可影響生長發育，甚至死亡。肝吸蟲病的主要并發癥有膽管炎、膽囊炎、膽管肝 炎、膽石癥、膜腺炎和肝硬化等，甚至可并發膽管癌等，嚴重影響人體健康。成蟲主要寄生在 人、犬、貓、豬等的肝膽管內，成蟲浸出物及代謝產物中含有抗原成分，感染人體后會誘發多 種免疫病理反應，在肝吸蟲病人血清中，IgG是最容易檢測到的特異性抗體，宿主感染肝吸 蟲后可誘發較強的體液免疫應答，參與體液免疫的主要免疫球蛋白為IgG，其水平與感染度 呈正相關，也就是說肝吸蟲IgG抗體水平在一定程度上可反映病人感染程度。在肝吸蟲病 的診斷及流行病學研究等方面具有重要意義，可輔助診斷肝吸蟲感染及篩查感染人群。而 IgG4是肝吸蟲感染及治療評價更為特異的指標。
[0004] 傳統上，用患者糞便中肝吸蟲蟲卵的病原學方法檢測肝吸蟲病；近年來，免疫檢 測的方法逐漸被用于肝吸蟲病的臨床診斷研究中來，并取得了良好的效果。目前實驗室和 臨床應用的免疫學診斷方法主要有皮內試驗（ID)、間接血凝試驗（IHA)、免疫酶染色試驗 (IEST)、酶聯免疫吸附試驗巧LISA)、間接巧光抗體試驗（IFAT)、酶聯免疫印潰技術巧LIB) 等。
[0005] 隨著我國對肝吸蟲全基因組測序的完成，其全部基因組序列和編碼的可能的 蛋白質序列都已被解析，為肝吸蟲診斷試劑的開發奠定了基礎，肝吸蟲基因組學研究為 我們提供了大量有價值的基因組信息，增加了我們對肝吸蟲生物學知識。肝吸蟲所有 的基因組鳥槍法測序和轉錄組數據已全部釋放，可WNCBI序列閱讀文本的形式從網上 獲取GenBank中[SRA:029284和035384]，鳥槍片段組裝序列和基因模型都可W開放 訪問。運些基因組序列可W從日本DNA數據庫Q)DBJ:BADR01000001-BADR01060778(C ontigs)和DF126616-DF142827(scaffolds)]中下載，也可W從NCBI[NCBI:72781]和 GenBank[GenBank:BADR00000000. 1]數據庫中下載。
[0006]CN103459414A公開了一種對肝吸蟲類具有抗原活性的蛋白質，更具體地，提供 一種生成對肝吸蟲類具有抗原活性的蛋白質，從而在診斷及治療肝吸蟲類時，增加靈敏度 和特異性的抗原蛋白質。國內外研究人員利用分子生物學技術，參照血吸蟲診斷抗原，克 隆表達了肝吸蟲多個免疫診斷侯選抗原，評價了其在免疫診斷中的效果。其中包括谷脫巧 膚琉基轉移酶、半脫氨酸蛋白酶、組織蛋白酶^天冬氨酸蛋白酶D、7kDa抗原、卵蛋白，成 孔膚、表膜蛋白等。運些抗原并非肝吸蟲所特有的基因，其他寄生蟲和宿主也有相似的基 因。因此，使用運些重組抗原檢測肝吸蟲病人的血清中的IgG4,敏感性和特異性都不令人 滿意，與其他寄生蟲交叉反應比較嚴重。

【發明內容】

[0007] 本發明為了克服上述診斷抗原的缺陷，在診斷抗原的選擇上提供一種檢測肝吸蟲 的特異性抗原CSSP46、其制備方法及應用，能夠對肝吸蟲的防治及檢測提供新的免疫診斷 技術。
[0008] 為達到此發明的目的，本發明采用W下技術方案：
[0009] 第一方面，本發明提供了一種檢測肝吸蟲的特異性抗原CsSP46,所述特異性抗原 CsSP46的氨基酸序列包含如SEQIDNO. 1所示的片段，所述片段的序列如下：
[0011] 本發明中，通過肝吸蟲現有基因數據庫，發掘了一個特有的經非經典途徑分泌的 堿性蛋白CsSP46,通過基因工程手段從肝吸蟲的基因序列中獲得，作為一種特異性抗原，可 作為肝吸蟲病檢測的特異性包被抗原，相比于直接用從感染肝吸蟲病人血清中純化的肝吸 蟲抗原，專一性更強，效果更好；本發明首選肝吸蟲所特有的抗原性指數高的分泌抗原，W 提高其診斷的特異性和敏感性。
[0012] 優選地，所述特異性抗原CsSP46含有413個氨基酸。
[001引優選地，所述特異性抗原CsSP46的基因序列包含如SEQIDNO. 2所示的片段，所 述片段的序列如下：

[001引優選地，所述特異性抗原CsSP46的基因序列的PCR擴增引物為：
[0016] 上游引物如沈QIDNO. 3所示，下游引物如沈QIDNO. 4所示。
[0017] 上游引物：5,-ATACATATGATGGGACGTCCCCATGCAGATG-3'（沈QIDNO. 3)，
[0018]下游引物：5'-GGGCTCGAGTTACTTGGGAGTCTTTGATGATTG-3'（沈QIDNO. 4)。
[0019] 第二方面，本發明提供一種如第一方面所述的特異性抗原CsSP46的制備方法，其 特征在于，所述方法包括如下步驟：
[0020] (1)通過PCR擴增技術獲得所述CsSP46的基因序列，并將CsSP46的基因序列重組 到表達載體中，構建重組載體；
[0021] 似將重組載體轉化到克隆菌種，篩選含有所述CsSP46基因序列的陽性轉化菌；
[0022] (3)從所述陽性轉化菌中提取所述重組載體，并轉化到表達菌中，得到含有所述 CsSP46基因序列的陽性表達菌，對所述陽性表達菌擴大培養，誘導所述CsSP46蛋白表達；
[0023] (4)親和層析純化所述CsSP46蛋白。
[0024] 優選地，所述PCR擴增的引物為：
[00巧]上游引物如沈QIDNO. 3所示，下游引物如沈QIDNO. 4所示。
[0026]上游引物：5,-ATACATATGATGGGACGTCCCCATGCAGATG-3'（沈QIDNO. 3)，
[0027]下游引物：5'-GGGCTCGAGTTACTTGGGAGTCTTTGATGATTG-3'（沈QIDNO. 4)。
[0028] 優選地，所述PCR擴增的退火溫度為58°C。
[002引在本發明中，通過PCR擴增獲得特異性抗原CsSP46基因序列，所述的基因序列如 下：
GGAACGCACAATCATCAAAGACTCCCAAGTAAo
[0031] 第Ξ方面，一種如第一方面所述的特異性抗原CsSP46在制備抗肝吸蟲的藥物和/ 或試劑中的應用。
[0032] 第四方面，本發明提供一種檢測試劑盒，所述試劑盒包含如權利要求1-3中任一 項所述的特異性抗原CsSP46。
[0033] 與現有技術相比，本發明具有如下有益效果：
[0034] 本發明通過用肝吸蟲特異性抗原CsSP46包被制成的肝吸蟲IgG抗體檢測的敏感 度、特異性等指標均高于90%，能夠滿足臨床診斷的要求，并且基本不存在交叉反應的情 況，操作上比國家針對肝吸蟲病的指定診斷金標準方法更簡單快捷，重復性更好，可W在臨 床診斷中大力推廣。
【附圖說明】
[0035] 圖1為本發明構建的祀T-28a(+)-CsSP46的質粒示意圖；
[0036] 圖2為本發明CsSP46蛋白重組質粒酶切鑒定；
[0037] 其中，M1，M2-標準分子量；1-PCR產物；2-重組質粒雙酶切；3-空質粒雙酶切；
[0038] 圖3為本發明祀T-28a(+) -CsCsSP46在大腸桿菌中的表達產物及其純化產物；
[0039]其中，M-蛋白marker; 1-未誘導的BL21-pET-28a(+);2-誘導后的BL21-pET-28a(+); 3-未誘導的BL21-pET-28a(+)-CsSP46 ;4-誘導后的BL21-pET-28a(+)-CsSP46 ;5-誘導后的 BL21-pET-28a(+)-CsSP46超聲裂解上清部分;6-誘導后的BL21-pET-28a(+)-CsSP46超聲裂解沉淀部 分;7-重組純化蛋白。
【具體實施方式】
[0040