一種特異性腫瘤抗原cea的ctl識別表位肽及其應用
【專利摘要】本發明公開了一種CEA來源的抗腫瘤CTL表位肽，為九肽，其氨基酸序列為Thr?Gly?Phe?Tyr?Thr?Leu?His?Val?Ile。本發明還包括上述肽在制備腫瘤治療性DC?CIK中的應用。本發明所制備的特異性的DC?CIK細胞對結腸癌細胞Lovo顯示出一定的殺傷率，可用于制備結腸癌等CEA陽性的相關腫瘤的特異性自體免疫細胞的制備。
【專利說明】
一種特異性腫瘤抗原CEA的CTL識別表位肽及其應用
技術領域
[0001]本發明涉及表位肽技術領域，尤其涉及一種特異性腫瘤抗原CEA的CTL識別表位肽 及其應用，還涉及一種腫瘤抗原CEA特異性DC細胞的制備方法及其應用，以及一種腫瘤抗原 CEA特異性DC-CIK細胞的制備方法及其應用。
【背景技術】
[0002] 癌胚抗原（carcino-embryonic antigen CEA)是大腸癌組織產生的一種糖蛋白， 作為抗原可引起患者的免疫反應。1965年，CEA最初發現于結腸癌和胎兒腸組織中，CEA升高 主要見于結腸癌、直腸癌、胰腺癌、胃癌、肝癌、肺癌、乳腺癌，其他惡性腫瘤也有不同程度的 陽性率。但吸煙、妊娠期和心血管疾病、糖尿病、非特異性結腸炎等疾病，15~53%的病人血 清癌胚抗原也會升高。雖然CEA不是惡性腫瘤的特異性標志，但對于腫瘤的早發現具有重要 意義。
[0003] 目前臨床上腫瘤治療方法主要包括手術，放化療等。手術和放療對局部腫瘤有較 好的療效，而對全身性、轉移性以及微小病灶的治療主要依靠化療和免疫治療。最新研究表 明，其實腫瘤在發生的早期就有部分腫瘤細胞轉移到其他組織，暫時潛伏起來，這可能是很 多腫瘤在治療后，出現復發和轉移的主要原因。因此腫瘤的治療需要作為全身性疾病進行 治療，不僅要去除局部病灶的腫瘤，還要防止腫瘤的復發、轉移及對臟器的侵襲。但是傳統 的化療藥物因其毒副作用，患者無法耐受，腫瘤患者并沒有明顯改善。其毒副作用限制其臨 床使用，因此需要更好的全身治療的手段。
[0004] 目前臨床上治療腫瘤最有效的方法應當屬腫瘤細胞免疫治療，是采集患者外周血 淋巴細胞進行體外誘導和培養，獲得足夠數量具有免疫活性的T細胞，再回輸給患者，可特 異性識別和殺傷腫瘤細前在國內胞。臨床應用的腫瘤T細胞治療技術多為(：11(((^1 〇1^116-induced killer，CIK)、DC(dendritic cells，DC) 'DC-CIK^DC-CIK表現出更好的革巴向性和 特異性，對腫瘤的治療更為有效，無毒副作用，對提高生命質量、延長生存期有顯著地效果， 是目前腫瘤全身治療的最佳手段之一，具有巨大的臨床潛力。
[0005] 然而，目前在誘導特異DC-CIK細胞的抗原仍有待改進，缺乏能夠高效刺激腫瘤特 異性DC-CIK的CTL表位多肽抗原。

【發明內容】

[0006] 基于【背景技術】存在的技術問題，本發明目的在于提供一種特異性腫瘤抗原CEA的 CTL識別表位肽。
[0007] 本發明目的還在于提供上述特異性腫瘤抗原CEA的CTL識別表位肽的應用。
[0008] 本發明目的還在于提供一種腫瘤抗原CEA特異性DC細胞的制備方法。
[0009] 本發明目的還在于提供一種腫瘤抗原CEA特異性DC-CIK細胞的制備方法。
[0010] 本發明目的還在于提供上述腫瘤抗原CEA特異性DC細胞和DC-CIK細胞的應用。
[0011] 為實現上述目的，本發明采取如下技術方案：
[0012] 本發明提出的一種特異性腫瘤抗原CEA的CTL識別表位肽，所述CTL識別表位肽為 九肽，其氨基酸序列如下:Thr-Gly-Phe-Tyr-Th;r-Leu-His-Val-Ile 〇
[0013] 上述特異性腫瘤抗原CEA的CTL識別表位肽采用固相合成法進行合成。基本流程如 下:首先將一個氨基被Fmoc基團保護的氨基酸連接在不溶性固相載體Wang樹脂上，然后脫 掉氨基的保護基，第一個氨基酸即連接至固相載體上;其次將第二個氨基被Fmoc基團保護 的氨基酸的羧基縮合劑活化，活化后的第二個氨基酸羧基再與已接在固相載體的第一個氨 基酸的氨基反應形成肽鍵，此時在固相載體上就生成了一個帶有保護基的二肽。重復上述 的肽鍵形成反應，使肽鏈從C端向N端生長，直至達到所需要的肽鏈長度，最后切割得到目的 肽，再經HPLC純化，其純度大于90 %。
[0014] 本發明還提出的上述特異性腫瘤抗原CEA的CTL識別表位肽在制備具有CEA表達的 腫瘤治療性多肽疫苗的應用。
[0015] 優選地，上述特異性腫瘤抗原CEA的CTL識別表位肽在制備結腸癌治療性多肽疫苗 中的應用，尤其對結腸癌細胞Lovo具有殺傷力。
[0016] 本發明還提出的一種腫瘤抗原CEA特異性DC細胞的制備方法，采用上述特異性腫 瘤抗原CEA的CTL識別表位肽加入DC細胞進行培養得到。
[0017] 本發明還提出的上述腫瘤抗原CEA特異性DC細胞的制備方法得到的特異性DC細胞 在制備治療CEA陽性相關腫瘤藥物中的應用。
[0018] 本發明還提出的一種腫瘤抗原CEA特異性DC-CIK細胞的制備方法，采用上述特異 性腫瘤抗原CEA的CTL識別表位肽進行誘導得到。
[0019] 本發明還提出的上述腫瘤抗原CEA特異性DC-CIK細胞的制備方法得到的特異性 DC-CIK細胞在制備治療CEA陽性相關腫瘤藥物中的應用。
[0020] 本發明巧妙利用CEA在結腸癌、肺癌等癌組織中高表達，而在正常組織中表達很 低，從而采用理論和實驗相結合的方法篩選得到腫瘤相關抗原的表位肽，所得表位肽未見 文獻報道，為研制基于抗原CEA的腫瘤疫苗或腫瘤特異性CTL細胞的制備提供理論基礎，并 為后續多價的抗原肽疫苗構建奠定基礎。
【附圖說明】
[0021] 圖1為本發明提出的一種特異性腫瘤抗原CEA的CTL識別表位肽的質譜分析圖。 [0022]圖2為本發明實施例1所得P1、P2、P3……P20各自誘導得到的特異性CTL細胞分泌 INF-γ的能力對比圖。
[0023]圖3為本發明實施例1所得?2、？3、？6116各自誘導得到的特異性(：1^細胞對結腸癌 細胞Lovo殺傷能力對比圖。
[0024]圖4為由本發明提出的一種特異性腫瘤抗原CEA的CTL識別表位肽所制備得到的特 異性CTL細胞免疫細胞群的流式細胞儀檢測數據的統計分析圖。
【具體實施方式】
[0025]下面，通過具體實施例對本發明的技術方案進行詳細說明。
[0026]實施例1:合成表位肽
[0027]采用理論與實踐相結合的方法，根據抗原的一級結構，綜合運用免疫信息學手段， 運用SYFPEITHI、B頂AS、NetCTL、WAPP和EpiJen綜合對CEA的抗原CTL表位進行預測分析，選 取評分前20的多肽序列進行試驗篩選，一次命名為PI、P2、P3……P20。
[0028]基本流程如下:首先將一個氨基被Fmoc基團保護的氨基酸連接在不溶性固相載體 Wang樹脂上，然后脫掉氨基的保護基，第一個氨基酸即連接至固相載體上;其次將第二個氨 基被Fmoc基團保護的氨基酸的羧基縮合劑活化，活化后的第二個氨基酸羧基再與已接在固 相載體的第一個氨基酸的氨基反應形成肽鍵，此時在固相載體上就生成了一個帶有保護基 的二肽。重復上述的肽鍵形成反應，使肽鏈從C端向N端生長，直至達到所需要的肽鏈長度， 最后切割得到目的表位肽粗品。將目的表位肽粗品經HPLC純化得到目的表位肽精肽，其純 度大于90%，質譜分析證實其分子量符合理論值。
[0029]本發明提出的一種特異性腫瘤抗原CEA的CTL識別表位肽采用Fmoc固相合成法進 行合成，所述CTL識別表位肽為九肽，編號為P3，其氨基酸序列如下:Thr-Gly-Phe-Tyr-Thr-Leu-His-Val-Ile。對P3進行質譜分析，其質譜分析結果如圖1所示，可以證實其分子量為 1050.2071 g/mol，符合理論值。
[0030]實施例2:多肽功能檢測
[0031]上述所得P3和其余19個表位肽，可用于制備具有CEA表達的腫瘤治療性多肽疫苗， 其應用實驗如下：
[0032] 1、上述CTL識別表位肽誘導特異性CTL細胞、IFN- 丫分泌及對腫瘤靶細胞的殺傷實 驗檢測：抽取患者的外周血經密度梯度離心分離，獲得PBMCs，添加細胞因子培養DC細胞和 CTL細胞，進一步采用DC細胞負載本發明的CEA表位肽，與CTL共培養刺激特異的CTL擴增，進 一步在體外采用ELISA和LDH實驗檢測特異的CTL在特異抗原刺激下INF- γ的分泌及對結腸 癌細胞Lovo的殺傷作用。
[0033]具體方法如下：
[0034] (I)、PBMC的分離與誘導：
[0035] 1)將50mL抗凝處理的外周血，2000rpm離心10min;
[0036] 2)收集上層血漿凍存，用PBS(pH=7.4)稀釋剩下的血細胞；
[0037] 3)將稀釋的血細胞加入到等體積的淋巴分離液液面上；
[0038] 4)2(TC離心20min，關閉離心機剎車；
[0039] 5)離心后，分為四層，用吸嘴玻璃滴管吸取白膜層(即第二層）；
[0040] 6)取出的白膜層用PBS洗滌兩遍；
[00411 7)將細胞以2~5X106/mL接種到6孔板內，2h后，回收未貼壁的細胞，用預包被 &拉卜0)3186和&拉丨-0)28186的培養板進行激活培養；
[0042] 8)貼壁的細胞加入GM-CSF和IL-4刺激培養5天誘導成DC細胞，第三天半換液；
[0043] 9)第5天，收集DC細胞，將10yg實施例1所得目的表位肽精肽加入DC細胞中，lh后， 將DC細胞與激活的T細胞共培養，同時加入IL2及IL-15;
[0044] 10)繼續培養5天后，得到抗原特異的CTL細胞進行細胞因子分泌及對腫瘤細胞的 殺傷實驗。
[0045] (11 )、IFN-γ 細胞因子分泌檢測：Human IFN-gamma Platinum ELISA( IFN-γ ELISA檢測試劑盒，eBioscience公司)檢測CTL細胞分泌的IFN-γ，步驟如下：
[0046] 1)將CTL細胞去除細胞因子培養24h后，接種到96孔板內；
[0047] 2)細胞中加入刺激對應的多肽再次刺激24h后，離心去除細胞，收集細胞上清；
[0048] 3)采用ELISA檢測上清中IFN- γ的表達，選擇IFN- γ分泌較多的CTL表位肽進行殺 傷實驗。
[0049] 結果如圖2所示，Ρ2和Ρ3、Ρ6、Ρ16負載的DC細胞均能夠較好誘導出特異性CTL細胞， 分泌較高量的IFN-γ。
[0050] (III)、腫瘤細胞殺傷實驗：采用乳酸脫氫酶（LDH)釋放檢測法，使用CytoTox 96Non_Radioactive Cytotoxicity Assay(細胞毒性檢測試劑盒，Promega公司）進行LDH試 驗檢測細胞殺傷能力。步驟如下：
[0051] 1)設立檢測培養板(100μL孔）
[0052] a.設立實驗組：以CEA陽性表達的結腸癌細胞Lovo為靶細胞，按效應細胞和靶細胞 比為5:1、10:1、20:1加入上述特性CTL細胞
[0053] b.設立效應細胞自發釋放組
[0054] c.設立靶細胞自發釋放組
[0055] d.設立靶細胞最大釋放組
[0056] e.設立背景對照組 [0057] 2)細胞裂解及收獲上清
[0058] &.37。〇5%0)2共培養511
[0059] b.靶細胞最大釋放組中加入裂解液，45min后，所有的孔，250g/min離心收集上清
[0060] 3)LDH 檢測
[0061 ] a.轉移50yL上清至另一個96孔板
[0062] b.每孔加入50yL稀釋的底物混合物，室溫避光孵育30min
[0063] c.每孔添加 50yL終止液
[0064] d.在490nm下檢測吸光值0D [0065]細胞殺傷率計算公式如下：
[0066] 殺傷率（％ ) = [ (0D孅且-0D規_6酸；輸齟-0Df_a自發稀齟)/(0D_mt稀齟-0D__發輸齟)] X100%
[0067] 結果如圖3所示，圖3為本發明實施例1所得?213、？6116各自誘導得到的特異性 CTL細胞對結腸癌細胞Lovo殺傷能力對比圖；由圖3可知，P3誘導的CTL細胞對結腸癌細胞 Lovo殺傷效果最好。
[0068] 2、采用流式分析獲得的特異CTL中各種免疫細胞所占的百分比，結果如圖4所示。 由圖4可知，本發明由P3制備獲得的免疫細胞群中含有大量的CTL細胞，同時也含有一定比 例的NKT細胞，即該免疫細胞群具有較好的免疫活性，具有強大的殺傷特定腫瘤細胞的能 力。
[0069] 以上所述，僅為本發明較佳的【具體實施方式】，但本發明的保護范圍并不局限于此， 任何熟悉本技術領域的技術人員在本發明揭露的技術范圍內，根據本發明的技術方案及其 發明構思加以等同替換或改變，都應涵蓋在本發明的保護范圍之內。
【主權項】
1. 一種特異性腫瘤抗原CEA的CTL識別表位肽，其特征在于，所述CTL識別表位肽為九 肽，其氨基酸序列為 Thr-Gly-Phe-Tyr-Thr-Leu-His-Val-I Ie 〇2. 權利要求1所述特異性腫瘤抗原CEA的CTL識別表位肽在制備具有CEA表達的腫瘤治 療性多肽疫苗的應用。3. 權利要求1所述特異性腫瘤抗原CEA的CEACTL識別表位肽在制備結腸癌治療性多肽 疫苗中的應用。4. 一種腫瘤抗原CEA特異性DC細胞的制備方法，其特征在于，采用如權利要求1所述特 異性腫瘤抗原CEA的CTL識別表位肽加入DC細胞進行培養得到。5. 根據權利要求4所述腫瘤抗原CEA特異性DC細胞的制備方法得到的特異性DC細胞在 制備治療CEA陽性相關腫瘤藥物中的應用。6. -種腫瘤抗原CEA特異性DC-CIK細胞的制備方法，其特征在于，采用如權利要求1所 述特異性腫瘤抗原CEA的CTL識別表位肽進行誘導得到。7. 根據權利要求6所述腫瘤抗原CEA特異性DC-CIK細胞的制備方法得到的特異性DC-CIK細胞在制備治療CEA陽性相關腫瘤藥物中的應用。
【文檔編號】A61K35/15GK105949303SQ201610483231
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年6月24日
【發明人】唐奇, 趙薇, 許國貞, 劉振云, 熊四平, 馮振卿, 朱進
【申請人】安徽未名細胞治療有限公司