一種在微流控芯片中同時利用抗原抗體特異性識別和細胞尺寸差別分選腫瘤細胞的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種分選腫瘤細胞的方法，具體涉及一種在微流控芯片中同時利用抗原抗體特異性識別和細胞尺寸差別分選腫瘤細胞的方法。
【背景技術】
[0002]循環腫瘤細胞(Circulating tumor cells，CTCs)通常是指來自于原發腫瘤組織，經脫落進入人體血液循環系統的腫瘤細胞。相當多的事實表明CTCs在轉移過程中能夠在不同的組織上寄居并可以在許多轉移后的固相腫瘤上發現。鑒于實體腫瘤患者因癌癥導致死亡的原因多數是因腫瘤轉移這個事實，早期的循環腫瘤細胞診斷在人體腫瘤活組織檢查和判斷疾病進展中起著關鍵作用。人體外周血中檢測到的腫瘤細胞數量，對疾病分期、治療評估以及藥物監控等方面起著重要作用。同時，對檢測到的CTCs進行基因分子方面的研宄對于我們理解腫瘤轉移與復發也具有重要意義。然而，CTCs是很稀少的，轉移癌患者體內的每19個血液細胞中只有幾個CTC，因此對于它們的分選是一個極大的技術挑戰。
[0003]近年來，CTCs靈敏的、特異的檢測技術已經建立，它們使用不同的工作機制，例如，免疫磁性分離技術、增加細胞跟基底頻繁接觸而進行分選的微流控技術和基于不同細胞尺寸來分選CTCs的微型過濾器設備。目前，CTCs的分選機理最常用的是利用特異性抗體對其表面表達的腫瘤標記物，如上皮細胞粘附因子(epithelial cell adhes1n molecule,EpCAM)，進行特異性的抗原抗體吸附來進行分選。其次是利用CTCs與其他細胞的物理特性差異進行非特異性的分選，如細胞尺寸、密度和形變等的差異性。其中基于尺寸大小的微流控細胞分選技術是當前CTCs研宄領域的一個熱點。微流控芯片分析技術以其快速、高效、高通量、低消耗、集成化和微型化等優勢，將會更溫和、快速地操控和分選活細胞，有利于更準確高效地提取血液等體液樣品中的信息，非常適用于血細胞、腫瘤細胞等體細胞的分選。
[0004]基于尺寸大小的腫瘤細胞分選是一種快速簡便的細胞篩選技術，其分選原理是基于腫瘤細胞尺寸通常比外周血細胞(如白細胞、紅細胞和血小板等)略大這一事實。其中腫瘤細胞粒徑范圍一般在10-30 μ m，血細胞尺寸在6-16 μ m，由于它們之間存在著一個重疊的范圍，并且由于腫瘤細胞的異質性，不同的腫瘤細胞在尺寸及形變能力上都會有極大的不同，從而直接影響了單純基于細胞尺寸分選的技術在腫瘤細胞篩選上的純度。因此本發明在微流控技術和抗原抗體特異性識別的基礎上引入了一種新的更有效的同時利用細胞尺寸大小的分選技術，通過選擇性的擴大腫瘤細胞的分選尺寸，從而擴大其與血細胞尺寸差異性，提高了腫瘤細胞的篩選純度。

【發明內容】

[0005]本發明的目的在于克服現有技術存在的缺點與不足，提供一種新的在微流控芯片中同時利用抗原抗體特異性識別和細胞尺寸差別分選腫瘤細胞的方法。該方法通過抗原抗體特異性識別選擇性的擴大了腫瘤細胞的分選尺寸，對腫瘤細胞的區分、篩選效率及純度更高，并且分選出來的腫瘤細胞能夠被釋放及培養。
[0006]為了達到以上目的，本發明采用以下技術方案:
[0007]一種在微流控芯片中同時利用抗原抗體特異性識別和細胞尺寸差別分選腫瘤細胞的方法，包括如下步驟:
[0008](I)制備可進行尺寸分選的微流控芯片:該芯片主要包含一個寬度為300-800 μ m的主通道，連接在主通道一側的3-6條寬度為200-500 μ m的寬支路以及另一側的10-25條寬度為20-30 μ m的窄支路。
[0009](2)在35-100 μ m的二氧化硅微球表面包裹一層的明膠，得到具有明膠表面的二氧化硅微球(S12OGel)。
[0010](3)在S12OGel的明膠表面修飾上具有特異性免疫識別腫瘤細胞功能的抗體，得到抗體修飾的S12OGel。
[0011](4)將含有腫瘤細胞的樣品與抗體修飾的S12OGel混勻孵育(使S12OGel的抗體與腫瘤細胞表面抗原特異性結合以捕獲住腫瘤細胞)得混合樣品，再通入微流控芯片的主通道，同時從寬支路注入PBS，分別在主通道的另一側及窄支路收集捕獲住腫瘤細胞的微球與未被微球捕獲的細胞。
[0012](5)將收集的捕獲住腫瘤細胞的微球用明膠酶進行降解釋放腫瘤細胞。
[0013]步驟(I)中所述的微流控芯片優選為:高度100 μ m，主通道寬度550 μ m，4條寬度為400 μ m的寬支路，16條寬度為30 μ m的窄支路。
[0014]步驟(2)中所述的二氧化硅微球的粒徑優選為50 μ m。
[0015]步驟⑵中所述的S12OGel表面的明膠的厚度優選為10_50nm。
[0016]步驟⑵優選包括如下步驟:1)將二氧化硅微球加入到無水乙醇中，加熱升溫至50-80°C后滴入3-氨基丙基三乙氧基娃燒(3-Aminopropyltriethoxysilane, APS)磁力攪拌2 - 4 h，然后經過無水乙醇、去離子水離心洗滌后得到了氨基修飾的二氧化硅微球(NH2-S12)。2)將NH2-S1^新分散到去離子水中，加入戊二醛，攪拌5-20h，然后經過去離子水離心洗滌后得到了醛基修飾的二氧化硅微球(CHO-S12)。3)將CHO-S12再次分散到去離子水中，加入明膠，攪拌3-5h后用去離子水離心洗滌得到表面均勻包裹上一層明膠的二氧化硅微球(S12OGel)。
[0017]步驟(3)中所述的抗體優選為ant1-EpCAM。
[0018]步驟(3)優選包括如下步驟:1)將S12OGel浸泡在無水乙醇中進行消毒滅菌，再將 S12OGel 浸入(3-疏基丙基)三甲氧基娃燒(3-mercaptopropyl-trimethoxysilane, MTPMS)溶液中反應45-120分鐘，再用無水乙醇洗滌。2)將I)處理的微球浸入到4-馬來酰亞胺基丁酸-N-琥珀酰亞胺酯(GMBS)溶液中反應45-60分鐘，分別用無水乙醇、DMSO洗滌。3)將2)處理的微球浸入鏈霉親和素(SA)溶液中，4°C過夜處理，用PBS洗滌。4)對3)處理的微球進行ant1-EpCAM修飾l_3h，用PBS洗滌得到抗體修飾的S12OGel。
[0019]步驟(4)中所述的混合孵育的條件優選為通過細胞混勻儀室溫下攪拌30min，轉速設定為lOrpm。
[0020]步驟⑷混合樣品中抗體修飾的S12OGel的數量優選為1.6X 105/mL。
[0021]步驟(4)中主通道進樣口混合樣品的流速優選為70yL/h，主通道進樣口混合樣品與寬支路注入口 PBS的流速優選為比值1:4-1:10。
[0022]步驟(5)中所述的明膠酶優選為基質金屬蛋白酶9 (MMP-9)。
[0023]在步驟(4)中，含有腫瘤細胞的樣品與經抗體修飾的S12OGel混勻孵育后流經主通道，同時將PBS從寬的支路向下注入主通道中，當其與樣品接觸時，擠壓樣品從下邊窄支路流出，形成動態穩定的類層流界面。由于捕獲有腫瘤細胞的二氧化硅微球(直徑35-100 μ m)形變可忽略，且尺寸遠大于窄的支路通道，其會從樣品中分離出來進入PBS相，在右邊主通道出口處收集起來，同時未被微球捕獲的血細胞由于尺寸小于窄的支路通道，會被PBS擠壓到下邊窄的支路通道中，在下邊出口處收集起來，完成腫瘤細胞篩選純化過程。
[0024]所述的在微流控芯片中基于抗原抗體特異性識別和細胞尺寸分選腫瘤細胞的方法中，二氧化硅微球還可以替換成其他羥基微球，如聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)微球，相應的具有明膠表面的二氧化硅微球(S12OGel)、抗體修飾的S12OGel為具有明膠表面的聚甲基丙烯酸甲酯微球(PMMAOGel)、抗體修飾的PMMAOGel。
[0025]所述的在微流控芯片中同時利用抗原抗體特異性識別和細胞尺寸差別分選腫瘤細胞的方法，還包括對收集的腫瘤細胞進行鑒定的步驟。
[0026]本發明相對于現有技術具有如下優點和效果:
[0027](I)本發明用二氧化硅微球尺寸在50 μπι左右，遠大于腫瘤細胞和正常血細胞的尺寸，且形變能力差，修飾上相應的抗體后對于靶細胞的捕獲效率高，對一個微球而言只要捕獲住一個靶細胞就能達到分選目的。用二氧化硅微球捕獲腫瘤細胞，通過選擇性的擴大腫瘤細胞分選物體的尺寸，大幅擴大了其與血細胞尺寸差異性，提高了腫瘤細胞的篩選純度。
[0028](2)本發明用ant1-EpCAM修飾的S12OGel能特異性吸附靶細胞，而不吸附血細胞，從而實現了對CTCs的特異性識別和捕獲。
[0029](3)本發明是同時結合了基于細胞尺寸和抗原抗體特異性識別，區分、篩選腫瘤細胞的方法。
[0030](4)本發明在二氧化硅微球表面包裹了一層明膠，在收集到捕獲腫瘤細胞的二氧化硅微球后，通過明膠酶降解即可釋放腫瘤細胞，釋放的腫瘤細胞活性不受影響。
[0031](5)本發明所用微球能夠對腫瘤細胞進行特異性識別和捕獲，而不吸附血細胞，通過明膠酶降解釋放下來的都是腫瘤細胞，進而可以實現對腫瘤細胞的可控釋放。
[0032](6)本發明可以對釋放下來的腫瘤細胞進行再培養，腫瘤細胞傳代并未受到影響，且驗證了腫瘤細胞相對血細胞極強的無限增殖