一種利用果糖基轉移酶制備蔗糖-6-乙酸酯的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種蔗糖-6-乙酸酯的制備方法技術領域，特別涉及一種利用果糖基轉移酶制備蔗糖-6-乙酸酯的方法。
【背景技術】
[0002]三氯蔗糖是迄今為止人類開發的一種最完美的強力甜味劑，蔗糖-6-乙酸酯是三氯蔗糖合成的關鍵中間體。此外，蔗糖酯由于其卓越的應用性能和良好的生物降解性能及毒理學性質已被廣泛應用于食品、醫藥、化妝品和洗滌劑中，蔗糖-6-乙酸酯屬于一種重要蔗糖酯。本發明的非水相反應體系中催化合成蔗糖-6-乙酸酯，在生物工程和醫藥領域具有重要的工業應用價值。
[0003]目前，蔗糖-6-乙酸酯的合成方法包括化學法和生物酶法。化學法主要有直接酯化法和二丁基氧化錫法合成蔗糖-6-乙酸酯。Mufi等(美國專利n0.4380476)用乙酸酐在吡啶催化下將蔗糖進行6位羥基的單酯化，生成蔗糖-6-乙酸酯；王小強等(中國專利200710074157.9)將在蔗糖極性非質子溶劑中，加入乙酰化試劑乙酰腈進行酯化生成蔗糖-6-乙酸酯。這兩種直接酯化法易產生多乙酰化的蔗糖衍生物，且蔗糖-6-乙酸酯難以分離、收率較低。Navia等在US4950746中將二丁基氧化錫用于蔗糖_6_乙酸酯的制備中，該方法缺點是收率不高，含量偏低，對反應條件和分離設備要求高。
[0004]生物酶法相對于化學合成法最大優勢是其高效專一性，具有廣闊的應用前景。專利200680034904.X利用固定化Aureobasidium pullulans全細胞催化鹿糖和葡萄糖-6-乙酸酯形成蔗糖-6-乙酸酯，但轉化率較低，僅為32%;魏遠安等(中國專利201210112625.8)利用巨大芽孢桿菌固定增值細胞和固定化果糖基轉移酶催化合成蔗糖-6-乙酸酯，產率達到80 %，但操作步驟較多，需多個菌株和酶參與反應，且成本較高。
[0005]鑒于目前蔗糖-6-乙酸酯合成方法的不足，提出一種在非水相反應體系中利用米曲霉果糖基轉移酶制備蔗糖-6-乙酸酯的新方法。

【發明內容】

[0006]針對目前合成技術的不足，本發明提供一種利用米曲霉果糖基轉移酶制備蔗糖-6-乙酸酯的方法。本發明包括果糖基轉移酶制備、固定化酶技術、在非水相反應體系中催化合成蔗糖-6-乙酸酯以及蔗糖-6-乙酸酯分離純化。
[0007]一種利用果糖基轉移酶制備蔗糖-6-乙酸酯的方法，其包括如下步驟:
[0008]S1、果糖基轉移酶的制備；
[0009]S2、固定化果糖基轉移酶的制備；
[0010]S3、非水相反應體系中果糖基轉移酶催化合成蔗糖-6-乙酸酯；
[0011]S4、蔗糖-6-乙酸酯的分離純化。
[0012]在本發明所述的利用果糖基轉移酶制備蔗糖-6-乙酸酯的方法中，所述步驟SI包括如下子步驟:
[0013]SI 1、選擇菌種及培養基
[0014]其中菌株為:米曲霉Aspergillus oryzae ZZ-Ol ；
[0015]培養基的制作如下，在IL的培養基中:土豆200g，葡萄糖20g，加水lOOOmL，在加熱器上加熱至沸騰，沸騰時間為20min，并且用3層紗布過濾，濾渣棄取；在濾液中加入NaNO3為 2g，K 2ΗΡ04為 lg, KCl 為 lg, MgSO 4為 0.5g，補充水分至 100mL,將 pH 值調節至 7.0 ；28°C恒溫振蕩培養48h，其中轉速200rpm/min，獲得菌液；
[0016]S12、果糖基轉移酶制備
[0017]菌液培養48h后，將培養物在14，000rpm/min的條件下離心20min，收集上層清液；使用85%硫酸錢對收集上層清液進行分級沉淀，經14，000rpm/min離心20min后，將沉淀重懸于0.02M的磷酸鹽緩沖液，其中磷酸鹽緩沖液pH值為7.2，為下一步離子交換層析做準備;
[0018]將DEAE Sepharose Fast Flow陰離子交換柱，磷酸鹽緩沖液(pH 7.2)充分平衡后，將蛋白樣品上樣；兩倍柱體積的起始緩沖液將未吸附成分洗脫后，采用線性梯度0.01-1.0M的NaCl進行洗脫，收集活性成分；
[0019]將葡聚糖凝膠Superdex 200裝柱(L 6 X 70cm2)，(λ 02M磷酸鹽緩沖液(ρΗ7.2)充分平衡后，將離子交換層析得到的蛋白樣品上樣；上樣量為l_2mL，流速8mL/h ;收集洗脫成分進行活性測定及蛋白電泳。
[0020]SDS-PAGE凝膠電泳顯示純化后的果糖基轉移酶為單一條帶，分子量約為70KD左右，如圖1所示；
[0021]在本發明所述的利用果糖基轉移酶制備蔗糖-6-乙酸酯的方法中，所述步驟S2包括如下子步驟:
[0022]采用反相懸浮法與溶膠凝膠法結合制備磁性殼聚糖微球，并以此為載體，京尼平為交聯劑，對純化的果糖基轉移酶進行固定化。
[0023]磁性殼聚糖微球的制備:在容量為100mL三口燒瓶中，加入油相(150mL煤油+3.5g Tween 80)，開動攪拌器(攪拌速度600r/min)，緩慢加入90g磁性殼聚糖溶液(醋酸濃度為2%，殼聚糖濃度為4% ,Fe3O4含量為5% )，連續攪拌lh，形成均勻的油包水乳化液，再迅速加入凝結液(V(2mol/L NaOH): V (乙醇)=4: I)中，保持磁力攪拌30min，停止攪拌，放置過夜，備用。
[0024]京尼平交聯磁性殼聚糖微球的制備:稱取多孔磁性殼聚糖微球4g于10mL具塞錐形瓶中，加入16mL 0.6g/L京尼平水溶液，55°C交聯8h，二次蒸飽水洗凈殘余京尼平，放入4 C冰箱中冷減待用。
[0025]果糖基轉移酶的固定化:稱取京尼平交聯多孔磁性殼聚糖微球2g于10mL具塞錐形瓶中，再加入40mL 50mg/L果糖基轉移酶溶液，在25°C下靜止固定16h，以0.lmol/L硼酸緩沖溶液(pH 8.0)洗至使考馬斯亮藍溶液不變藍為止，得到的固定化酶放入4°C冰箱中冷藏待用。
[0026]在本發明所述的利用果糖基轉移酶制備蔗糖-6-乙酸酯的方法中，所述步驟S3包括:
[0027]果糖基轉移酶是一類能夠將蔗糖或多聚果糖中的果糖基轉移到不同受體底物的糖苷轉移酶。本發明以葡萄糖-6-乙酸酯和蔗糖作為反應底物，經果糖基轉移酶催化合成蔗糖-6-乙酸酯和葡萄糖，如圖2所示。
[0028]近年來，離子液體正被開成成為一種新型的非水生物催化反應的綠色介質。本發明涉及在離子液體與有機溶劑混合反應介質中，利用果糖基轉移酶催化合成蔗糖-6-乙酸酯。反應體系如下:蔗糖與葡萄糖-6-乙酸酯摩爾比4: 1，固定化果糖基轉移酶40mg/mL，反應介質離子液體[Dmim] [PF6]與叔丁醇體積比為1: l，5mM磷酸緩沖液(pH 6.0), 55 °C水浴反應20h。在該條件下，蔗糖-6-乙酸酯產量達到57.2g/L,且產率可達到86.2%，固定化酶可以反復使用4-6次。
[0029]通過LC-MS檢測酶催化反應產物蔗糖-6-乙酸酯，其中LC-MC條件為:
[0030]液相色譜條件:色譜柱UPLC HSS T3柱，其中色譜柱UPLC HSS T3柱10cmX2.1mm,1.8ym, waters ;柱溫40°C ;流動相乙腈A和0.1 %甲酸B，上樣前先用50%流動相B平衡柱子6min，上樣后再用流動相30% A和70% B洗脫，流速0.2mL/min ；
[0031]質譜條件:檢測模式為ESI+ ;噴霧電壓5kV ;錐孔電壓30V ;源溫100°C ;脫溶劑溫度300°C ;全掃描范圍m/z 50?1000。
[0032]果糖基轉移酶催化合成產物蔗糖-6-乙酸酯分析鑒定。以蔗糖和葡萄糖-6-乙酸酯為底物，果糖基轉移酶催化反應產物蔗糖-6-乙酸酯，一級與二級質譜表明蔗糖-6-乙酸酯母離子[M+Na，m/z 407]通過斷裂糖苷鍵生成質荷比(m/z)為245(葡萄糖-6-乙酰基)和185(果糖基)的特征碎片離子