一種酶法高效合成芐氧羰基阿斯巴甜的工藝的制作方法【
技術領域：
】[0001]本發明設及基因工程和生物催化工程研究領域，具體設及一種酶法高效合成節氧幾基阿斯己甜的工藝。【
背景技術：
】[0002]近年來蛋白酶催化合成小分子化合物越來越受到人們的關注，其可進行小膚合成、糖輛合物、水凝膠分子自組裝、轉醋反應W及手性醇動力學拆分等，在醫藥中間體、化妝品、日用品、生物材料等領域具有廣泛的應用前景。然而大多數耐有機溶劑蛋白酶的催化效率不是很高，所W，篩選出具有高催化效率的蛋白酶的對于蛋白酶在非水相或者水相催化在工業上的發展與應用具有突出的意義。[0003]阿斯己甜是由L型天冬氨酸和L型苯丙氨酸甲醋縮合而成的一種二膚甲醋化合物，是一種人工合成的甜味劑。阿斯己甜的甜味大約是庶糖的200倍，在甜味劑的添加方面具有很廣的應用范圍。Ma即usonBA等（CriticalReviewsinToxicological37(8);629-727)研究了阿斯己甜的藥理學毒性，研究表明在目前的食品添加范圍內阿斯己甜對人體是非常安全的。[0004]目前報道的阿斯己甜主要通過兩種方法來合成，化學法、酶與化學法混合。在化學法的合成中具有很大的弊端，需要對天冬氨酸的氨基和0-駿基進行保護，并且還需要對a-駿基進行活化處理，反應的過程中伴隨著少量的0位副產物W及由化學反應條件導致的少量消旋作用產生的D型副產物，由于D型阿斯己甜具有苦味，所W在后期還需要對副產物進行分離。在進行氨基酸保護和脫保護的過程中影響產物的總收率，整個過程步驟繁瑣，污水排放嚴重。[0005]采用嗜熱蛋白酶或者嗜熱蛋白酶與化學法結合的方法生產阿斯己甜，能夠利用0位未保護的節氧幾基天冬氨酸高產率的生產出不含0型副產物的a型阿斯己甜，并且沒有消旋作用產生的D型產物。由于蛋白酶具有特殊的催化位點選擇性，所W能生產出完全不含0型副產物的阿斯己甜。然而酶法該項技術也有很大的缺點，日本專利JP60118190在使用嗜熱蛋白酶合成阿斯己甜的過程中，反應體系采用雙相法高效的合成阿斯己甜前體，將反應生成的產物相轉移至有機相。該一反應工藝在底物和產物在兩相中的分配難W把握，而且轉移至有機相中的產物的后分離復雜。在合成阿斯己甜前體(節氧幾基阿斯己甜）的過程中，底物對酶的抑制性明顯，底物的濃度相對較低，合成效率較低。HiroyasuOgino等（"Enhancementoftheaspartameprecursorsyntheticactivityofanorganicsolvent-stableprotease"，ProteinEngineering,Design&Selectionvol.23no.3pp.147-152，2010)開發的耐有機溶劑蛋白酶PST-01在催化合成阿斯己甜前體時節氧幾基天冬氨酸（Cbz-Asp)的最佳濃度為30mM，苯丙氨酸甲醋（PheOMe)的最佳濃度為500mM，節氧幾基阿斯己甜（Cbz-AP^O的產率達到83%，此工藝反應體系中的節氧幾基天冬氨酸的濃度低，而且底物的摩爾比不經濟，并且在反應體系中使用了百分之五十的DMS0,產物與底物均溶于溶液中導致繁雜的后分離等步驟，該工藝的制備成本高。[0006]美國專利US2012/0295294采用耐有機溶劑蛋白酶PT121合成阿斯己甜，該專利在合成阿斯己甜的過程中使用非保護天冬氨酸，兩底物的摩爾比為1:20,但是其收率僅為30.8%，形成了底物的大量浪費，產物在有機相中分離難度大，經濟價值低。[0007]有鑒于現有工藝的不足，特提出本發明。【
發明內容】[0008]本發明的第一目的在于提供一種酶法高效率合成節氧幾基阿斯己甜的工藝，采用自行篩選開發的來自于的耐有機溶劑蛋白酶WQ9-2或其突變體催化合成節氧幾基阿斯己甜（Cbz-AP^O的反應分離禪合工藝，能夠很好地解決底物抑制性，底物的利用率及產物的后期分離等問題，合成效率高。[0009]為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：一種酶法高效率合成節氧幾基阿斯己甜的工藝，具體W耐有機溶劑蛋白酶WQ9-2或其突變體催化節氧幾基天冬氨酸和苯丙氨酸甲醋或其鹽酸鹽酶法合成節氧幾基阿斯己甜。[0010]其中，所述耐有機溶劑蛋白酶WQ9-2的突變體為氨基酸序列具有95%W上同源性的突變體，突變發生包括一個或者多個氨基酸殘基被替換或減少或增加。如WQ9-2-4F和WQ9-2-7K、WQ9-2-13D和WQ9-2-20C、WQ9-2-27H和WQ9-2-33G等。[0011]本發明所述的工藝，所述酶法合成的反應體系中抑值為4-8,優選抑值為6。[0012]其中，所述節氧幾基天冬氨酸和苯丙氨酸甲醋或其鹽酸鹽的反應摩爾比為1:10-1:1，優選1:3~1:6;所述耐有機溶劑蛋白酶WQ9-2及其突變體的用量為200-5000U/mU優選1000-2000U/mL。[0013]其中，更優選首次投料兩底物(節氧幾基天冬氨酸：苯丙氨酸甲醋）的摩爾比為1:5,后續投料摩爾比為1:1，其過量底物的循環利用可達到首次投料摩爾比為1:5的同樣的反應效率，多次循環后能夠達到實際的底物比為1:1，避免了過量苯丙氨酸甲醋鹽酸鹽(苯丙氨酸甲醋）損失。[0014]本發明所述的工藝，節氧幾基天冬氨酸（Cbz-Asp)濃度為30-200mM為宜，反應效率較高的濃度為lOOmM，苯丙氨酸甲醋鹽酸鹽（PheOMe.肥1)或苯丙氨酸甲醋（PheOMe)濃度為150-600mM，較經濟且反應效率較高的濃度為500mM。[0015]本發明所述的工藝，所述酶法合成在有機溶劑和/或水相中進行，所述有機溶劑選自己醇、DMS0、甲醇、DMF、己酸己醋或甘油中的一種，優選DMS0、己醇或者甲醇；當酶法合成在有機溶劑和水相的混合液中進行時，有機溶劑在混合液中的體積濃度（v/v)為0%-30%;優選0%-10%。[0016]本發明所述的工藝，所述酶法合成的反應溫度為20-45°C，優選30°C。[0017]本發明所述的工藝，酶法合成的反應體系中加入O-lOmM的Ca"，優選5ml的Ca"。[0018]本發明所述的工藝，產物從反應體系中直接析出；優選析出后采用抽濾的方法分離產物，并將溶于反應液中過剩的原料用于循環在母液中再添加摩爾濃度比為1:1的原料，即可實現批次節氧幾基阿斯己甜的合成。[0019]本發明所述的工藝，合成后的節氧幾基阿斯己甜采用pH9~10的水溶液溶解，然后用稀鹽酸調節體系的抑5.5~5.0,或者采用抑5.5~5.0的水溶液洗漆，進一步純化生成的產物，真空干燥即得純度為99%W上的節氧幾基阿斯己甜。[0020]本發明的有益效果在于使用來自于公cer併wWQ9-2(CCTCCNO;2010010)的耐有機溶劑蛋白酶WQ9-2或其95%同源性突變體高效催化節氧幾基保護的天冬氨酸和苯丙氨酸甲醋合成阿斯己甜前體節氧幾基保護的阿斯己甜（Cbz-APM)。并對其各個條件進行了優化，并篩選出了較適合于使用酶法生產節氧幾基阿斯己甜生產的條件。【附圖說明】[0021]圖1為耐有機洛劑蛋白酶重組體蛋白電泳圖；圖2為阿斯己甜合成反應路線示意圖；圖3為耐有機溶劑蛋白酶WQ9-2重組體或其突變體催化合成產物阿斯己甜前體節氧幾基阿斯己甜的HPLC圖譜；圖4為節氧幾基阿斯己甜（Cbz-AP^O標準品的質譜圖，由上海吉爾生化試劑有限公司提供，純度為99.8%;圖5為本發明節氧幾基阿斯己甜（Cbz-AP^O實驗產物的質譜圖。【具體實施方式】[0022]W下結合【具體實施方式】對本發明作進一步詳細說明：本發明采用化學和生物相結合的方法合成阿斯己甜，采用領域內大家公知的化學法從天冬氨酸和苯丙氨酸出發合成節氧幾基天冬氨酸和苯丙氨酸甲醋或其鹽酸鹽，在酶催化的過程中采用節氧幾基天冬氨酸和苯丙氨酸甲醋或其鹽酸鹽在有機溶劑或者非有機溶劑中酶法催化合成節氧幾基保護的阿斯己甜（Cbz-APM)，由于實現了反應分離禪合，反應效率高，過剩原料存在于溶液中可循環使用，高純度產物從體系中析出產品單一，無副產物。[0023]本發明所述的耐有機溶劑蛋白酶WQ9-2來自于公化?cere化?，并且該耐有機溶劑蛋白酶WQ9-2已經公開在同一發明人的在先授權專利(授權公告號；CN102021125B)，利用克隆表達技術，對其進行重組表達。[0024]本發明可利用公?所產耐有機溶劑蛋白酶WQ9-2、或者蛋白酶WQ9-2突變體基因的克隆表達產物，蛋白酶WQ9-2具有SEQIDNO;1所示的核巧酸序列，其氨基酸序列示于SEQIDNO;2。該耐有機溶劑蛋白酶WQ9-2基因全長1701個核巧酸，編碼567個氨基酸，其中成熟膚為317個氨基酸。該基因與公寸如嘆來源的嗜熱蛋白酶基因（Accessionnumber720316A)同源性為69.6%，其中成熟膚部分氨基酸序列同源性為72%。上述序列表見授權公告號；CN102021125B的中國專利，本發明在此不再寶述。[00巧]此外，本發明還設及到耐有機溶劑蛋白酶WQ9-2突變體的應用，利用PCR技術對耐有機溶劑蛋白酶WQ9-2的部分氨基酸進行突變，獲得具有催化活性的蛋白酶突變體，突變方法包含一個或者多個氨基酸殘基的替換、刪除和添加。根據本領域人員的公知常識可知，具有與SEQIDNO;2表示的氨基酸序列具有95%W上同源性的氨基酸序列及其突變體，應當視為與本發明保護的耐有機溶劑蛋白酶WQ9-2等同的同種功能的蛋白酶。[0026]本發明將上述突變后的蛋白酶WQ9-2進行了酶學性質的研究，發現同原有未突變的蛋白酶WQ9-2的酶學性質基本一致。檢測其催化合成節氧幾基阿斯己甜（Cbz-APM)的能力，發現突變后的耐有機溶劑蛋白酶WQ9-2在催化合成節氧幾基阿斯己甜時，在相同的條件下，依然可W達到同未突變蛋白酶WQ9-2相近的合成能力。[0027]使用本發明所述的蠟樣芽抱桿菌WQ9-2所產的耐有機溶劑蛋白酶WQ9-2及突變體，在枯草桿菌或大腸桿菌及酵母重組表達酶能高效催化合成節氧幾基阿斯己甜，降低了在生產阿斯己甜的過程中生物催化劑的成本，實現了底物與反應體系的分離，并通過母液的循環實現了底物的全利用，為酶法工業化生產阿斯己甜提供了高效的酶源，為實現綠色生產阿斯己甜提供了關鍵性的技術與催化劑。[0028]本發明使用所述的耐有機溶劑蛋白酶WQ9-2或當前第1頁1 2