一種抗腫瘤相關抗原wt1特異性ctl及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生命科學技術領域，尤其涉及一種抗腫瘤相關抗原WTl特異性CTL及其制備方法。
【背景技術】
[0002]惡性腫瘤是威脅人類生命健康的第二大致死因素。據統計，2008年全球新發惡性腫瘤患者1270萬例，死亡760萬例。惡性腫瘤的發生和侵襲轉移過程受多層次、多因素調控，癌基因與抑癌基因作用的失衡是其中的關鍵環節之一。因此，尋找新的或進一步揭示已有癌基因或抑癌基因的功能，對闡明惡性腫瘤發生和演進機理、研發潛在治療靶點具有重要意義。Wilms瘤基因l(Wilms’tumor gene I，WT1)首先在腎母細胞瘤(又稱Wilms瘤)中作為抑癌基因被克隆鑒定，位于人11號染色體短臂I區3帶，長約50kb，有10個外顯子，富含“GC”同源序列。WTl基因編碼產物為長約52-54kD的蛋白質。正常生理情況下，WTl主要在胚胎發生過程中表達，參與心臟、腎臟和脾臟等器官的形成。WTl在正常成體組織中表達部位局限且表達強度極低。WTl在成體組織中的異常表達與多種惡性腫瘤的發生密切相關，但根據細胞特征不同，其可發揮癌基因或抑癌基因作用。一方面，在Wilms瘤等兒童惡性腫瘤中，WTl通過干擾細胞增殖信號等途徑抑制細胞生長，發揮抑癌基因作用；另一方面，WTl可增強腫瘤細胞的抗凋亡能力，并通過調控原癌基因K-ras增強細胞的增殖能力，提示WTl亦可發揮癌基因作用。
[0003]WTl基因是一種腫瘤相關性抗原(tumor associated antigen，TAA)，在各型白血病有尚水平表達，此外在多種實體瘤包括肺癌、乳腺癌、甲狀腺癌、食道癌、肝細胞癌和胃腸間質瘤等實體瘤中都有過表達，并且表達水平與預后呈負相關。WTl表達水平增高可促進細胞生長、凋亡受抑和誘導WTl轉基因小鼠產生白血病;反義寡核苷酸抑制WTl表達或SiRNA沉默WTl后能使白血病細胞及實體瘤細胞生長停止，表明WTl在白血病和實體瘤的發展中擔當著癌基因角色。根據以上發現，表明WTl是免疫治療的理想靶抗原。而且最近美國國家癌癥研究所根據療效、免疫原性等標準評估了包括WTl在內的75個腫瘤抗原，WTl排名第一，被評為免疫治療的首選靶抗原。此外，研究發現白血病細胞高表達WTl，表明基于WTl的免疫治療，有望靶向殺死腫瘤細胞，進一步證明了 WTl作為腫瘤免疫治療優越性。為今后腫瘤患者的治療和預后預測提供理論依據。
[0004]在人類抗癌歷史上，與癌癥抗爭有過三大利器:外科手術，化療，與放射治療。至此，免疫科學家斯坦曼利用先前發現的樹突狀細胞(Dendritic cell，DC)，激發自身的免疫力清除腫瘤，利用自己的研究成果，將生命由預期的數月延長到四年。由于他對免疫領域的貢獻在2011年獲得諾貝爾生理醫學獎，在腫瘤領域并開創了一個新的天地一一腫瘤免疫細胞治療。他的研究成果現在已經廣泛應用于臨床，已經成為繼手術、放、化療后的第四種癌癥治療方式。由于腫瘤免疫細胞治療能夠聯合手術、化療、放療精準清除殘余腫瘤細胞，防止復發和轉移，加強免疫監視作用，提升患者生存質量和時間，并且沒有放化療的毒副作用和手術的巨大傷害。近年來，在臨床應用中受到越來越廣泛的關注，是國內外研究的熱點，已被公認為是最具前景的腫瘤治療方法。
[0005]過繼性免疫細胞治療是指通過輸入自身或同種異體的腫瘤殺傷細胞來治療腫瘤的方法。它不僅可以糾正細胞免疫功能的低下，促進宿主抗腫瘤免疫的功能，還可以直接發揮抗腫瘤的作用。其中細胞毒性T細胞的過繼治療有著特殊的優越性。細胞毒性T細胞的過繼治療是實體腫瘤，尤其是腫瘤相關抗原比較明確的惡性黑色素瘤、結直腸癌、肝癌、前列腺癌、肺癌等的研究熱點。特異性CTLs(細胞毒性T細胞)的產生是通過將腫瘤抗原負載成熟的DC(樹突狀細胞)刺激T細胞從而獲得抗原的特異性CTLs克隆。這種CTL能識別并殺傷攜帶相應腫瘤抗原的惡性細胞，經過大量的擴增就能應用于臨床治療。這種治療方法相比其他的治療方法具有易獲得、可操作性強，靶向性好，安全性高等特點。
[0006]但是，過繼性T細胞轉移還面臨很多的問題:DC的成熟程度低，免疫耐受，特異性活化T細胞的數量不足等等。由于DC擴增具有很大的難度，所以這也間接限制了特異性活化T細胞的數量。以樹突狀細胞(Dendritic cell，DC)疫苗為代表的腫瘤免疫治療成為繼手術、化療、和放療后的第四種抗腫瘤療法，主要利用腫瘤細胞的抗原物質刺激機體產生特異性腫瘤細胞免疫殺傷，從而達到消滅腫瘤的目的。與傳統的抗腫瘤治療相比，DC疫苗介導的免疫治療具有安全性好、特異性高等諸多優點，目前已被廣泛用于治療肺癌、結腸癌、前列腺癌、乳腺癌、黑色素瘤等各類惡性腫瘤，然而其臨床療效仍有待進一步提高。樹突狀細胞(DC)作為體內功能最強的抗原遞呈細胞，是激發機體產生抗腫瘤免疫應答的首要核心環節。它能攝取抗原，并將抗原信息通過MHC-1類分子提呈給CD8+T淋巴細胞，能夠誘導特異性的細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)生成，繼而殺死腫瘤細胞，適用于多種腫瘤的免疫療法。因此，提高DC對抗原的攝取量和提呈能力是增強其臨床療效的重要策略。
[0007]納米級脂質體是由磷脂雙層殼包裹水相核心形成的球形的實體，其結構類似生物膜，是一種生物相容性好且無毒的納米材料。它可包封水溶性和脂溶性藥物，具有減少藥物劑量、緩釋、及靶向性釋放藥物等優點，因而被廣泛用于納米級抗腫瘤藥物的開發。此外，納米級脂質體也是一種優良的抗原載體，不僅能夠包裹一系列理化性質不同的抗原及免疫佐劑，保護蛋白多肽抗原不被降解，還可以促進抗原呈遞細胞對抗原的吞噬及呈遞，提高機體的特異性免疫反應。基于以上這些優點，納米級脂質體作為一種新型的疫苗載體，正逐漸用于細菌疫苗、病毒疫苗、抗寄生蟲疫苗以及抗腫瘤疫苗等研制開發。中性脂質體和表面攜帶正電荷的陽離子納米級脂質體是最常用的納米疫苗載體。其中特別值得關注的是陽離子納米級脂質體，它不但是優良的蛋白/多肽抗原載體，還是一種新型的免疫佐劑，可直接活化抗原呈遞細胞，增強疫苗誘導的免疫反應。
[0008]目前腫瘤的細胞免疫治療效果仍不理想，主要原因包括如下兩方面:I)腫瘤患存在免疫抑制的微環境，一方面，腫瘤組織的T淋巴細胞產生免疫耐受，另一方面，腫瘤細胞能夠分泌多種免疫抑制因子，誘導產生調節性T淋巴細胞或抑制DCs功能。2)腫瘤免疫治療中應用的抗原大多表達在已分化的腫瘤細胞上，而腫瘤相關并不表達這些抗原，所誘發的免疫殺傷反應并不針對腫瘤相關。加上目前常規DC加入患者腫瘤細胞裂解得到的腫瘤抗原，使DC負載腫瘤抗原，雖然這種方法能使得DC攝取到患者的腫瘤抗原，但由于腫瘤抗原的抗原性較弱，DC對腫瘤抗原攝取量較少，其遞呈抗原能力也就較低，使其產生的CTL細胞的殺傷活性不足，并且利用單純的細胞因子放大擴增CTL細胞數量有限，產生的Tcm比例小，進而影響抗腫瘤治療效果。

【發明內容】

[0009]本發明針對現有的腫瘤免疫細胞抗腫瘤療效不佳等問題，提出采用靶向樹突狀細胞上C-型凝集素受體的陽離子脂質體作為抗原載體，包裹腫瘤細胞抗原WTl，通過大大提高DC細胞對腫瘤抗原的攝取效率和抗原呈遞能力，增強其抗腫瘤作用，結合工程細胞和細胞因子大量擴增抗原特異性T細胞和Tcm，從而增強抗腫瘤免疫作用。此外，本發明以腫瘤細胞抗原WTl制備的抗原特異性CTL創新之處在于:以腫瘤細胞為治療的靶目標，能夠誘導更有效的靶向殺傷腫瘤細胞的特異性細胞毒性T淋巴細胞，直接針對腫瘤發生和復發的根源，使腫瘤治療更具有“治本”性。
[0010]為了實現上述目的，本發明所采取的技術措施為:
[0011]—種抗腫瘤相關抗原WTl特異性CTL的制備方法，包括以下步驟:
[0012]步驟一，制備包裹有腫瘤相關抗原WTl的靶向樹突狀細胞C-型凝集素受體的陽離子脂質體載體；
[0013]步驟二，利用所述步驟一得到的陽離子脂質體載體將腫瘤相關抗原WTl負載于成熟DC細胞；
[0014]步驟三，利用所述步驟二得到的成熟DC細胞誘導得到WTl特異性T淋巴細胞和中樞性記憶性T淋巴細胞。
[0015]為了進一步優化上述技術方案，本發明所采取的技術措施還包括:
[0016]進一步地，所述步驟一中具體包括以下步驟:
[0017]步驟I，提供聚乙二醇衍生化乙醇胺磷脂，將C-型凝集素類型的糖連接在聚乙二醇衍生化乙醇胺磷脂，得到C-型凝集素類型的糖修飾的聚乙二醇衍生化乙醇胺磷脂；
[0018]步驟2，將陽離子脂和步驟I中得到的C-型凝集素類型的糖修飾的聚乙二醇衍生化乙醇胺磷脂分別溶解于氯仿和甲醇的混合溶劑中，得到混合液；
[0019]步驟3，用旋轉蒸發儀將步驟2中得到的混合液旋轉蒸干，使之形成一層均勻的薄膜，真空干燥后加入含有腫瘤相關抗原WTl的PBS緩沖液或純水放置4 °C超聲水化，擠壓過膜后得到包裹有腫瘤相關抗原WTl的靶向樹突狀細胞C-型凝集素受體的陽