一種羰基還原酶突變體及其用圖
【技術領域】
[0001] 本發明屬于基因工程和酶工程技術領域，具體內容涉及耐熱性提高的羰基還原酶 突變體及其用途。
【背景技術】
[0002] 羰基還原酶（EC1. 1. 1. 184)，是氧化還原酶家族的一員，催化依賴于輔酶NADH或 NADPH，能夠特異性催化酮（醛）、醇之間的轉化。手性醇是合成手性藥物的重要中間體，羰 基還原酶可以高效地催化潛手性酮的還原，是制備手性醇的重要方法之一。羰基還原酶在 制藥工業、精細化工產業和信息工業中的應用十分廣泛。為了進一步推動羰基還原酶在工 業中的應用范圍對其現有性能提出了更高的要求，如長時間內保持活性穩定，在極端環境 中保持高的活性（極端溫度或者pH值等）或者可以接受不同的底物（包括非天然底物）。 其中酶的熱穩定性對于工業應用來說十分重要，高溫條件下，酶的反應速度更快，能縮短反 應周期，提高時空產率，節約成本，也有利于避免反應過程中被其他微生物污染。
[0003] 隨著蛋白質工程技術和分子生物學的發展，運用定向進化和理性/半理性設計的 手段對酶分子進行人工進化和改造已成為當前酶工程領域研究的熱點。到目前為止，已有 許多學者運用這項技術成功的改造了各種各樣的酶，取得了令人矚目的進展（Zhao, 2007， BiotechnogyandBioengineering98 (2)，271-275)。其中易錯PCR(error-pronePCR)、 DNA改組（DNAshuffling)、半理性設計等已成為酶分子改造中常用的手段，大大加速了蛋 白質的進化過程（LehmannandWyss, 2001，CurrentOpinioninBiotechnology12(4)， 371-375)〇

【發明內容】

[0004] 本發明利用易錯PCR技術對來源于金黃桿菌CA49 (Chryseobacterium sp. CA49) 的羰基還原酶ChKRED20(SEQ ID NO. 2)進行分子改良，將一個或者多個氨基酸進行替換，從 而獲得熱穩定性提尚的突變體。
[0005] 所述羰基還原酶突變體是以SEQIDN0. 2為出發序列，將第100位的丙氨酸突變 為蘇氨酸、第102位的天冬氨酸突變為谷氨酸、第128位的谷氨酸突變為賴氨酸、第131位 的谷氨酸突變為甘氨酸、第154位的絲氨酸突變為脯氨酸或其任意組合得到的突變體或在 此基礎上增加中性突變位點得到的突變體。
[0006] 根據本領域公共知識，構建的能表達上述突變體的載體、基因工程菌等也屬于本 發明的保護范圍。
[0007] 為了達到以上目的，本發明以易錯PCR技術對母本羰基還原酶ChKRED20基因隨機 突變，建立突變文庫，通過高通量篩選體系篩選突變體。首輪篩選獲得5個熱穩定性提高的 突變體。以定點突變技術將其中2個多位點突變體進行單位點拆分，又獲得2個耐熱性提 高的突變體。因此，共獲得5個有益突變位點，將此5個有益突變位點的兩個或兩個以上進 行整合，獲得熱穩定性提高的組合突變體。
[0008] 本發明的具體實施方法為：
[0009] (1)隨機突變文庫的構建和篩選：我們已經公開了從金黃桿菌CA49(Chryseobacterium sp.CA49,2012年11月27日在中國典型培養物保藏中心保藏，保 藏編號為NO :CCTCC M 2012484)中克隆的編碼250個氨基酸殘基的羰基還原酶ChKRED20 的基因序列（NCBI登錄號：KC342020,基因序列見SEQ ID N0.1，氨基酸序列見SEQ ID NO. 2)。采用易錯PCR方法對其進行隨機突變，以pET 28a(+)載體連接PCR片段，電擊轉入 大腸桿菌DH10B，得到超過2 X 104個克隆的突變體庫，將突變庫克隆收集后提取質粒，轉入 大腸桿菌表達菌株BL21-DE3,挑選單克隆于96孔板中表達蛋白。而后將菌體離心，加入溶 菌酶破碎細胞，并離心，取部分上清液（粗酶液）以2-氯乙酰乙酸乙酯為底物，反應適當時 間測定酶活（對照組）。同時，另取相同體積的上清液熱處理一定時間，以相同的方法測定 殘余活性。將殘余活性高于對照的菌株轉接到新的96孔培養板中進行重復篩選。將篩選 得到的殘余活性高于對照的菌株，送上海英駿生物技術有限公司測序，獲得突變體DNA序 列信息。詳細方案見實例1。
[0010] 經上述隨機突變庫構建和篩選，獲得了 5個熱穩定性提高的突變體，分別為36F7、 123D9、22E10、122F11、32B11，其特征如下：
[0011] 36F7:第100位的丙氨酸突變為蘇氨酸（DNA序列由GCA變為ACA)。
[0012] 123D9:第102位的天冬氨酸突變為谷氨酸（DNA序列由GAT變為GAG)。
[0013] 22E10:第128位的谷氨酸突變為賴氨酸（DNA序列由GAA變為AAA)。
[0014]122F11:第131位的谷氨酸突變為甘氨酸（DNA序列由GAA變為GGA)、第137位的 纈氨酸突變為異亮氨酸（DNA序列由GTT變為ATT)。
[0015] 32B11:第71位的谷氨酸突變為天冬氨酸（DNA序列由GAA變為GAT)、第110位的 賴氨酸突變為精氨酸（DNA序列由AAA變為AGA)、第154位的絲氨酸突變為脯氨酸（DNA序 列由TCA變為CCA)。
[0016] (2)將上述2個多位點突變子拆分為單一位點突變子：
[0017] 通過定點突變將突變子122F1U32B11所包含的多位點氨基酸殘基進行拆分，構 建得到單點突變子E131G、V137I、E71D、K110R、S154P，其特征如下：
[0018]E131G:第131位的谷氨酸突變為甘氨酸（DNA序列由GAA變為GGA)。
[0019]V137I:第137位的纈氨酸突變為異亮氨酸（DNA序列由GTT變為ATT)。
[0020] E71D:第71位的谷氨酸突變為天冬氨酸（DNA序列由GAA變為GAT)。
[0021 ]K110R:第110位的賴氨酸突變為精氨酸（DNA序列由AAA變為AGA)。
[0022] S154P:第154位的絲氨酸突變為脯氨酸（DNA序列由TCA變為CCA)。
[0023] 其中，E131G和S154P為耐熱性提高的突變位點，V137I、E71D、K110R為中性突變 位點。
[0024] (3) 5個位點的整合：
[0025] 通過上述（1)和⑵突變篩選，獲得5個有益突變位點，即36F7、123D9、22E10、 E131G和S154P，進一步通過定點突變構建位點組合突變體。優選構建以下組合突變體： MC35、MC23、MC235、MC135、MC134,其特征如下：
[0026]MC35:第128位的谷氨酸突變為賴氨酸（DNA序列由GAA變為AAA)、第154位的絲 氨酸突變為脯氨酸（DNA序列由TCA變為CCA)。
[0027]MC23:第102位的天冬氨酸突變為谷氨酸（DNA序列由GAT變為GAG)、第128位的 谷氨酸突變為賴氨酸（DNA序列由GAA變為AAA)。
[0028]MC235:第102位的天冬氨酸突變為谷氨酸（DNA序列由GAT變為GAG)、第128位 的谷氨酸突變為賴氨酸（DNA序列由GAA變為AAA)、第154位的絲氨酸突變為脯氨酸（DNA 序列由TCA變為CCA)。
[0029]MC135:第100位的丙氨酸突變為蘇氨酸（DNA序列由GCA變為ACA)、第128位的 谷氨酸突變為賴氨酸（DNA序列由GAA變為AAA)、第154位的絲氨酸突變為脯氨酸（DNA序 列由TCA變為CCA)。
[0030]MC1345:第100位的丙氨酸突變為蘇氨酸（DNA序列由GCA變為ACA)、第128位的 谷氨酸突變為賴氨酸（DNA序列由GAA變為AAA)、第131位的谷氨酸突變為甘氨酸（DNA序 列由GAA變為GGA)、第154位的絲氨酸突變為脯氨酸（DNA序列由TCA變為CCA)。
[0031] 這些組合突變體MC35、MC23、MC235、MC135和MC1345熱穩定性與母本相比均有 不同程度提高。MC135穩定性提升幅度最大，反應活性卻未受影響，最適反應溫度升高至 65°C，而且在65°C非常穩定，連續處理15天后殘余活性大于95%，而野生型在此條件下的 熱失活半衰期僅為12min。
[0032]以組合突變子M135為生物催化劑，轉化底物4-氯乙酰乙酸乙酯，反應溫度65°C， 時空產率比母本有很大程度的提高，3g/L的粗酶液可在lh內完全轉化300g/L底物生成 (S)-CHBE，ee值 >99%。
[0033] 本發明有益效果：上述所有耐熱性提高的突變子與母本相比，酶的反應速度更快， 能縮短反應周期，催化底物的時空效率均有提高，其中突變子M135轉化底物4-氯乙酰乙酸 乙酯的時空效率高達333gAL.h)，具有良好的工業應用前景。
【附圖說明】
[0034]圖1為5個熱穩定性提高的單點突變體與組合突變體殘余活力與母本的比較，酶 的熱穩定性于70°C溫度下處理3小時。
[0035] 圖2為母本ChKRED20與突變體MC135的最適反應溫度測定圖，母本ChKRED20的 最適反應溫度測定曲線用〇表示，突變體MC135的最適反應溫度測定曲線用魯表示。
[0036] 圖3為母本ChKRED20與組合突變體的t1/2測定圖，在65°C所測的母本ChKRED20 熱失活半衰期用?表示；在65°C所測的突變體MC235熱失活半衰期用?表示；在65°C所測 的突變體MC1345熱失活半衰期用▲表示；在65°C所測的突變體MC135熱失活半衰期用魯 表示；在80°C所測的突變體MC135熱失活半衰期用〇表示。
[0037] 圖4為母本ChKRED20與突變體MC135在65°C條件下轉化底物4-氯乙酰乙酸乙酯 的時間曲線，母本ChKRED20和突變體MC135的反應時間曲線分別用虛線和實線表示，底物 濃度是l〇〇g/L(〇），150g/L( ? )，200g/L( ? )，and 300g/L( &□ )〇
[0038] 具體實施方法
[0039] 以下結合實施實例對本發明做進一步說明，需要指出的是，本實施例僅用于解釋 本發明，而非對本發明范圍的限制。
[0040] 實施例1易錯PCR(error-pronePCR)