一種高純度胰蛋白酶的制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物化學藥物制藥技術領域，具體涉及一種高純度胰蛋白酶的制備方法。
【背景技術】
[0002]胰蛋白酶是動物胰臟所分泌的一種重要的蛋白水解酶，能水解蛋白質為多肽或氨基酸。對精氨酸和賴氨酸的肽鏈具有選擇性的水解作用，為一肽鏈內切酶。胰蛋白酶能對膿及壞死組織起消化作用，從而使正常組織分泌血清去除異物，助長新生肉芽之生長。其應用范圍廣闊，包括:1、各種潰瘍和發炎壞疽，創傷性損傷等所產生的局部水腫、血腫、膿腫等；2、支氣管炎、支氣管氣喘、干咳等(能使分泌物稀薄便于咳出)；3、各種蛇咬傷等。
[0003]現有技術胰蛋白酶制備長期以來一直采用多重鹽析、結晶結合透析的工藝，該工藝純化能力較弱，耗時較長，且成品效價較低。如“一種分離純化胰蛋白酶的方法” CN201210598017.2采用投料、鹽溶、鹽析、洗鎂、活化、除鈣、結晶、透析和凍干等多個步驟，耗時至少12天，且成品效價較低，約為2600U/mg。
[0004]另外，鑒于胰蛋白酶起始物料胰蛋白酶原來自動物臟器，難免存在生物感染病源，會對最終產品的臨床使用安全性構成威脅。因此，很有必要研發一種能夠克服現有技術缺陷的胰蛋白酶制備工藝。

【發明內容】

[0005]本發明所要解決的問題是克服胰蛋白酶現有工藝的純化能力較弱、耗時較長、成品效價較低等技術缺陷，并提供一種高純度胰蛋白酶的制備方法。本發明的制備方法采用疏水層析純化胰蛋白酶原，酶原激活后，親和層析純化胰蛋白酶，工藝較為簡便，得到高純度、高效價的胰蛋白酶；并且在優選技術方案中，同時在生產制備過程中增加了病毒滅活/去除步驟，進一步提高了產品的質量。另外，在本發明的優選技術方案中，以提取過糜蛋白酶的牛胰濾液經鹽析所得的胰蛋白粗品為原料，粗品富含硫酸銨，先采用疏水層析不僅能除鹽，亦可純化胰蛋白酶原，再進行酶原激活和親和層析純化，這在一定程度上保證了胰蛋白酶的穩定及高效價。此外，發明人研宄發現，在此親和層析純化條件下，牛源糜蛋白酶雖為絲氨酸蛋白酶，但不能結合于苯甲脒-瓊脂糖凝膠(專一結合絲氨酸蛋白酶、胰蛋白酶和類胰蛋白酶)，確保了胰蛋白酶成品中糜蛋白酶含量合格，遠遠低于《中國藥典》2010年版“胰蛋白酶”質量標準規定的“每2500單位胰蛋白酶中不得多于50單位的糜蛋白酶”。
[0006]本發明是通過以下技術方案來實現的:
[0007]本發明涉及一種高純度胰蛋白酶的制備方法，其特征在于，該方法包括以下步驟:
[0008](I)粗品溶解:將胰蛋白酶粗品用pH為2.0?4.0的水溶液溶解得到胰蛋白酶粗品溶解液；
[0009](2)低pH孵放法滅活病毒:酸調節胰蛋白酶粗品溶解液至pH值為2.0?4.0，20?25°C放置I?3h ;
[0010](3)疏水層析純化:將疏水層析填料裝柱，用pH為7.0?8.0的50mmol/LNa2HPO4-NaH2PO4, lmol/L (NH4) 2S0jl沖液作為平衡液進行平衡，平衡后取步驟(2)中滅活病毒的胰蛋白酶粗品溶解液上樣，上樣完畢，用上述平衡液沖柱，直至流穿峰A28tol下至基線，然后用pH為7.0?8.0的50mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4溶液洗脫，收集洗脫峰；
[0011](4)酶原活化:在步驟⑶中收集的洗脫峰中，加入CaCl2溶液，使其終濃度為20?100mmol/L，調節pH值至7.3?7.6，加入胰蛋白酶，于O?10°C活化，得活化液；所述的胰蛋白酶與步驟⑴中的胰蛋白酶粗品的質量比為(0.5?I):100 ；
[0012](5)親和層析純化:將親和層析填料裝柱，用pH為7.3?7.6的50mmol/LTris-HClU50mmol/L NaCl緩沖液作為平衡液進行平衡，平衡后取活化液上樣，上樣完畢，用上述平衡液沖柱，直至流穿峰A28tlnm下至基線，然后用經鹽酸調節500mmol/L NaCl至pH為2.0?3.0的溶液洗脫，收集洗脫峰；
[0013](6)洗脫液除鹽:采用透析除鹽或超濾除鹽，再調節除鹽完畢的洗脫液pH值至
5.5?6.5，濾紙過濾，得濾液；
[0014](7)膜過濾去除病毒；
[0015](8)真空冷凍干燥，即得所述的高純度胰蛋白酶。
[0016]其中，所述的胰蛋白酶粗品可為本領域常規使用的胰蛋白酶粗品，一般是由提取過糜蛋白酶的牛胰濾液經鹽析得到，其操作步驟如專利CN201210598004.5中記載，本發明中較佳地購于集寧區牛羊臟器加工部。
[0017]其中，步驟⑴中，所述的pH為2.0?4.0的水溶液與所述的胰蛋白酶粗品的體積質量比較佳地為4?6ml/g。
[0018]步驟(I)中，所述的pH為2.0?4.0的水溶液較佳地為是由5mol/L HCl進行調節的溶液。
[0019]步驟(2)中，所述的酸較佳地為鹽酸，更佳地為5mol/L HCl水溶液。
[0020]步驟(3)中，在上樣前較佳地還進行前處理，所述的前處理方法為:5mol/L NaOH溶液調節滅活病毒的胰蛋白酶粗品溶解液PH值至7.0?8.0，O?10°C、3000?4000rpm的條件下離心15?20min，取上清液，即可。
[0021]步驟(3)中，所述的疏水層析填料可為本領域常規使用的疏水層析填料，本發明優選苯基-瓊脂糖凝膠，購于GE Healthcare公司。
[0022]步驟⑷中，步驟(3)中收集的洗脫峰中的緩沖液是50mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4,CaCl2會與磷酸鹽產生沉淀，所以CaCl 2終濃度為20?100mmol/L，是已除去與磷酸鹽產生沉淀的量；活化所用的胰蛋白酶符合《中國藥典》2010年版(二部)第847頁“胰蛋白酶”質量標準。
[0023]本發明中，步驟(3)和步驟(5)中的A28tol是指280nm波長處的吸光度。
[0024]步驟⑷中，所述的調節pH值優選采用5mol/L NaOH溶液或5mol/L HCl溶液進行調節。
[0025]步驟(5)中，所述的親和層析填料可為本領域常規使用的親和層析填料，本發明優選苯甲脒-瓊脂糖凝膠(購于GE Healthcare公司)。步驟(5)中，上樣前，活化液較佳地還進行前處理:0?10°C、3000?4000rpm的條件下離心15?20min，取上清液，經0.45 μ m囊式過濾器過濾，即可。
[0026]步驟￠)中，透析除鹽是指將洗脫液裝透析袋透析；超濾除鹽是指采用超濾膜對洗脫液進行除鹽和濃縮；透析除鹽和超濾除鹽，一般兩者只選其一進行洗脫液的除鹽。所述的透析除鹽較佳地為將洗脫液分兩步透析，①O?10°C，pH為2.0?4.0水溶液中透析除鹽1h?24h ;(D O?10°C純水中透析2h?6h ;透析袋的截留分子量為lOKDa。所述的超濾除鹽中，優選超濾膜的截留分子量為lOKDa，超濾濃縮后的體積為原洗脫液體積的1/8?1/5。
[0027]步驟￠)中，所述的濾紙過濾較佳地為采用三層濾紙過濾。
[0028]步驟(7)中，所述膜過濾去除病毒較佳地為將濾液經Sartorius Stedim(德國賽多利斯集團)的(0.45+0.2 μπι)-(0.2+0.1 μ m)-Virosart CPV病毒過濾器三聯膜、2Bar壓力下壓濾。
[0029]在符合本領域常識的基礎上，上述各優選條件，可任意組合，即得本發明各較佳實例。
[0030]本發明所用試劑和原料均市售可得。
[0031]本發明的積極進步效果在于:與現有一般工藝相比，本發明建立起一套新的高純度胰蛋白酶的制備方法，體現出柱層析純化胰蛋白酶原和胰蛋白酶的優越性，有利于工藝的簡化和質量的提高:(I)工藝耗時短，提高了生產效率；(2)優選技術方案中增加病毒滅活/去除步驟，提高了產品的質量；(3)得到高純度、高效價的胰蛋白酶成品(大于3700U/mg)，且成品中糜蛋白酶含量低，提高了產品的市場競爭力；(4)在本發明的親和層析純化條件下，牛源糜蛋白酶雖為絲氨酸蛋白酶，但不能結合于苯甲脒-瓊脂糖凝膠(專一結合絲氨酸蛋白酶、胰蛋白酶和類胰蛋白酶)，確保了胰蛋白酶成品中糜蛋白酶含量合格，遠遠低于《中國藥典》2010年版“胰蛋白酶”質量標準規定的“每2500單位胰蛋白酶中不得多于50單位的糜蛋白酶”。
【具體實施方式】
[0032]下面通過實施例的方式進一步說明本發明，但并不因此將本發明限制在所述的實施例范圍之中。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，按照常規方法和條件，或按照商品說明書選擇。
[0033]下述實施例中采用的胰蛋白酶粗品購自集寧區牛羊臟器加工部；是由提取過糜蛋白酶的牛胰濾液經鹽析得到，其操作步驟如專利CN201210598004.5中記載。
[0034]實施例1
[0035](I)粗品溶解:把胰蛋白酶粗品1.2kg，加6000mL pH2.8水溶液攪拌溶解；
[0036](2)低pH孵放法滅活病毒:加入5mol/L HCl 14mL，調節胰蛋白酶粗品溶解液pH為 ρΗ3.1,20 ~ 25°C放置 Ih ；
[0037](3)疏水層析純化:將疏水層析填料苯基-瓊脂糖凝膠(購于GE Healthcare公司)裝柱 20 X 16cm，用 pH7.050mmol/L Na2