醛酮還原酶及其在合成(2s,3r)-2-苯甲酰氨甲基-3-羥基丁酸酯中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物工程技術領域，尤其涉及一種醛酮還原酶突變體，生產該醛酮還 原酶突變體的基因工程菌的構建，及該醛酮還原酶突變體的生產方法及其在生物催化制備 (2S，3R) -2-苯甲酰氨甲基-3-羥基丁酸酯中的應用。
【背景技術】
[0002] 屬于酮還原酶（KRED)或羰基還原酶類的酶對于從相應的前體立體異構酮底物或 相應的外消旋醛底物中合成旋光的醇有用。典型的，KRED將酮和醛底物轉化為相應的醇產 物，但是也可催化逆反應，將醇底物氧化為相應的酮/醛產物。用如KRED的酶對酮和醛的還 原以及醇的氧化需要輔因子，最常見的為還原的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH)或還原的 煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH)，以及用于氧化反應的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD) 或煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP)。NADH和NADPH作為電子供體，而NAD和NADP作為 電子受體。經常觀察到酮還原酶和醇脫氫酶接受磷酸化的或非磷酸化的輔因子（以其氧化 的或還原的狀態）。
[0003] KRED酶可在廣泛范圍內的細菌和酵母中發現（綜述參見：Kraus和Waldman， Enzyme catalysis in organic synthesis (有機合成中的酶催化）第 1&2 卷；VCH ffeinheim 1995 ；Faber, K. , Biotransformations in organicchemistry (有機化學中的生 物轉化），第 4 版，Springs, Berlin HeidelbergNew York. 2000 ;Hunnel 和 Kula, 1989, Eur. J. Biochem. 184:1-13)。已經報道了一些KRED基因和酶序列，例如，木蘭假絲酵母、近平滑 假絲酵母、赭色擲孢酵母。
[0004] 4-乙酰氧基氮雜環丁酮（簡稱4AA)是一種重要的手性合成子，是合成碳青霉烯和 青霉烯類新型廣譜抗生素的重要中間體，如用于合成亞胺培南、法羅培南、美羅培南等。
[0005] 4AA的化學結構式如式I所示。4AA的分子骨架特征是一個四元內酰胺環，共含有 3個手性中心，存在8種立體異構體，如何高選擇性地建立手性中心，是合成4AA的關鍵所 在。日本NOyori和Takasago公司采用以乙酰乙酸乙酯為起始原料的路線，各步的收率和立 體選擇性都很好，總收率高達50%，是一條非常具有工業化前景的路線，該工藝路線如式1 所示，其中R是含有1~6個碳原子的飽和低級烷基。在該路線中，乙酰乙酸乙酯首先與鹵 化后N-羥甲基苯甲酰胺反應，生成2-苯甲酰氨甲基-3-羰基丁酸酯（式II)，然后利用手 性催化劑（R)-BINAP-Ru經過羰基不對稱還原反應，生成（2S，3R)-2-苯甲酰氨甲基-3-羥 基丁酸酯（式III)，再經過脫保護基、分子內成酰胺鍵、叔丁基二甲硅基保護、三氯化釕催 化下的乙酰氧基化得到4AA。
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[0007] 在上述路線中，最關鍵的步驟是手性催化劑（R)-BINAP-Ru不對稱催化2-苯甲酰 氨甲基-3-羰基丁酸酯（式II)生成（2S，3R)-2-苯甲酰氨甲基-3-羥基丁酸酯（式III)， 但由于該過程需要使用到貴重金屬釕作為催化劑，并且需要在高溫高壓條件下進行，對反 應器要求較高，因此造成該路線生產成本較高，限制了 4AA大規模工業化生產。
[0008] 近年來，利用生物催化進行不對稱反應的方法以其高度的化學、區域和立體選擇 性，受到了越來越廣泛的關注。采用的生物催化劑既可以是提純的酶，也可以是微生物細 胞。由于生物催化還原反應需要價格昂貴的輔酶參與，因此，通常采用具備輔酶再生系統的 微生物全細胞作為催化劑。
[0009] 美國專利文獻US4927507曾報道一種利用面包酵母還原2-苯甲酰氨甲基-3-羰 基丁酸酯的方法，得到產物的構型為（2S，3S)-2-苯甲酰氨甲基-3-羥基丁酸酯和 (2R, 3S)-2-苯甲酰氨甲基-3-羥基丁酸酯。中國專利文獻CN1940079B和CN1940080B也 曾研究利用面包酵母細胞不對稱合成制備（2S，3S)-2-苯甲酰氨甲基-3-羥基丁酸酯系列 化合物，但獲得的主要產物構型為（2S，3S)-2-苯甲酰氨甲基-3-羥基丁酸酯，占總產物的 75%以上，少部分副產物為（2R，3S)-2-苯甲酰氨甲基-3-羥基丁酸酯，再利用堿性條件下 進行C2位構型翻轉，使副產物（2R，3S)-構型轉化為（2S，3S)-構型產物，再通過化學方法 將（2S，3S)-構型產物進行C3位構型翻轉，得到（2S，3R)-2-苯甲酰氨甲基-3-羥基丁酸酯， 最后脫除3個保護基，最終得到（2S，3R)-2-苯甲酰氨甲基-3-羥基丁酸。但是上述已報道 的方法中，利用面包酵母羰基不對稱還原所得到的產物主要構型均為（2S，3S)-構型產物， 需要再經過化學方法進行構型翻轉的步驟，操作繁瑣，回收率低。

【發明內容】

[0010] 本發明提供具有還原2-苯甲酰胺基甲基-3-氧丁酸甲酯至（2S，3R) -2-苯甲 酰胺基甲基-3-羥基丁酸甲酯的能力的醛酮還原酶突變體多肽、編碼該多肽的多核苷酸 和該多肽的使用方法。化合物（2S，3R)-2-苯甲酰胺基甲基-3-羥基丁酸甲酯是合成 (2R，3R) -3- ((R) -1-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基）乙基）-4-氧氮雜環丁 -2-基乙酸酯的中 間體，而后者為用于生產不同的碳雜青霉烯類抗生素的中間體。可從（2S，3R)-2-苯甲酰胺 基甲基-3-羥基丁酸甲酯合成碳雜青霉烯類抗生素包括但不局限于亞胺培南、美洛培南、 多利培南、厄他培南、比阿培南、帕尼培南和與沙納霉素類似的其它化合物。
[0011] 本發明的第一方面提供了一種醛酮還原酶突變體，其是如下（a)、（b)或（c)的蛋 白質：
[0012] (a)由SEQ ID N0:2所示氨基酸序列組成的蛋白質。
[0013] SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列組成的蛋白質由中國專利申請201410541899. 8中 所述的核苷酸序列（參見本申請序列表SEQ ID NO: 1)編碼，具有還原酮羰基的功能，是一 種新的醛酮還原酶。
[0014] (b)在（a)的氨基酸序列中經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸殘基衍生的 具有醛酮還原酶活性的蛋白質。
[0015] 其中，所述的"幾個"是指2個至100個，更佳地小于30個，最佳地小于10個。比 如添加一個外分泌信號肽的融合蛋白。根據本發明，在如SEQ ID N0:2所示氨基酸序列的蛋 白質分子中進行1~5個氨基酸殘基的突變，仍然保持醛酮還原酶活性。也就是說，只要由 (a)衍生的蛋白質具有醛酮還原酶活性，且衍生方式如上所述，都可以達到本發明的發明目 的。
[0016] 優選地，上述衍生的醛酮還原酶突變體的氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示。
[0017] (c)與（a)的氨基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、 98%或99%同一性且具有醛酮還原酶活性的蛋白質。
[0018] SEQ ID N0:2所示的醛酮還原酶和其他已知醛酮還原酶的氨基酸序列的同一性低 于90%，具有顯著差異性，例如與嗎啡脫氫酶YtbE之間的同一性為85%。
[0019] 在本文中，氨基酸序列之間的同一性是根據序列的全長進行計算，優選采用NCBI Blastp程序進行比對，默認參數。
[0020] 本發明的第二個方面提供了一種分離的核酸，其編碼本發明的醛酮還原酶。優選 地，所述核酸是由SEQ ID NO: 1或SEQ ID N0:3所示核苷酸序列組成的。
[0021] SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列組成的核酸來源于中國專利申請 20141